材料和试剂

90毫米无菌塑料培养皿（Dominique DUTSCHER，Gosselin，目录号：688302）
35毫米无菌塑料培养皿（康宁，猎鹰，目录号：351008）
液体闪烁瓶，6毫升盖子（PerkinElmer，目录号：6000592）
液体闪烁瓶，20毫升盖（PerkinElmer，目录号：6008117）
放射性核素废物袋（SCIE-PLAS，目录号：RRP-BAG17）
台式保护纸（Dominique DUTSCHER，Benchguard，目录号：090277）
液体闪烁鸡尾酒Ultimagold（PerkinElmer，目录号：6013329）
镍铬合金线，不锈钢，圆形，22号，直径0.64毫米（电子香烟供应商）
铝螺丝帽，橡胶衬套40毫米（VWR，SPV，目录号：215-2690）
多功能硅胶厨房或浴室，280毫升（Castorama，Rubson）
60 ml Luer-lock注射器（Dominique DUTSCHER，Omnifix，目录号：921016）
Teflon PTFE微管，分别为内径（int）和外径（直径）为1.15 mm和1.75 mm（Dominique DUTSCHER，PTFE，目录号：091932）
针18 G 0.9 x 40 mm（Dominique DUTSCHER，BD Microlance TM 3，目录号：301300）
管道，直径1.14 mm（Dominique DUTSCHER，Silicone，目录号：4906591）
管，直径3.17毫米（Dominique DUTSCHER，Silicone，目录号：4906600）
Microtubes，1.5 ml（Dominique DUTSCHER，Eppendorf，目录号：033511）
阀门Luer聚碳酸酯单向（Cole-Parmer，目录号：EW-30600-01）
空气无菌注射器过滤器，0.2μm，6.4 cm直径（Labomoderne，Midisart，目录号：RS3320）
高压灭菌聚丙烯袋，3L，未印刷（Dominique DUTSCHER，目录号：140230）
提示1,200μl用于移液器（Dominique DUTSCHER，Sartorius，目录号：077200B）
自制注射器支架
自制针架用于曝气
折叠裙边帽，14.9毫米直径（Dominique DUTSCHER，目录号：110602）
灭菌纸（Dominique DUTSCHER，目录号：006950）
（octulum菌根菌纲）（ectomycorrhizal担子菌）（实验室自己的收集，可根据要求提供）
硫酸锰（II）一水合物（MnSO 4•H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M7899-500G）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4•7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251-100G）
硼酸（H 3 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：B6768-500G）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4•5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C8027-500G）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1651-100G）
硝酸钾（KNO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：P8291-1KG）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4•H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：71504-250G-M） br />
硫酸镁七水合物（MgSO 4•7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：63138-250G）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333-500G）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080-500G）
柠檬酸铁铵（Sigma-Aldrich，目录号：RES20400-A702X）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-1KG）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7002-500G）
在水中的KH 2 32 PO 4 （PerkinElmer，目录号：NEX055002MC）
2-N-吗啉代 - 乙磺酸，4-吗啉乙磺酸一水合物（MES）（Sigma-Aldrich，目录号：69892-500G）
三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）（Sigma-Aldrich，目录号：T1378-500G）
1N硫酸溶液（EMD Millipore，目录号：1.09072.1000）
微量元素（参见食谱）
矿物盐碱溶液（参见食谱）
硫胺素溶液（参见食谱）
N6完全液体溶液（见配方）
固体N6完全液体溶液（见配方）
互动介质（IM）（见配方）

设备

样品瓶120毫升（VWR，SPV，目录号：SPVAGO2246）
玻璃瓶，1000毫升，ISO硼硅酸盐，毕业（Dominique DUTSCHER，目录号：046415）
玻璃瓶，2000毫升，ISO硼硅酸盐，毕业（Dominique DUTSCHER，目录号：046416）
两对不锈钢直镊子Wironit，Brucelles类型，130 mm（Dominique DUTSCHER，目录号：491037）
刀片20至25的解剖刀手柄（Dominique DUTSCHER，目录号：3740004）
外科刀片无菌N°21（Dominique DUTSCHER，目录号：132521）
独立燃烧器（Dominique DUTSCHER，目录号：071109）
用于燃烧器的丁烷气瓶（Dominique DUTSCHER，目录号：060415）
钉子，锤子，剪刀和剪钳
温度设定在25°C的孵化器
高压灭菌器
层流柜
软木钻，直径7.5毫米（Dominique DUTSCHER，目录号：942783）
水族馆气泵（SuperFish，型号：机箱Nr.4）
盾，固定15°角，平底，Beta; 530 x 350 mm屏蔽; 350 x 300 mm底座（竖直x水平）（SCIE-PLAS，目录号：RPP-S15L）
带铰接盖的小箱，Beta;外形尺寸：80 x 185 x 105 mm;内部尺寸：60 x 165 x 85 mm（高x宽x深）（SCIE-PLAS，目录号：RPP-B6）
Bin凳子上的beta废物，3.3升容量（SCIE-PLAS，目录号：RPP-B17）
液体闪烁计数器TRI-CARB 4910TR（PerkinElmer，目录号：A491000）

