材料和试剂

15cm组织培养皿（Corning，Falcon ，目录号：353025）
通风螺帽（Corning，Falcon ，目录号：354639; Corning，目录号：3968）
1.5ml聚丙烯微量离心管（Corning，Axygen，目录号：MCT-150-C）
锥形无菌聚丙烯离心管，50ml（Fisher Scientific，目录号：05-539-12）
96孔平底细胞培养板（Corning，目录号：3596）
12孔试剂池（Corning，Costar ，目录号：4877）
40μm细胞过滤器（Corning，目录号：431750）
锥形无菌聚丙烯离心管，15毫升（Fisher Scientific，目录号：06-443-18）
0.45μm无菌注射器过滤器（EMD Millipore，目录号：SLHV033RS）
一次性无菌注射器，带鲁尔锁头（BD，目录号：309646）
血清移液管（50毫升，25毫升，10毫升，5毫升，2毫升）
0.2或0.1微米过滤系统
ARPE-19细胞（ATCC，目录号：CRL-2302）
MRC-5细胞（ATCC，目录号：CCL-171）
TB40 / E IE2-EYFP杆粒克隆病毒
TB40 / E IE2-EYFP来源于临床获得的HCMV分离物TB40 / E（Sinzger等人，2008）的杆粒克隆。病毒双链DNA基因组已被克隆为杆状病毒，并且可以产生编码在多种宿主细胞类型中复制所需的趋向性因子的感染性病毒。如先前报道的，该病毒含有与关键病毒反式激活因子IE2基因的羧基末端融合的EYFP荧光标签（Teng等人，2012）。使用之前描述的用HCMV进行杆粒克隆的galK选择和反选择重组方案产生该杆粒克隆（Murphy等人，2008，Warming等人， 2005年）。这种荧光标签的表达贯穿于病毒裂解感染周期，并且能够方便地实时监测生物反应器环境中的连续感染。
不含钙和镁的DPBS，DPBS-CMF（Mediatech，目录号：21-031-CV）
胰蛋白酶-EDTA，0.25％（Mediatech，目录号：25-053-CI）
胰蛋白酶-EDTA，0.05％（Mediatech，目录号：25-052-CI）
干冰粒
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A451-4）
含有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM（Mediatech，目录号：10-013-CV）
带有L-谷氨酰胺和15mM HEPES的DMEM / F-12（Mediatech，目录号：10-092-CV）
胎牛血清（FBS）（Mediatech，目录号：35-011-CV）
青霉素 - 链霉素溶液（Pen / Strep）（Mediatech，目录号：30-002-CI）
Sigmacote（Sigma-Aldrich，目录号：SL2-25ML）
1M Tris，pH 7.5
氯化镁（MgCl 2）
盐酸（HCl）
Cytodex 1微载体珠，60-87微米（Sigma-Aldrich，目录号：C0646-5G）
用于滴定测定的培养基（TCID50）（参见食谱）
生物反应器的培养基（见食谱）
用SigmaCote硅化玻璃器皿（见食谱）
20％山梨醇（见食谱）
微载体珠比例和准备（见食谱）
贴壁细胞比例（见食谱）

设备

在BSL-2工作所需要的个人防护装备PPE：实验室外套或长袍，眼睛和脸部保护，手套
Wheaton Celstir旋转瓶，150ml，250ml和500ml（WHEATON，目录号：356879和356882）
组织培养的培养箱：37℃，5％CO 2
4位慢速搅拌盘（Corning，目录号：440814）
第二类生物安全柜（贝克）
涡旋混合器
微量移液器（1-1,000μl容量），多通道移液器（1-200μl容量）（P1000移液器和P200移液器[Pipetteman]）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1475）
细胞培养倒置epi荧光显微镜
台式离心机
水浴，37°C
100毫升可高压灭菌的玻璃瓶（WHEATON，目录号：W818012406）
批准BSL-2实验室设施
高压灭菌器
移液器控制器（Drum-aid，Drummond Scientific，型号：Pipet-Aid XP2，目录号：4-000-501）
冰柜：-80°C，-20°C，4°C

