材料和试剂

℃。线虫文化

铝箔
高压灭菌带（Fisher Scientific，目录号：15904）
90 x 15毫米一次性塑料培养皿（中国生物技术公司）
14ml聚丙烯圆底管（Corning，Falcon ®，目录号：352059）
15ml离心管（Corning，目录号：430791）
50ml离心管（Corning，目录号：430829）
250ml Nalgene TM PPCO离心机瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：3120-0250）
微量离心管（Corning，Axygen ®，目录号：MCT-150-C）
玻璃幻灯片
0.3毫米直径的铂/铱丝（Shineteh Instruments）
0.22μm孔径注射器过滤器单元（EMD Millipore，目录号：SLGP033RB）
℃。线虫 N2（野生型菌株）
℃。线虫 control-RNAi（Mock）和G6PD-RNAi（Gi）成虫和胚胎
电子。大肠杆菌OP50（明尼苏达大学，秀丽隐杆线虫遗传学中心）
电子。大肠杆菌携带对照RNAi（Mock）和G6PD-RNAi（Gi）质粒的HT115（DE3）
注意：这些质粒的细节，包括设计和构造，都在之前的报告（Yang et al。，2013）中有所描述。
Ultrawater
漂白剂（NaOCl）（Clorox）
氢氧化钠（NaOH）（Merck，目录号：1064980500）
M9缓冲区
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31434-5KG-R）
琼脂（BioShop，目录号：AGR001.1）
蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0037）
磷酸氢二钾（K 2）HPO 4（Merck，目录号：1051041000）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：3246-05）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667-5G）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：32221-2.5L）
注意：本产品已停产。
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M2643-500G）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3881-500G）
盐酸四环素（Boehringer Mannheim）
碳青霉素二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：C1389-5G）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518-25G）
异丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（BioShop，目录号：IPT001.50）
LB肉汤（BD，Difco TM ，目录号：244610）
线虫生长培养基（NGM）（见食谱）
1 M KPI缓冲液pH 6.0（参见食谱）
5 mg / ml胆固醇（参见食谱）
1 M MgSO 4（参见食谱）
1 M CaCl 2 （见配方）
10mg / ml盐酸四环素（见食谱）
25mg / ml羧苄青霉素（参见食谱）
200μg/ ml氨苄青霉素（参见食谱）
1 M IPTG（见配方）

℃。线虫样品制备
1. Falcon细胞过滤器盖（12 x 75 mm）（Corning，Falcon ®，目录号：352235）
2. 派雷克斯玻璃管（20 x 125 mm）（Corning，PYREX ®，目录号：9826-20）
3. 玻璃巴斯德移液器（Kimble Chase Life Science，目录号：63A54）
4. 玻璃有机溶剂移液器吸头（HBG，目录号：1010-19）
5. 有机耐溶剂聚丙烯头（Gilson，目录号：F161110）
6. 有机耐溶剂聚丙烯微量离心管（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：S1615-5500）
7. HPLC小瓶（WATERS，目录号：186000272C）
8. 氯仿（LC级）（默克，目录号：1024444000）
9. 甲醇（HPLC级）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：9093）
10. Chromasolv级水（H 2 O 2）（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：39253-1L-R）
11. Chromasolv级乙腈（ACN）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：9829-03）
12. Chromasolv级异丙醇（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：34965-2.5L）
13. 甲酸铵（Fluka，目录号：70221）
14. 甲酸（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：56302）

