材料和试剂

Nunc TM Lab-Tek TM II Chamber Slide TM系统（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：154534）
0.22μmPVDF针筒式过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGV004SL）
盖玻片（22×40毫米）（VWR，目录号：470019-008）
从吗啡处理的和/或肺炎链球菌感染的小鼠收获的肺组织
J774细胞，小鼠腹膜巨噬细胞系（ATCC，目录号：TIB-67）
一级抗体
注意：用于PLA反应的每一对都需要通过蛋白质印迹（天然和SDS-PAGE）进行特异性验证，并且必须来自不同的宿主，与具有PLA探针的Duolink二抗相容。
1. 亲和分离的兔抗TRAF6抗体（Sigma-Aldrich，目录号：SAB2102531）
  注：此产品已停产。
2. 在兔中产生亲和力分离的抗TLR2抗体（Sigma-Aldrich，目录号：SAB1300199）
3. 单克隆抗MYD88（克隆OTI2B2）（OriGene Technologies，目录号：TA502117）
连接到PLA探针的二抗
1. Duolink原位PLA探针抗小鼠MINUS，亲和纯化的驴抗小鼠IgG（H + L）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92004）
2. Duolink原位PLA探针抗兔PLUS，亲和纯化的驴抗兔IgG（H + L）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92002）
福尔马林溶液，中性缓冲液，10％（10％NBF）（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128-4L）
石蜡（Fisher Scientific，目录号：P31-500）
二甲苯（组织学等级）（Fisher Scientific，目录号：X3S-4）
乙醇200标准（Merck，目录号：AX0441）
固定 - 透化缓冲液组（Thermo Fisher Scientific，eBiosciences TM，产品目录号：88-8824-00）
pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：10010023）
Tween 20（Fisher Scientific，目录号：BP337-100）
用DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82049）在Duolink原位固定培养基中进行培养。
指甲油（作为盖子密封胶）
DMEM /高葡萄糖（4,500mg / L L-葡萄糖）（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SH30243.01）
青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
胎牛血清（FBS），合格的，USDA认可的区域（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：10437010）
超纯0.5M EDTA，pH6.0（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15575020）
来自大肠杆菌O127：B8的脂多糖（Sigma-Aldrich，目录号：L3880）
Duolink®原位洗涤缓冲液，荧光（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82049）
Duolink®原位检测试剂橙色（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92007）
Duolink原位洗涤缓冲液A和B（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82047）
Duolink 原位清洗缓冲液一种工作溶液（见食谱）
Duolink 原位清洗缓冲液B工作溶液（见食谱）

设备

科普林罐（通用）
油标记（Aqua-hold pap pen）（Electron Microscopy Sciences，目录号：71311）
蔬菜蒸笼（通用）
滑动湿度室（Simport，型号：M920）
实验室摇床或摇杆
荧光过滤器（Leica）
1. 滤波器49，激励G365，发射445/50
2. 滤波器组43 HE，激励BP550 / 25，发射605/70
荧光显微镜

软件

ImageJ软件（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

抗体选择
1. 为了鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用，必须使用识别两种蛋白质的一级抗体。由于抗体的特异性是至关重要的，因此建议在初始和变性条件下使用组织裂解物对抗体进行Western印迹分析。目标是在两种条件下获得最高的特异性，因为以下步骤可能在细胞内混合了初始和变性条件下的靶抗原。
2. 一抗必须在来源物种中有所不同（例如，兔抗MyD88和小鼠抗TRAF6）。
3. 每种寡核苷酸偶联的二抗都必须识别一种一抗。
样品制备
1. 组织切片
  1. 在体内收集的组织应立即在10％NBF中固定，然后包埋入石蜡。
  2. 从石蜡块装载5-8微米的部分到幻灯片。
  3. 通过将载玻片浸入二甲苯浴（3-4次浸渍和15-20秒保存时间）并用连续的乙醇洗涤液（100,70,50,30和0％的水溶液）重新水化载玻片来脱蜡玻片。
  4. 加入透化缓冲液（1x）足以在4°C的黑暗中覆盖该部分40分钟
  5. 用PBS洗一次载玻片，并在植物蒸锅中孵育幻灯片1小时。
  注：在我们的例子中，我们使用从吗啡处理和/或肺炎球菌感染小鼠收获的肺组织。
2. 培养的细胞载玻片
  1. 板上40,000到50,000细胞/毫升培养基，室幻灯片和孵育过夜，让细胞粘附到幻灯片浓度60-80％汇合。
  2. 对室内的细胞进行必要的处理。
  3. 去除媒体，并立即修复细胞，每个室加入10％的NBF，并在室温下孵育20分钟。
  4. 去除室壁。
  5. 用PBS洗三次幻灯片。
  6. 通过在室温下孵育载玻片与含0.01％吐温20的PBS 10分钟渗透。
  7. 用PBS洗三次幻灯片。
  注：在我们的例子中，我们使用小鼠腹腔巨噬细胞系J774。我们用不同浓度的LPS处理这些细胞1小时以诱导与TLR4结合的myddosome。
PLA协议
1. 轻拍幻灯片删除多余的液体，然后空气干燥，用油标记轮廓组织部分或井。
2. 在湿度室中用封闭液孵育载玻片30分钟
3. 去除阻断溶液，并添加足够的两种一抗重构在封闭液（大约1微克抗体/室或每节），以覆盖每个部分或室。
  注意：大约40μl的溶液将足以覆盖一个室。
4. 在湿度室内孵育过夜，4°C
5. 将幻灯片放在装有清洗缓冲液A的Coplin罐中（参见食谱），每次在实验室摇床上放置两次，每次5分钟。
6. 加入寡核苷酸连接的第二抗体溶液，在洗涤缓冲液A（足以覆盖部分/细胞）中以1:10稀释至载玻片。
7. 在湿度室中37°C孵育1小时
8. 在洗涤缓冲液A中洗两次，每次五分钟在摇床上。
9. 将连接酶溶液加入载玻片（足以覆盖切片/细胞），并在37℃的湿度室中孵育30分钟。
  注意：连接酶的工作浓度应为原瓶的1:40，用分子生物学级别的水稀释。
10. 在洗涤缓冲液A中洗两次，每次五分钟在摇床上。
11. 加入预混合的聚合酶和核苷酸溶液，在37℃孵育100分钟。
  注意：在这一点之后，限制幻灯片曝光。聚合酶的工作浓度应为原溶液的1:80，用分子生物学级水稀释。在洗涤缓冲液B（参见食谱）中洗涤两次，每次10分钟。
12. 用1倍清洗缓冲液B清洗1分钟。
13. 允许幻灯片干燥。
14. 用DAPI在安装介质中安装盖玻片。
15. 盖子边缘用指甲油打滑。
16. 允许晾干。