软件

用于计算的Microsoft Excel
Statistica 7.1（StatSoft Inc.，Tulsa，OK，USA）进行统计分析

程序

准备设备
1. 用于液体培养的玻璃罐
  菌丝体在玻璃瓶（120ml）中生长，其中先前配备有镍铬合金线的铝软木，以使真菌接种物悬浮在液体溶液的表面（参见图1）。
  准备：首先用钉子和锤子刺穿铝盖的中心。然后，用少量的硅胶膏覆盖孔，并使糊剂干燥24小时。用剪刀将橡胶密封圈中心切割，并将其放在盖子内。
  同时，用15厘米长的切割钳切割镍铬丝，其一端弯曲形成一种钩。每个罐装满40ml液体营养培养基。拿一个镍铬合金丝，并将其通过硅胶粘贴到装有橡胶密封垫的盖子的孔中，尽可能居中。将盖子拧到玻璃瓶上，并将电线的高度设置在营养溶液的正上方。将瓶子在121℃高压灭菌20分钟，然后使其冷却。
  
  图1.用于生长H的菌丝体的设备。 cylindrosporum 。它由一个装有40毫升完整营养液体培养基的120毫升玻璃瓶制成。 A.每个罐子由放置在镍铬合金丝上的一个真菌菌丝体的塞子或盘接种。 B.培养条件下在培养基表面生长的菌丝体的方面
2. 注射器支架，充气连接器和注射器的准备工作
  使用60ml注射器冲洗每个菌丝体，然后测量从标记的真菌到真菌培养基（IM）中的真菌
  
  32 P积累和/或 32 P流出（见食谱）。该冲洗步骤对于避免高估P积累和/或流出是至关重要的。通常，我们每次处理使用6个真菌重复，并且我们建立了自制设备（图2和3），以便于处理菌丝体。
  1. 注射器支架的准备（图2）：
    根据图2中给出的尺寸切割不同的木材。例如，要保持6个注射器，顶部的长度为37厘米长x 6厘米，下面的长度为32厘米长×6厘米宽。调整并保持两个部件在一起，以双向对准钻孔。之后，将所有的部分组合在一起，如图2所示
    
    图2.支持用于在相互作用介质中孵育菌丝体的注射器的自制支架
  2. 连接器的准备（图3）
    首先，用一双镊子取18针针，将其衣领加热一段火焰，软化胶水并用另一对夹子拉。冷却后，调整针头顶部约3厘米长的小片硅胶管（内径1.14毫米）。拿一个裙帽，将6针缝合到其顶部，并通过1毫升移液管尖端将其底部关闭，先前在其最好的端部切割。如有必要，可将硅胶加入脆弱处，以加强系统的防风。在蓝色移液管尖端的切割端，加入约20厘米长的硅胶管（3.17毫米内径），随后将其插入空气泵和连接器之间的无菌空气过滤器（见图3）。最后，将整个系统[连接器+ PTFE管+大直径硅胶管]置于高压灭菌袋中，并通过高压灭菌（115°C，40分钟）灭菌。
    