设备

Pyrex窄口锥形瓶（Corning，PYREX ®，目录号：4980-1L）
Lamina流罩（Chin-Chih H＆amp; W ENTERPRISE，目录号：BSC-4）
20℃培养箱（Firstek，目录号：RI-560）
37℃培养箱与摇床（Yihder，目录号：LM-570RD）
离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti ® J-26XP）
转子（Beckman Coulter，型号：JA-14）
立体显微镜（Nikon Instruments，型号：SMZ745）
不锈钢手术刀（10号）和保持架（日本羽毛安全剃刀）
Vorterxer（科学工业，型号：Vortex-Genie 2）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
具有四个250毫升桶的大容量摆动转子转子（Eppendorf型号：A-4-62）
-80°C冰柜
100毫升玻璃烧杯（康宁，PYREX ®，目录号：1000-100）
Macropipette（Socorex，目录号：835.05）
超声波仪（Sonics＆amp; Materials，型号：VCX 400）
超声波清洗机（Delta，型号：DC200H）
用于铝块浴蒸发头的氮气喷射单元（TAITEC，型号：DTU-2B）
离心机（Eppendorf，型号：5427 R）
Acquity CSH C18柱（粒径为1.7μm，2.1×100mm）（WATERS，目录号：186002352）
超高效液相色谱（UPLC）系统（WATERS，目录号：176001285,700003616,700002764）
SYNAPT G1 HDMS系统（WATERS）
高压灭菌器（Tomin Medical Equipment，目录号：TM-328）
4°C冷却柜（Firstek，目录号：CC-2）

软件

MassLynx4.1（WATERS）
扩展统计（EZinfo，WATERS）
MetaboAnalyst（ http://www.metaboanalyst.ca ）

程序

℃。线虫媒体准备

在1升烧瓶中准备NGM培养基（参见食谱）（见注1）
用两层铝箔覆盖并密封烧瓶的开口，使用短拉伸（2厘米）的高压胶带标记在铝箔的顶部。
高压灭菌NGM培养基，MgSO 4，CaCl 2和KPI溶液（参见食谱）（见注2）。
将培养基冷却至〜65℃，加入MgSO 4，CaCl 2，KPI，胆固醇（参见附录3）（见附注3）。
对于常规的NGM琼脂平板：将20ml培养基倒入每个90mm培养皿中
对于RNAi NGM琼脂平板：将20ml培养基（补充有羧苄青霉素，四环素和IPTG [（参见食谱）]倒入每个90mm培养皿中。
允许琼脂板在室温下在层流罩中固化并干燥过夜（见注4）
将一个单一的OP50或HT115细菌菌落（DE3）接种到1 ml的LB（对于HT115（DE3）：200μg/ ml氨苄青霉素补充）（见配方），在灭菌的聚丙烯圆底管中生长6小时37℃振荡（200rpm）
将1ml细菌培养物接种到1L烧瓶中的300ml高压灭菌的LB中，并在37℃振荡（200rpm）下生长16小时。
通过离心（4,000 xg，20分钟，4℃）（Beckman Coulter，Avanti J-26 XP）将250ml离心瓶（Nalgene）中的过夜培养物收获，弃去上清液。 >
用新鲜的LB将沉淀重新悬浮至最终体积= 7.5ml（参见注5）。
将每个常规的NGM琼脂平板与300μl浓缩E.大肠杆菌 OP50培养，用无菌不锈钢撒布机涂抹（见附注6）
每个RNAi NGM琼脂平板上加入300μl浓缩的E。大肠杆菌 HT115（DE3）培养物，补充200μg/ ml氨苄青霉素并用灭菌的不锈钢扩张器铺展。
允许细菌播种板在室温下在层流罩中干燥过夜（见注7）

℃。线虫文化

使用灭菌的手术刀片（穿过燃烧器的火焰）从含有幼虫蠕虫的OP50种子-MEMM琼脂平板上切下一小块琼脂（分块），并将大块琼脂转移到新鲜的OP50种子-NGM琼脂平板上8）
在20°C传播蠕虫，直到获得足够的妊娠后代成虫。
通过用高压灭菌的超声波清洗板收获妊娠成虫，并收集到15ml离心管中（见注9）。
让蠕虫沉淀，然后抽出去除上清液。
通过加入3.5ml高压灭菌的超声波清洗沉淀物，进行次氯酸盐漂白剂
加入0.5毫升5N NaOH
加入1ml 5％NaOCl（漂白剂），管中总体积为5ml
短暂旋转管，在室温下放置不到5分钟，每隔几分钟旋转5秒，直到大部分（80％）的蠕虫溶解（在解剖显微镜下观察）。
立即加入8毫升高压灭菌的超声波器，并将管子倒置5次，彻底混匀
离心在1,258 x g（Eppendorf，5810 R）1分钟，弃去上清液。
用10ml高压灭菌的超声波清洗沉淀物并将管反转5次。
再次以1,258×g离心1分钟（Eppendorf，5810R），弃去上清液，并用2ml M9缓冲液重新悬浮沉淀（鸡蛋）。
将蛋悬浮液在20℃下振荡孵育过夜（50rpm）以获得同步的L1蠕虫
等分试样L1蠕虫转入RNAi NGM琼脂平板（见附注10）
将板在20℃下孵育3天以获得Mock和G6PD敲低（Gi）成虫（图1A）。