程序

时间
扩展ARPE-19细胞（步骤A1：2周）
准备培养饲养瓶和珠子（步骤A2-A6：播种前一天进行3小时）
在饲养瓶中接种ARPE-19细胞（步骤A7-A11：6.5小时）
在进料器生物反应器中更换培养基（步骤A12：每3-4天15分钟）
准备样品进行细胞计数（步骤B1-B8：25分钟）
在生物反应器中孵育细胞直至融合（步骤C1：1-2周）
在生物反应器中感染细胞（步骤C2-B4：10分钟）
在感染的生物反应器中更换培养基和细胞（步骤D1-D7：25分钟）
准备TCID 50的96孔板（步骤E1：15分钟）
设置TCID <50>感染（步骤E2-E11：25分钟）
确定来自TCID 50的滴度（步骤E12-E13：10分钟）
制备从生物反应器收集的病毒（步骤F1-F6：25分钟）
浓缩病毒库（步骤F7：3小时）

见图1，用于实验的生物反应器系统设置

图1.用于维持连续病毒生产的生物反应器系统设置A.将粘附的细胞系（ARPE-19）加入到500ml硅涂覆的玻璃加料器烧瓶中，烧瓶中含有在150ml中的2.5g水合微载体珠DMEM-F12媒体。将此进料瓶置于37℃培养箱中4小时以使ARPE-19细胞粘附至微载体珠，每半小时混合一次。 B. 4小时后，将培养基的体积升至500毫升的工作浓度，并将其放置在60转/分钟的搅拌板中，放回相同的培养箱中。让细胞在微载体珠粒上分开一周，并在供料瓶中达到汇合。当达到汇合时，将来自进料瓶的250ml搅拌的微载体珠粒转移到更小的250ml生物反应器中。然后用MOI为0.01的TB40 / E IE2-EYFP感染此较小的生物反应器。小型和大型生物反应器都放回到搅拌盘上的培养箱中。 D.当病毒扩展达到期望的稳定状态时，从感染的生物反应器收集浆液（在旋转时取得的微载体珠粒/培养基）和上清液（当搅拌板关闭并且微载体珠粒沉降时收集的培养基）。将未感染的ARPE-19细胞从进料烧瓶中取出，并与新鲜培养基一起加入感染的生物反应器中。微载体珠和培养基置换的速率维持HCMV的末期病毒生产。感染的生物反应器的体积和微载体珠浓度保持恒定。这种诱导的稳定状态可以持续所需的时间，从感染的反应器收集的样品被浓缩以产生病毒储备。

用ARPE-19细胞接种Cytodex 1微载体珠（图1A）
1. 在15cm细胞培养皿中培养足够的ARPE-19细胞，使得您有1×10 6个细胞/ ml终体积。对于500ml Celstir旋转瓶（进料瓶），需要5×10 8个细胞。
2. 在播种前一天，根据制造商的说明硅化500ml进料烧瓶和可Sigmaocote的可高压灭菌的100ml玻璃容器（ http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.pdf ）。
  注意：该程序已经被优化，以在播种期间将ARPE-19细胞最大程度地粘附到制备的Cytodex 1微载体珠上。 Sigmacote用于防止细胞粘附在旋转瓶的壁上。鉴于对细胞有毒性，硅化后需要进行严格的漂洗。
3. 用MilliQ水彻底冲洗饲养瓶和玻璃容器至少10次。将一个新的通风螺旋盖放在烧瓶的每个臂上。
4. 称量适量的干燥的Cytodex 1微载体珠子，以达到0.5g / 100ml生物反应器最终体积。对于500毫升的饲养瓶，量出2.5克微载体珠。
5. 将干燥的Cytodex 1微载体珠粒倒入硅化的100ml玻璃容器中，并加入100ml DPBS-CMF（不含钙和镁的DPBS）。彻底重新悬浮珠子。有关更多信息，请参阅GE手册： http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/pdfs/Microcarrier%20Cell%20Culture.pdf 。
6. ＆nbsp;高压灭菌器供料瓶和重新悬浮的微载体珠。
7. 通过从100ml玻璃容器中的沉降珠移出50ml DPBS-CMF移除，用50ml含10％FBS的DMEM-F12代替。通过涡旋重悬。孵化玻璃容器与珠在37°C，直到开始步骤A9。
8. 将5×10 8 ARPE-19细胞胰蛋白酶消化，用含有10％FBS的90ml DMEM-F12重悬，并置于饲养瓶中。
9. 从37°C培养箱中取出带有沉降珠的玻璃容器，并通过移液60毫升（即，大部分液体）来移除。将剩余的40ml DMEM-F12（含有10％FBS）的微载体珠粒重新悬浮在玻璃容器中，并将它们转移到进料瓶中。再加入20ml的100％FBS以增强细胞粘附。补料瓶中的最终体积应为约150毫升，最终的FBS浓度应大致为25％。
10. 将供料瓶置于37℃培养箱中以使细胞粘附至珠4小时。每隔30分钟，将饲养瓶放置在培养箱内60rpm的慢速搅拌盘上30秒，以缓慢搅拌生物反应器，并确保细胞接种。
11. 4小时后，通过加入含有10％FBS的350ml DMEM-F12，使进料瓶充满500ml体积。
12. 将孵化器中的饲料瓶置于4位置的慢速搅拌盘中，转速设置为60rpm。
13. 每2-3天更换饲养瓶内的媒体，以保持细胞密度。要做到这一点，让珠定居10分钟，然后删除50-75％的总媒体量（250-375毫升），并用相同数量的新鲜媒体（含5％FBS的DMEM-F12）取代它。让细胞在微载体珠上扩展一周，或者直到达到最大细胞密度（步骤C1）（通过程序B中的细胞计数和眼睛监测）。
注意：如果接种量太低，旋转瓶中的最大细胞密度也会随着时间的推移而保持低水平。一旦播种完成，如果有没有细胞的微载体珠，他们将永远保持未涂布。旋转瓶永久置于搅拌板上后，细胞不能与新细胞结合，细胞扩散的唯一方法是通过细胞分裂。