    图3.在相互作用介质中培养菌丝体期间充气注射器的自制连接器
  3. 注射器的准备：取出每个注射器的柱塞并将其丢弃。使用热指甲，在与注射量相对应的刻度表相对的注射器顶部钻一个孔。该孔将用于将微管放置在注射器内进行通气。将所有钻孔的注射器放在高压灭菌袋中，并通过高压灭菌（115°C，40分钟）灭菌。
真菌培养物的制备
注意：这是在无菌条件下，在层流柜中完成的。将软木塞和夹具进行火焰灭菌，并在使用前让其冷却。
1. 步骤1：从真菌培养物中培养固体培养基中的新培养物对于实验，我们使用大约每6个月更新的库存培养作为真菌材料的来源。这些真菌存活培养物在25℃下在琼脂营养培养基（固体N6培养基，见下文的配方）中在黑暗中生长在90mm培养皿中。培养基（硝酸盐）中的氮（N）源适应于这种真菌物种，因为它们在铵中不能很好地生长，与大多数外生菌根类型相反。
  在实验时，有必要通过将一个琼脂塞（直径7.5毫米）转移到含有25毫升固体N6完全培养基的新培养皿（直径90毫米）的中心，建立新的真菌培养物，菌丝体向下在营养介质上增强真菌的生长。新培养物在黑暗中培养3周，在培养箱中培养25℃
2. 步骤2：从固体培养物中生长玻璃罐中的真菌首先，通过在3周龄的菌丝体琼脂培养物中冲孔，用软木钻孔器准备真菌塞。
  然后，拧下一个瓶子的盖子，一只手握住;另一方面拿一对夹子，从固体培养基中取出真菌培养物塞;将插头插入镍铬合金线钩的尖端。将盖子妥善地拧在瓶子上，并将真空塞子放在介质的表面上，方法是将镍铬合金丝滑动（图1A）。真菌在25℃下生长两周。
3. 步骤3：从液体培养物中生长玻璃罐中的真菌用于标记实验
  然后将在液体培养基中生长的2周龄的菌丝体用于生产用于标记实验的真菌材料。为此，如步骤B2中所述，真菌盘从菌丝体上冲出并放置在镍铬合金线钩的尖端上。该方法避免在真菌培养物中存在琼脂，因为它可以通过从标记溶液中积聚 32 P而将干扰标记实验，并将 32 P释放到非 - 标签解决方案无琼脂的菌丝体在25℃下生长7天，不摇动
P预处理
1. 营养液的制备
  制备+ P和-P营养液体培养基，用于真菌预处理，其为N6培养基，P（作为NaH 2 PO 4提供1mM，参见食谱）或不含P （通过省略在N6培养基中加入NaH 2 PO 4），每个菌丝体40ml。准备额外的N6培养基，不含P（每个菌丝体100ml）冲洗菌丝体（见图4B）。
2. 罐子的准备
  在新罐中倒入40毫升液体培养基，即+ P或-P。在瓶子上没有镍铬丝的螺旋盖，如前所述将其高压灭菌。在1升瓶中加入另外的P N6培养基，并进行高压灭菌。
3. 将菌丝体转移到新媒体
  将含有七日龄菌丝体的烧瓶装入流层层室，通过将镍铬合金线向上滑过盖子从介质中取出菌丝体。允许营养介质在盖子拧下之前从真菌滴落（图4A）。
  1. 仅对于-P处理，通过将培养基中的每个菌丝体依次转移到含有20ml新鲜-P培养基（图4B）的35mm培养皿中3分钟，从而冲洗每个菌丝体。该操作重复四次，这意味着为每个菌丝体制备5个培养皿，如图5所示。该步骤对于消除否则会以正磷酸盐（Pi）污染-P溶液的结转溶液是必需的。漂洗后，将每个菌丝体转移到含有40毫升P培养基的新烧瓶中，并允许它们在25℃下在黑暗中再生长5天以得到P贫化的菌丝体。
  2. 对于+ P处理，将刚刚允许滴入干燥的菌丝体转移到含有40ml + P培养基的新烧瓶中，而不进行漂洗。允许它们在与-P条件相同的条件下生长。
    
    图4.将菌丝体转移到新介质。 A.首先将镍铬合金丝线穿过盖子，以在盖子拧下之前让溶液从真菌滴落。 B.然后拧下盖子，将菌丝体在含有35mm培养皿的20ml P缺陷培养基中冲洗5次。
    