图1.样品制备程序的代表性图像A.在同步L1下在20℃下在细菌种子NGM板上生长3天的蠕虫。 B.从5个NGM板在15ml管（作为颗粒）中收获的洗涤的蛋; C. Falcon细胞过滤器盖过滤的鸡蛋;将洗涤的卵转移到微量离心管中; E.超声处理后，蛋中悬浮蛋（见步骤D2）; F.在玻璃管中加入裂解液中的溶液; G.涡旋和超声处理II后形成初始相分离（见步骤D7）; H.离心后增强相分离。

℃。线虫样品制备
1. C的四个生物重复。益生菌（见附注11）通过超声波从NGM板洗掉（见附注12）。将15 ml离心管放在冰桶上（见注13）
2. 让蠕虫沉淀并除去上清液。加入10毫升超级洗涤蠕虫。重复此步骤以完全清除悬浮液中的浮游细菌和蛋。
3. 执行上一节所述的次氯酸盐漂白剂（步骤B5-B11）（见附注14）。
4. 将管以1,258×g离心1分钟（Eppendorf，5810R），弃去上清液（图1B）。
5. 加入1毫升超级蛋鸡悬挂鸡蛋并将管保持在冰上。
6. 为了过滤蛋，将超过0.1毫升的超细粉末加入Falcon细胞过滤器顶部以平衡膜。
7. 一旦水从膜上洗脱出来，将蛋悬浮液转移到Falcon细胞过滤器盖的顶部，并允许通过重力洗脱（图1C）。
8. 加入1毫升超级清洗膜。
9. 在4℃下离心管（1,258×g）5分钟（Eppendorf，5810R）。丢弃上清液和盖子。
10. 向管中加入1毫升超滤，并将悬浮液转移到微量离心管中
11. 再加入0.1毫升的超声波清洗管，并将所有悬浮液一起放入微量离心管中
12. 在4℃下将离心管以1,258×g离心5分钟（Eppendorf，5810R）。
13. 仔细吸取上清液（图1D）
14. 将丸粒储存在-80°C冰箱中直至使用（见附注15）
脂质提取
1. 将沉淀物在冰上解冻，并用0.5毫升超滤剂重新悬浮
2. 将样品（管）放置在装满冰的100ml玻璃烧杯中进行超声处理。
3. 超声处理周期设置为2秒脉冲（频率：20kHz;幅度：10％）和5秒间隔，20个周期，共40秒（超声处理I，图1E）。
4. 将上清液转移到带螺帽的玻璃管上
5. 通过向每个玻璃管中加入1ml超滤器，然后向每个玻璃管中加入6ml氯仿/甲醇（比例= 2:1）混合物进行抽提（参见附注16）。
6. 涡旋每个玻璃管30秒，重复4次（见附注17）（图1F）
7. 将玻璃管放置在预先充满冰和水的超声波清洗机中的试管架上，超声波样品15分钟（频率：40 kHz）（见附注18）（Sonicate II，图1G）
8. 将管以1,258×g离心15分钟（Eppendorf，5810R）以进一步增强相分离（图1H）。
9. 通过玻璃巴斯德吸管将较低级分（疏水性）转移到干净的玻璃管（见注19和20）。
10. 在氮气蒸发器中在氮气流下干燥下部馏分（见注21）
11. 将干燥的颗粒储存在-80°C冰箱中直到使用。
脂质体分析（见附注22）（脂质体数据分析的步骤总结在图2中）