监测微载体珠上的ARPE-19细胞密度（图1B）
注意：在该过程中，我们正在获取准确的进料器反应器的细胞计数。要做到这一点，我们采取了一个样本的浆液，执行洗涤去除碎片，然后胰蛋白酶消化微载体珠子的细胞。因为微载体珠比细胞更快速地沉降，所以我们能够容易地将两者分开而不需要离心。
1. 从培养箱中取出饲养瓶，置于II级生物安全柜内60rpm的搅拌盘上。
2. 在搅拌盘上搅拌1ml浆液（混合细胞/微载体珠/培养基），并分装到1.5ml微量离心管中。将饲料瓶放回搅拌盘的培养箱中，在此过程的其余部分不需要使用它。
3. 让微量离心管中的微载体珠粒沉降2分钟。可以通过重力在微量离心管的底部观察微载体珠，不需要离心。
4. 通过从微量离心管吸取0.8ml培养基来洗涤，并用0.8ml DPBS-CMF再悬浮。通过在涡旋混合器上轻轻涡旋或通过上下移液重悬珠，然后使微载体珠再次沉降。
5. 从微量离心管中取出0.8ml的DPBS-CMF，用0.8ml的0.25％胰蛋白酶代替。轻轻涡旋重悬细胞。
6. 将微量离心管置于37°C培养箱中，让细胞胰蛋白酶消化15-20分钟，轻轻振荡或甩动以保证胰蛋白酶消化每5分钟重新悬浮。
7. 将微量离心管放回生物安全柜中，用P1000移液管强力吸取重悬。这一步也有助于从微载体珠粒中去除所有的细胞并分解聚集体。让珠子靠重力沉降30秒。
8. 移取10微升介质，从微量离心管中取出分离的细胞，避免吸收任何微载体珠粒。转移这10μL血细胞计数器，并确定细胞浓度。
注意：应定期（每2或3天）进行细胞计数，以确保细胞健康。饲养瓶中的细胞密度应该增加，直至达到最大密度（1×10 6细胞/ ml），然后保持恒定。在显微镜下观察粘附在珠上的细胞也是可能的。如果细胞似乎从珠粒中解离出来，或者细胞数量突然下降，这可能是因为介质没有被足够频繁地更换。