    图5.布置在层流柜中用于冲洗菌丝体的培养皿图片
标签与 32 P
1. 安全预防措施：请遵照以下安全措施进行实验：放射性物质的处理，主要是（i）戴手套，实验室外套和剂量计来控制身体接收的辐射剂量，（ii）放置放射性物质或材料在有机玻璃屏幕后面，（iii）使用带有过滤器的吸头，（iv）丢弃特定容器中的放射性溶液或材料，（v）将这些容器放在有机玻璃屏幕后面，（vi）在一段时间后消除废物是至少10倍衰变期的 32 P，即140天，只有当废物的放射性不高于背景的两倍（通常为每秒0.8到1.6次）时。
2. 准备一套具有盖子的罐子，没有填充40ml + P培养基的镍铬合金线，并至少在标签实验前一天对其进行高压灭菌。将有机玻璃屏幕和防护纸放在工作台上，打开有机玻璃屏幕后面的罐子。通过快速添加KH 2 32 PO 4 标记具有 32 P正磷酸盐的介质。稀释放射性标记的来源，以便在+ P培养基中获得3.3×10 4个/μm2 Pq /μmolPi的初始活性。通过手摇摇瓶来均化溶液，并取一个子样品（150μl）来测量介质中的实际放射性。将子样品在-20°C的有机玻璃盒中储存在1.5 ml Eppendorf管中。使用50μl进行放射性测量。
3. 将带有菌丝体的罐子放在带有标记介质的罐子旁边。让真菌滴干（如图4A所示）。将带有真菌的盖子放在带放射性标记的培养基的罐中，拧上它并将镍铬合金丝滑下，直到真菌接触溶液表面。允许真菌在25°C，黑暗中孵育16小时。
在注射器中冲洗菌丝体
1. 将注射器放在长凳上的支架上，并装入PTFE微管进行曝气（图6）。在每个注射器中，倒入60 ml的相互作用介质（IM），并将收集容器放在水龙头下面。将连接器插入空气泵，并检查IM是否充分通风。但是，在清洗菌丝体时请关闭空气泵。将有机玻璃屏幕放在支架前。
2. 将带有菌丝体的罐子放在屏幕后面的标签溶液中，一个瓶子在一个注射器前面。使标记的溶液从每个菌丝体滴落约5分钟（如图4A所示）。拧下盖子，将真菌丝从盖子上滑下，将其放入注射器中。弯曲镍铬合金线，以将菌丝悬挂在相当于20毫升的水平（见图6）。
3. 将所有菌丝体悬挂在注射器中后，打开水龙头，使IM流入注射器下方的收集容器中。关闭水龙头，并在每个注射器中倒入约30 ml的新IM。 5分钟后再次打开水龙头，使IM进入收集容器。重复相同的操作四次，添加新的IM后10，15，20和40分钟后，开关即可打开。在整个期间，每个菌丝体用150ml的IM冲洗。在每个漂洗时间，收集1毫升IM，并将其放入6毫升液体闪烁瓶中以测量放射性
4. 在90分钟漂洗期后，您可以对6个菌丝体进行采样，以测量其鲜重和它们的含量。您还可以使用菌丝体与植物一起孵化，以随时间测量IM中的真菌32P外排（参见Becquer等人，2017）。
  
  图6.标签期后用于冲洗菌丝体的完整装置。：一种。含有相互作用介质的注射器; B.聚碳酸酯阀;收集船D.菌丝体镍铬丝F. Microtube聚四氟乙烯PTFE单独曝气; G.自制连接器，用于收集4到7个特氟纶管;无菌过滤器I.空气泵。
放射性测量
1. 在含有IM或标记培养基的每个6ml小瓶中加入4ml闪烁液，关闭小瓶并用手倒置数次。通过在小瓶中倒入4毫升闪烁液制成空白样品。按照制造商的说明，使用液体闪烁计数器测量放射性。
2. 为了测量真菌中的放射性，请在滤纸之间吸收每个菌丝体并记录其新鲜重量。根据菌丝体的大小，将其放入6 ml或20 ml闪烁瓶中，并分别加入4或12 ml闪烁鸡尾酒进行计数。
3. 使用Excel中编写的方程式来确定放射性测量期间发生衰变的原始数据：
  cpm t0 = Exp（Ln（cpm t -cpm background ））+（0.00003366099 x t），带有
  cpm =每分钟计数
  t0 =开始实验的时间
  t =计数器中样品的cpm测量时间（分钟）
  cpm 背景 =溶剂的cpm（空白样品）
  cpm =样品在时间t的放射性
  在对应于第一测量的时间t0的样品的放射性为cpm 。该值作为所有测量的参考值。
4. 在Becquerel（Bq）中使用以下公式转换cpm：
  1 Bq = 1 cpm x 0.033
5. 假设磷酸盐的浓度为1mM，计算提供给真菌（复制品）的磷酸盐的比活性（重复次数）：
  （Bq /μmole磷酸盐）=用于测量的标记培养基/体积的体积（ml）×[0.033]
6. 计算在暴露于 32 P期间由真菌（复制品i）摄取的P的量如下：
  真菌中的P积累（μmole）=（cpm x 0.033）/ SA