数据分析

成像（图1）
1. 使用荧光显微镜和适合DAPI的滤光片（如Leica滤光片组49），识别并拍摄幻灯片上的细胞/组织。
2. 使用适合您的PLA探头的过滤器拍摄相同的区域注意：
  1. 在我们的例子中，我们使用来自Leica的过滤器组43 HE来识别我们的PLA探针，Duolink原位检测试剂橙色。
  2. 除了合并的图像之外，请务必单独保存DAPI和PLA探针图像的单个图像文件。
    
    图1.使用ImageJ检测荧光颗粒如上所述使用颜色阈值。 A.DAPI染色的J774细胞的未编辑图像; B.应用色彩阈值后的相同图像; C.用于此阈值的设置的示例。
量化（图2）
1. 确定细胞计数
  1. 在ImageJ中，打开包含DAPI图像的文件。
  2. 选择图片＆gt;调整＆gt;颜色阈值...
    注意：这适用于彩色图像。如果使用灰度图像，请选择图像＆gt;调整＆gt;阈值...
  3. 调整这个对话框中的参数，直到DAPI染色的细胞核完全，但明显突出。
  4. 选择分析＆gt;分析粒子...
  5. 选中“摘要”复选框，然后选择“确定”。
  6. 由此产生的“总结”窗口将包含核的总数。
2. 确定PLA反应的次数
  1. 在Image J中，打开包含PLA图像的文件。
  2. 选择图片＆gt;调整＆gt;颜色阈值...
    注意：这适用于彩色图像。如果使用灰度图像，请选择图像＆gt;调整＆gt;阈值...
  3. 调整这个对话框中的参数，直到PLA反应点完全，但明显突出。
  4. 选择分析＆gt;分析粒子...
  5. 选中“摘要”复选框，然后选择“确定”。
  6. 由此产生的“总结”窗口将包含PLA反应的总数。
3. 比较样品中PLA反应的数量与核的数量以确定每个细胞的蛋白质相互作用的数量注意：这是一个简单的阳性PLA荧光和DAPI的比例
  1. 可以使用宏和批次分析来快速分析ImageJ中的多个图片。
  2. 如果图像中的细胞数量较低，手动计数可能更适合您的研究，并且更准确。
    
    图2.用于在荧光图像中为PLA反应创建颜色阈值的IJM语言宏的示例因为所使用的图像仅是PLA荧光而不是合并图像，因此最小和最大设置因为色调和饱和度可以是包含性的（第14,15行为色调，第17,18行为饱和度）。包含信号时调整最小亮度以消除背景（第20行）。宏创建一个蒙版，并在应用阈值后对剩余的粒子进行计数。通过使用ImageJ中内置的批处理功能，Macro可以用来一次对多个图像文件中的粒子进行计数。
结果
1. J774细胞：J774是鼠巨噬细胞系，用不同浓度的LPS处理以激活TLR4途径。这需要将Myd88（作为更大的myddosome复合体的一部分）募集至TLR4，并且随后将其连接至Traf6（E3泛素连接酶）。如果TLR4被成功激活，Myd88和Traf6将在反应的第一个小时内结扎，如图3所示。
  