图2.脂质体数据分析中的步骤摘要。介绍了通过串联MS从样品分离到代谢物的流程图。
1. 向低级馏分中加入1,000μl溶剂（异丙醇/乙腈/水，2/1/1，v / v / v）涡旋玻璃管30秒，重复4次。通过使用有机耐溶剂尖端将上清转移到新的微量离心管（有机溶剂耐受性），并在4℃下以15,294×g离心15分钟（Eppendorf，5427R）。将800μl上清液转移到HPLC样品瓶中进行UPLC-qTOF / MS分析。
2. 每个样品通过三次技术重复进行脂质分析。
3. 制备补充有10mM甲酸铵和0.1％甲酸的流动相A（水：乙腈[60:40]）。
4. 用10mM甲酸铵和0.1％甲酸制备流动相B（异丙醇：乙腈[90:10]）。
5. 使用Acquity CSH C18色谱柱注射样品并进行分离
6. 柱温保持在55℃，流速设定为0.4ml / min。
7. 溶剂梯度如下：0-2分钟，40-43％溶剂B; 2-2.1分钟，43-50％溶剂B; 2.1-12分钟，50-54％溶剂B; 12-12.1分钟，54-70％溶剂B; 12.1-18分钟，70-99％溶剂B; 18-20分钟，99-40％溶剂B.
8. 注射体积为1.5μl样品用于电喷雾电离（ESI）阳性（+）模式，3μl样品用于ESI阴性（ - ）模式（见注23）。
9. 使用SYNAPT G1 HDMS系统在ESI +和ESI-模式下进行质谱分析。主要参数设置如下：毛细管和锥体电压分别设置为3000 V（ESI模式下为2,000 V）和30 V。去溶剂化气体流量设定为800L / h。去溶剂和来源温度分别为400和100°C
10. 色谱图以20-990 Da的m / z / m范围以每秒10次扫描的速率获取（见注释24）（图3）。
  
  图3. Mock和Gi胚胎的基本峰强度（BPI）色谱图。：一种。 ESI阳性模式; B. ESI负模式。 y轴表示相对强度。空白（溶剂控制，红线）显示为基线。
11. 原始数据以质心模式获得。
12. LockSpray的频率设置为每次扫描0.5秒，并通过平均超过10次扫描进行校正。
13. 用于水/乙腈= 50/50 + 0.1％甲酸的亮氨酸脑炎（ESI +和m / z 554.2615的m / z 556.2771）用作LockSpray lockmass，用于精确质量测量精度。

数据分析

使用MassLynx4.1（WATERS）中的分子特征提取功能从原始数据中提取信息，包括时间对齐离子特征，单同位素中性质量，保留时间以及离子信号强度（见注25）。 />
提取的数据由扩展统计（EZinfo，WATERS）进一步处理，以产生无监督主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型（见附注26）（图4）。 />

图4. ESI阳性模式中Mock和Gi胚胎的主成分分析（PCA）图
从这些模型中，获得每个变量的投影（VIP）分数的变量重要性，以表示其对分组的贡献（见注27）。
最初针对人类代谢组数据库（HMDB）搜索高级VIP成绩候选人（ http：//www.hmdb .ca ）和METLIN（ http：//metlin.scripps。 edu / index.php ）（见注28）。
通过使用SYNAPT G1 HDMS系统（WATERS）的串联质谱（MS / MS）（见注29）选择和验证具有高强度（相对丰度高于200）的目标候选物。
MS / MS谱由METLIN获得并确认（ http：//metlin.scripps .edu / index.php ）和LIPID MAPS（ http：// www。 lipidmaps.org/ ）以及我们内部的脂质标准数据库。