数据分析

由菌丝体释放或在菌体中累积的每个菌丝体或每克鲜重的表达量 32 P（在Bq中）。您还可以在16小时孵化期间将数据表达为真菌积累的磷酸盐的数量，并计算出Pi的相应摄取率。如果您比较了几种治疗方法，则使用Kolmogorov Smirnov检验来测试数据的正常性，并在必要时将数据转换为平方根或log10，然后进行分析以满足ANOVA的假设。为了比较治疗效果，使用ANOVA分析。

笔记

由于液体培养基中真菌的生长可能不同，我们准备最多4个接种真菌的培养瓶，以丢弃生长不良的培养瓶。
通过PTFE微管提供的曝气可能由于液体弯液面而倒塌。通过分配一个完全充满空气的60 ml注射器，并将空气强力推入微管，可以将它们从微管中拉出。
注射器中的微管的高度可能需要调整以允许空气离开。如果它们在介质中太深，空气就不会流动。

食谱

微量元素（1000毫升）
3.08g MnSO 4•H 2 O
4.41g ZnSO 4•7H 2 O
2.82g H 3 BO 3
0.98g CuSO 4•5H 2 O
0.29g Na 2 MoO 4•2H 2 O
将ddH 2 O加入到1000 ml中，保存在4°C
矿物盐碱溶液（各100毫升）
硫胺素溶液（100 ml）
0.01克硫胺素-HCl
N6完全液体溶液（1000毫升）
1. 加入1L烧杯中约500ml去离子水和以下体积的矿物溶液：
  6ml KNO 3
  1ml NaH 2 PO 4
  1ml MgSO 4
  4 ml KCl
  0.5ml CaCl 2
  0.5毫升柠檬酸铁铵/ /
2. 加入微量元素0.2 ml和硫胺素溶液0.5 ml
3. 完成体积至1升，并检查pH值应调整为5.5
4. 最后加入5g D-葡萄糖，摇匀至完全溶解
5. 这种解决方案分布在玻璃罐中
固体N6完全液体溶液（1000毫升）
拿两个1升玻璃瓶：
1. 加入7.5g琼脂，并在每个瓶子中倒入500ml液体N6培养基
2. 在121℃下灭菌20分钟
3. 将冷却的介质（55-60°C）倒入90 mm直径的培养皿中
相互作用介质（3000 ml）
1. 加入3LL烧杯中约1.5L去离子水和以下体积的矿物溶液：
  0.6ml MgSO 4
  1.5ml CaCl 2
  3.2g MES（终浓度为5mM）
  1.82克TRIS（终浓度为5 mM）
2. 用去离子水完成3升，并用1NH 2 SO 4将pH调节至5.5。
3. 将1.5升培养基倒入2升玻璃瓶中，并通过高压灭菌（20分钟，121℃）消毒

致谢

这项研究得到INRA（法国）的支持，通过为研究人员提供的年度资金和通过授予Adeline Becquer的年轻科学家合同（CJS）和CONACYT（墨西哥）通过授予玛格丽塔•托雷斯 - 阿基诺。该协议根据我们以前的工作（Torres-Aquino等人，2017）改编。我们还感谢三位匿名评审员的意见，帮助我们改进了协议。

参考

Becquer，A.，Torres-Aquino，M.，LeGuernevé，C.，Amenc，L.K.，Trives-Segura，C.，Staunton，S.，Quiquampoix，H.and Plassard，C。（2017）。建立培养的外生菌根真菌和植物之间的共生接口，以遵循真菌磷酸盐代谢。生物原菌 7（20）：e2577。
凯恩，J. W. G.（2011）。外生菌根真菌：森林土壤中磷的根系共生途径。 a>植物土壤 344：51-71。
Plassard，C.和戴尔，B。（2010）。菌根营养的磷营养。树生理学30 / 9）：1129-1139。
Smith，S.E。和Read，D.J。（2008）。菌根共生第3版。学术出版社。
Smith，S.E.，Anderson，I.C。和Smith，F.A。（2015）。菌根协会和磷获取：从细胞到生态系统。年度植物评论 48：409-440。
Torres-Aquino，M.，Becquer，A.，Le Guerneve，C.，Louche，J.，Amenc，L.K.，Staunton，S.，Quiquampoix，H.and Plassard，C.（2017）。寄主植物Pinus pinaster对外生菌根真菌Hebeloma borrosporum的磷酸盐外排和多磷酸盐代谢发挥特殊的影响：放射性示踪剂，细胞学染色和31 P NMR光谱研究。植物细胞环境40（2）：190-202。