在具有TB40 / E-IE2-EYFP的生物反应器中的微载体珠子上感染ARPE-19细胞（图1C）
注：我们的EYFP融合标签IE2病毒被用来追踪生物反应器环境中的上皮细胞内的病毒传播，使用倒置的epi荧光显微镜进行观察。
1. 一旦通过细胞计数（程序B）测量，在进料瓶中的细胞浓度达到大约1×10 6细胞/ ml时，将250ml浆液转移至更小的硅化，漂洗和高压灭菌250毫升WHEATON旋转瓶（在此称为生物反应器）。通过定期更换培养基（含有5％FBS的DMEM-F12）继续维持饲养瓶中的细胞生长（参见步骤A13）。
2. 一旦达到大约1×10 6个细胞/ ml，通过细胞计数测量，将250ml浆液转移到更小的硅化和高压灭菌的250ml WHEATON旋转瓶（生物反应器）中。定期更换培养基，继续保持饲养瓶内的残留物（参见步骤C1）。
3. 以TB40 / E-IE2-EYFP为基础，以感染复数MOI为0.01，根据病毒储存的活细胞计数和TCID50，接种新生物反应器中的细胞。
4. 将生物反应器（250毫升）和饲料瓶（500毫升）放置在37°C培养箱内设置在60转/分的同一4位搅拌盘上。
5. 通过从搅拌的生物反应器中取200μl等分试样监测病毒扩增，并通过荧光显微镜观察EYFP扩散。扩展也应该通过定期的TCID 50 进行监控。
注意：被感染的细胞会从珠子上掉下来。

通过维持稳态TB40 / E IE2-EYFP感染持续高滴度病毒生产（图1D）
注意：为了保持正在进行的CMV感染并避免感染的崩溃，我们需要定期提供未感染的细胞，然后感染新生成的病毒。新鲜的媒体也被添加到防止细胞死亡。媒体和细胞需要被替换的速度取决于特定病毒的动力学。对于TB40 / E IE2-EYFP，我们确定每48小时更换一次培养基和细胞，随着时间的推移，病毒产量最高。尽可能保持饲养日程的规律是维持稳定的病毒生产的理想选择。另外，在饲养瓶中保持健康的幼稚细胞对持续的病毒生产是必不可少的。应该更换培养基，细胞密度应该保持恒定在这个饲料瓶（见步骤A13）。
1. 定期视觉监测可以跟踪生物反应器中感染培养物的健康状况。当80％的细胞被杀死（并从珠粒脱落），通常发生在感染后5-7天，开始定期喂养与细胞和媒体如下。
2. 每48小时，从生物安全柜内的搅拌板上搅拌，从感染的生物反应器中移出37.5毫升（占总生物反应器体积的15％）淤浆。将该浆液转移到50ml锥形管中，并在300×g下离心5分钟（去除未粘附的细胞）。等分3份500μl（用于TCID 50）的上清液样品。在-80℃冷冻三个等分试样和50ml锥形的培养基管以供以后使用（对于步骤E2）。
3. 放置一个500μl的等分试样用于TCID 50测定（对于步骤E2），并将其余的在-80℃冻结以备后用。
4. 从搅拌板上取下生物反应器，让珠粒沉降5-10分钟。从被感染的生物反应器的顶部除去另外25ml（总生物反应器体积的10％）上清液。不要移动沉降的珠子。
5. 从未感染的饲养瓶中，吸取37.5ml浆液，同时旋转并将其转移到感染的生物反应器中。一定不要交叉污染你的饲料瓶。
6. 吸取25毫升含5％FBS的DMEM-F12到感染的生物反应器中。这个媒体应该被加热到37°C。
7. 将两个旋转瓶放回培养箱中的搅拌板上。
使用TCID 50（图2）监测TB40 / E IE2-EYFP感染的生物反应器中的病毒生产
1. 通过以6,000个细胞/ ml的细胞悬浮液每孔移取100μl，在96孔平底板中种入MRC-5成纤维细胞。在37°C孵育过夜，使细胞粘附和生长。
2. 取一份500μl上清液（步骤D2中制备），并通过在干冰/异丙醇浴中交替温育来冻融3次，一旦冷冻，将管转移至37℃水浴解冻。确保在每个冻融之间进行涡旋。这一步释放了感染细胞内的病毒颗粒。
3. 在300μgxg离心500μl等分试样3分钟。
4. 添加1毫升含10％FBS的DMEM到12孔试剂池的6个孔中
5. 向第一个孔中，移取110μl制备的病毒上清液到培养基中。使用P1000，彻底混合，避免气泡。第一口井的病毒稀释度为1:10。
6. 吸取110＃培养基从＃1井到＃2＃培养液，以获得1:100稀释的病毒制剂。
  使用P1000移液器充分混合，避免气泡
7. 重复1:10的系列稀释液至最后一个孔，稀释度为1：1,000,000。
8. 从培养箱中取出贴有MRC-5细胞的96孔板，吸出培养基。
9. 使用多通道P200移液器，将100μl的每个连续稀释液转移到MRC-％成纤维细胞平板上。重复转移连续12次，以确保感染的MRC-5的8个孔被每种病毒稀释物感染。
10. 将板置于37℃培养箱中，并在下一周使用荧光显微镜进行监测。
11. 在第7天，将每个稀释度内的八个孔评分为细胞病变效应的阳性或阴性。
12. 使用得分计算TCID 50（Reed Muench，1938）。 TCID 50是在50％的接种细胞培养物发生病理变化时的感染性病毒效价。这是通过将一系列稀释的病毒接种至易感细胞来确定的。从研究之门Excel文件是一个简单的方式来完成这个计算： https://www.researchgate.net/file.PostFileLoader.html?id=58dad730f7b67ea37125593f&assetKey=AS%3A476999471898624%401490736944531 。
  