笔记

我们在1升烧瓶中准备500毫升NGM培养基。如果需要更少量的NGM介质，则可以相应地改变烧瓶的尺寸。确保不要将介质填充到烧瓶体积的2/3以上。高压灭菌过程中溢出的介质会导致体积的损失，并且难以通过旋转彻底混合。
灭菌周期在121°C持续30分钟。我们通常在灭菌后1小时取出烧瓶（高压灭菌器的总时间为2小时）
我们通常在室温下冷却烧瓶（500ml介质）30分钟，然后加入补充剂。或者，可以将烧瓶在装有自来水的乙烯 - 乙酸乙烯酯（EVA）泡沫冰桶（4L）中冷却10分钟。然而，应该注意的是，这两种冷却方法都需要经过有经验的操作员的手触摸间歇性旋转和检查温度。对于较小的体积，建议相应地缩短冷却时间。
将板保持在层流罩（不需要空气流，但可加速干燥），以避免污染。
浓缩培养物可以支持长达3天的足够的蠕虫生长（从L1到妊娠成虫）。浓度因子为40.
我们更喜欢将细菌草坪铺展成矩形，避免接触板的墙壁。在草坪上保持蠕虫可以防止在收获时丢失蠕虫（爬上墙壁）。
将细菌种子板保持在层流罩中以避免污染。孵育过夜后，如果平板仍然是湿润的，则可以延长时间对板进行干燥。或者，打开空气流，加速层流罩中细菌草坪的干燥。
建议使用没有污染细菌或霉菌的平板进行分块，以避免交叉污染。或者，分块之后，允许蠕虫爬行几个小时，然后通过挑选将它们再次转移到新的盘子上。
具有尽可能多的妊娠成年人的培养皿（直径90mm）产生高水平的产蛋。
在将L1转移到RNAi板之前，在每次抽吸之前反转管以获得均匀的L1悬浮液。在干净的玻璃片上吸取一滴悬浮液（10μl），并计数滴虫数量。确保在足够的食物的盘子上转运适量的蠕虫，以维持3天的生长。过度拥挤的蠕虫会迅速消耗细菌并导致饥饿。因此，强烈建议确定最大数量的蠕虫可以长达3天，足够的食物在一块板上。我们在300μl浓缩的细菌培养种子RNAi板上生长约500个蠕虫。
我们从5个板（90毫米）收获成虫，并将它们作为一个样品在15毫升的离心管中储存。在这种情况下，蠕虫产生足够量的胚胎进行代谢物提取。为每个组准备4个独立样本（N = 4）。
只能使用超高分子，因为洗涤剂（如吐温）污染质谱仪系统。
低温溶液可增强蠕虫的沉淀
随着蠕虫数量的增加，总漂白时间相应延长。然而，我们不是增加漂白时间，而是会损害胚胎，我们更频繁地涡旋管（每30秒10秒），以增强蠕虫裂解和释放胚胎。应该指出的是，由于蛋壳完整性的破坏，蠕虫会出现胚胎致死性，例如G6PD敲低蠕虫（Yang等人，2013; Chen等人。 >，2017）。因此，应仔细进行漂白剂以避免胚胎的潜在裂解。我们建议在显微镜下检查胚胎的完整性
为了确保代谢物提取的一致性，在同一天用相同批次的提取溶液提取不同日期收集的样品。
基于实验所需的总体积，通过将2体积氯仿与1体积甲醇混合来制备氯仿和甲醇的混合物。氯仿，甲醇和水的比例为8：4：3。
在向悬浮液中加入氯仿和甲醇混合物后，出现初始相分离
超声处理增强涡旋后的均质化。也可以去除试管壁内侧的碎屑
将低级部分（疏水性）冻干并储存用于脂溶性代谢物分析。如果需要，上部分（亲水性）可以冻干并储存用于水溶性代谢物分析。
当抽吸较低级分时，请注意不要中断蛋白质层，因为蛋白质层可能不稳定并落入较低级分。首先，我们小心地将玻璃移液管的尖端插入玻璃管壁的下部，并最小化接触蛋白质层。第二，微量的上部流体可能会填充在玻璃移液器的前面。我们简单地将其分配到形成上升气泡的较低部分中。此举避免了亲水性代谢物的不良污染
完成氮气蒸发后，立即用螺帽盖住玻璃管，尽可能多地在管内捕获氮气。惰性气体可防止不必要的化学反应，如氧化，损害样品中的代谢物
UPLC-qTOF / MS分析的脂质组学分析从WATERS应用报告（720004107en）中修改。
ESI-模式的检测比ESI +模式的检测灵敏度低，因此ESI模式需要增加样品量。
我们选择显示基本峰强度（BPI）色谱图不是总离子电流（TIC），因为BPI看起来比TIC更干净。因此，我们更容易识别样品组之间的峰值差异。
我们从ESI +模式获得3,992种代谢物的总特征，并从ESI-模式获得730种代谢物
除了商业软件之外，我们还使用MetaboAnalyst进行数据矩阵中MS数据集的分析和可视化以及生成PCA图。
较高的VIP分数对于样本群体之间的歧视有较强的贡献。我们选择VIP＆gt; 1.0，并从ESI +模式获得848种代谢物，并从ESI-模式获得198种代谢物
当搜索针对人代谢组数据库的脂质代谢物时，我们分别选择主加合物类型为M + H和M-H用于ESI +和ESI-模式。分子量公差设定为0.01 Da。为了搜索脂类，ESI-模式提供了更多关于碎片离子性质的信息，例如脂肪酸的组成。
取决于化合物的性质，碰撞能量范围为6至32 V.

食谱

线虫生长培养基（NGM）培养基（0.5L）
1. 在488毫升超声波（高压釜）中溶解1.5克NaCl，8.5克琼脂和1.25克蛋白胨
2. 随后加入12.5ml 1M KPI，0.5ml 5mg / ml胆固醇，0.5ml 1M MgSO 4，0.5ml 1M CaCl 2 / >
3. 对于含有质粒的生长大肠杆菌HT115菌株，补加0.5ml 10mg / ml四环素盐酸盐，1ml 25mg / ml羧苄青霉素和0.5ml 1M IPTG，补充
1 M KPI缓冲液pH 6.0
1. 在950毫升超级电容器中溶解108.3克KH 2 PO 4和35.6克K 2 HPO 4 4 /
2. 用5N KOH溶液调节pH（5.5）至pH 6.0
3. 将最终音量调整为1 L
4. 高压釜，室温下储存
5 mg / ml胆固醇
将0.2 g胆固醇溶于40 ml乙醇中注意：不要高压灭菌。
在室温下存放
1 M MgSO 4
将12.04g MgSO 4溶解在100毫升超级电容器中高压灭菌器
在室温下存放
1 M CaCl 2
在100毫升的最佳提取物中溶解14.7克的CaCl 2 高压灭菌器
在室温下存放
10mg / ml盐酸四环素
溶解150毫克盐酸四环素在15毫升超大的
注意：不要高压灭菌。
用0.22μm过滤器（Millipore）过滤
将1ml等分至微量离心管并储存在-80°C
25 mg / ml羧苄西林
将375毫克羧苄青霉素二钠盐溶解在15毫升超大型的
中注意：不要高压灭菌。
用0.22μm过滤器（Millipore）过滤
将1ml等分至微量离心管并储存在-80°C
200μg/ ml氨苄青霉素
将3 g氨苄青霉素溶解于15 ml最新的
注意：不要高压灭菌。
用0.22μm过滤器（Millipore）过滤
将1ml等分至微量离心管并储存在-80°C
1 M IPTG
溶解3.57 g IPTG在15毫升超大的
注意：不要高压灭菌。
用0.22μm过滤器（Millipore）过滤
将1ml等分至微量离心管并储存在-80°C

致谢

这项工作是由台湾科技部（MOST103-2320-B-182-026-MY2和MOST105-2320-B-182-031-MY2至DTYC）提供的，由教育部台湾（EMRPD1E1751，EMRPD1G0181和EMRPD1G0281至DTYC）和长庚纪念医院（BMRP098，CMRPD1F0621和CMRPD1F0461至DTYC）。该方案由Yang等人发表的程序进行了修改。（2013）和陈等人（2017）。

参考

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