  图2. TB40 / E IE2-EYFP病毒感染可以在终末阶段长期重复保存，从而实现高效价的TB40 / E IE2-EYFP生产。 A.以0.01的MOI感染的粘附的ARPE-19细胞在感染后一天显示特征性的食期，其中病毒浓度下降至低水平。到第二天，病毒浓度开始增加，直到第7天达到其高峰期病毒产量。在此之后，当使用静态培养方法时，病毒浓度开始下降，因为没有更多的细胞被感染。在生物反应器设置中观察到相同的病毒动力学曲线。然而，使用该系统，可以通过定期更换涂有初始ARPE-19细胞的微载体珠来维持峰值病毒生产阶段。 B.我们证明，与三周的静态培养板相比，可以产生100倍以上的TB40 / E IE2-EYFP病毒。累积在每个时间点采集的病毒库，并与从一个15cm细胞培养皿中收集病毒的平均滴度进行比较，估计为每个平板7.5E6总pfu。这估计了用TB40 / E IE2-EYFP感染多少15cm平板以获得与从生物反应器收集的累积样品相同浓度的病毒。一旦达到稳定状态的病毒产量，并且开始定期喂食，达到相同总pfu将需要的平板数量迅速增加。在第23天，需要105个平板具有与反应器系统相同的pfu / ml。为了显示维持的末期感染的再现性，用MOI为0.01的TB40 / E IE2-EYFP感染包含用ARPE-19包被的微载体珠的生物反应器。一旦达到高峰病毒产量，建立并保持稳定状态。经过一段时间后，感染的生物反应器被等分成4个较小的100ml生物反应器，其中稳定状态通过定期改变相同比例的浆液（15％）和上清液（10％）而保持相同分裂。 D.使用来自全部四个生物反应器的每个48h时间点的上清液样品完成TCID 50滴定。每天对四种生物反应器的结果进行平均，并确定标准偏差。结果显示维持的病毒生产状态是可重现的。
  生物反应器携带的时间越长，其病毒产量就越稳定
准备用于其他实验的病毒库存
注意：根据您的TCID50结果（从程序E确定），在常规进料期间从生物反应器收集的病毒对于某些实验可能具有足够高的浓度。如果您需要更高的浓度，可以使用山梨糖醇底层进行标准超速离心。上清液和浆液样品在使用前需要进行不同的处理。冷冻的上清液样品（无微载体珠）只需要解冻和过滤。浆液样品（带有微载体珠子的冷冻样品）需要多次冻融以从细胞内分离病毒。
1. 上清液样品
  1. 从TCID 50在水浴中滴定的天内解冻病毒的冷冻锥形管样品。
  2. 上清液样品可以直接使用（在步骤D7中制备）。然而，在使用之前，使用细胞过滤器的过滤介质去除任何剩余的微载体珠子。之后，介质也应该使用40微米的过滤器进行过滤。
2. 泥浆样品
  1. 从TCID 50在水浴中滴定的天内解冻病毒的冷冻锥形管样品。
  2. 对于浆液样品，将解冻的锥形管离心5分钟，并移除除了包含粒状微载体珠粒的5ml之外的所有培养基。
    移除媒体可以被过滤和使用，如步骤F2所述。
  3. 通过将其置于干冰/异丙醇浴中冷冻剩余的5ml锥形管中的浆液3次，然后一旦冷冻转移到水浴中。在每次冻融之间，涡旋所有样品。这一步释放了感染细胞内的病毒颗粒。
  4. 在300×g离心5分钟3分钟。
  5. 从颗粒中去除剩余的培养基，并通过细胞过滤器移液。这现在可以用于感染或以后冻结。
3. 可选：为了进一步浓缩病毒储存，由Stinski等人开发的方案应该使用（1976）。简言之，在23ml病毒制剂中，底层7ml的20％山梨糖醇。在18℃以7200×g（20,000rpm）离心1.5小时后，小心地取出上清液并将病毒沉淀重悬于2ml不含FBS的DMEM中。

数据分析

我们报道了一种生物反应器系统（图1），用于生产持续的高滴度CMV临床分离株，同时保持病毒基因组和趋向因子的完整性。生物反应器系统中的感染表现出与静态培养中的感染类似的动力学，但是在可重现的稳定状态（图2C-2D）下维持了可再现的病毒长时间生产（图2A）。该生物反应器方法能够在23天时间内以10 7 -10 -8 pfu / ml制备临床分离株TB40 / E IE2-EYFP HCMV病毒，而不需要每日细胞传代或胰蛋白酶化，病毒维持细胞取向因子。总体而言，与传统静态培养板（图2B）相比，该系统使TB40 / E IE2-EYFP病毒产量增加了100倍以上，同时需要大量的时间和人力。尽管我们已经使用TB40 / E IE2-EYFP来清楚地描述该系统的程序和益处，但是这种生物反应器方法可用于产生任何临床衍生的CMV毒株。末期稳态感染表现出最小的变异（图2C），表明该系统可能潜在地用于其他测定，诸如病毒进化的实时追踪。
预期结果

鉴于平均7.5×10 6 pfu可从单个15厘米的TB40 / E IE2-EYFP感染细胞中收集，我们可以将生物反应器中产生的HCMV病毒的量与本来需要的板数。在我们的生物反应器中，一旦达到稳定状态的病毒生产，并且定期喂食开始，病毒产生增加非常迅速。到第8天，需要8个平板来获得相同数量的总病毒颗粒，到第22天，需要32.5个平板。在第23天，当收集250ml的全生物反应器体积时，需要105个平板来获得在我们的生物反应器系统中达到的病毒量（图2B）。
在每个时间点收集的样品可以被冷冻，汇集并浓缩以获得高浓度的HCMV储液（即，获得高达3ml的病毒制剂，超过2×10 7
。

笔记

故障排除

食谱

用于滴定测定的培养基（TCID50）带有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素 - 链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM / F-12）
在4°C储存
使用前带到37℃
生物反应器的培养基
含有5％FBS和1％青霉素 - 链霉素的DMEM / F12
在4°C储存
使用前带到37℃
用Sigmacote
硅化玻璃器皿清洁玻璃器皿（搅拌烧瓶，100毫升容器）与去离子水和干燥
在玻璃烧瓶中加入3毫升Sigmacote并旋转，使液体覆盖玻璃器皿的所有内表面10秒。删除多余的解决方案，并保存以供重用

用去离子水彻底冲洗玻璃烧瓶，确保过量的Sigmacote被清除注意：将Sigmacote储存在4°C。
20％山梨糖醇
1. 合并：
  100克山梨醇
  25毫升1M Tris，pH 7.5
  0.5ml 1M MgCl 2（30.5g MgCl 2 + 150ml MilliQ水）。
2. 添加足够的水，以达到350毫升
3. 滴加HCl使pH值达到7.2
4. 添加足够的MilliQ水，以达到500毫升
5. 用0.2或0.1微米过滤系统过滤原料
微载体珠比和制备
每100毫升最终生物反应器体积（干重）0.5克Cytodex 1微载体珠子
在室温下储存干燥的微载体珠子
贴壁细胞比例
每100毫升最终生物反应器体积为1×10 5个细胞（细胞应该是低通的）

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款DP1DE024408和DP2OD006677（给L. Weinberger）的资助。
利益冲突披露：L. Weinberger是Autonomous Therapeutics Inc.的联合创始人。其他作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

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Albrecht，T。和Weller，T.H。（1980）。五种人巨细胞病毒引起的斑块的异质形态特征。 Am J Clin Pathol 73（5）：648-654。
Bristow，B.N。，O'Keefe，K.A.，Shafir，S.C。和Sorvillo，F.J。（2011）。美国1990 - 2006年先天性巨细胞病毒死亡率 PLoS Negl Trop Dis 5（4）：e1140。
Cha，T. A.，Tom，E.，Kemble，G. W.，Duke，G. M.，Mocarski，E. S. and Spaete，R. R.（1996）。人巨细胞病毒临床分离株至少携带19种在实验室中未发现的基因。 > J Virol 70（1）：78-83。
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