  图3.在J774细胞中显示MyD88 Traf6激活的近端连接分析在固定和PLA之前，用不同浓度的LPS处理细胞1小时。 A.未处理的J774细胞; B.2ng / ml LPS处理的J774细胞; C.定量每个DAPI染色的细胞的连接反应的数量。比例尺= 100微米。
2. 肺切片：将C57b16 / j动物或者用吗啡或肺炎链球菌或者两者处理72小时，并且使用它们的肺切片在TLR2和Myd88之间进行PLA。如图4所示，单独的治疗没有表现出阳性的PLA反应。这是预期的，因为吗啡治疗本身不会激活TLRs，但会使个体易感染机会性感染。单独肺炎链球菌也不会激活TLR2，因为肺完整的上皮屏障。然而，联合治疗由于TLR2的激活而显示出阳性PLA反应。
  
  图4.显示小鼠肺上皮中的TLR2 / MyD88相互作用的PLA。（A）72小时吗啡处理（B）用肺炎链球菌感染（C）72小时吗啡处理和<！ - SIPO
3. 阴性对照：除了每个实验内的单独对照之外，进行本实验以测试方法的完整性。如图5所示，我们对用LPS处理的J774细胞中的TLR2和Myd88进行了PLA反应。这个反应与预期的一样是阴性的，因为在这些条件下，LPS刺激TLR4和Myd88不应该与TLR2结合。
  
  图5.在用LPS处理的J774细胞中，PLA显示TLR2和MyD88之间没有相互作用我们在任何处理组中观察到很少或没有PLA反应。 LPS是TLR4的激活剂，而不是TLR2。尽管TLR2和MyD88抗体都可能与它们各自的抗原相互作用，但抗原并不存在于彼此的40nm内，并且不会诱导PLA反应。比例尺= 100微米。
4. 阳性对照：我们验证了该方法检测蛋白质相互作用的能力。如图6所示，我们对用LPS处理的J774细胞中的TLR4和CD14进行了PLA反应。我们检测到TLR4和CD14之间的LPS依赖性相互作用。这是预期的，因为LPS处理下的TLR4 / CD14相互作用已经被彻底表征了。
  
  图6.显示用LPS处理30分钟的J774细胞中的TLR4 / CD14相互作用的近端连接分析。：一种。未经处理的J774细胞; B. 0.4ng / ml LPS处理的J774细胞; C.2ng / ml LPS处理的J774细胞; D.每个DAPI染色的细胞的连接反应数目的量化。比例尺= 50微米。

笔记

如前所述，Duolink PLA方法在体外和体内条件下的重复性良好，并有注意事项。人们应该记住的考虑如下：

根据我们的经验，室内幻灯片的质量非常重要。尝试了各种品牌，Nunc品牌（上述材料中的第一）给了我们最清晰的结果。应避免使用合成基座的房间滑梯。质量好的光学透明玻璃基地是最好的。
我们已经使用8孔室幻灯片试剂优化，并有足够的实验重复（在这种情况下n = 4每个条件）。但是，在洗涤步骤中应该小心，因为这些腔室载玻片的边缘表面张力相当强，并且最佳的洗涤可能是具有挑战性的。在洗涤时，建议偶尔的旋转运动覆盖整个室，包括边缘。
PLA最适合60-80％汇合细胞。我们一直喜欢这种浓度，因为它使腔室底部的贴片留空，这作为试剂的非特异性结合的附加控制。
对于体内实验，背景染色比在铺板细胞中更高。这是预期的，非特定的背景通常是一个统一的色调，而不是点状污点。由于在体内样品中观察到高水平的非特异性染色，您可能希望增加组织样品的阻断时间。这应当根据组织的来源来优化，例如与本文使用的肺组织相比，肠和脂肪组织可能需要更少或更多的孵育时间。
固定的组织载玻片必须在与单个抗体孵育之前进行抗原修复。
流式细胞透化缓冲液和基于蔬菜蒸汽的抗原检索的组合一直给我们成功的PLA反应
通常，PLA反应总是产生点状荧光。在极少数情况下，如果PLA反应持续染色，应使用适当的实验对照和单一抗体对照来验证特异性反应。
在参考一级抗体的选择时，用于PLA反应的每一对需要通过蛋白质印迹（天然和SDS-PAGE）进行特异性验证，并且必须来自不同的宿主，与具有PLA探针的Duolink二抗相容。

食谱

Duolink原位洗涤缓冲液A
1. 另一种使用Duolink原位洗涤缓冲液A
  要制备1x缓冲液，将一个小袋的内容物溶解在高纯度水中，最终体积为1000 ml。
  在室温下储存袋子注：到期日期在每个批次上标记。 1x溶液可以在室温下保存一小段时间（一周或更短）。长时间储存于4°C。使用前将溶液置于室温。
2. 备选方案2 - 使您自己的Duolink原位洗涤缓冲液A
  1. 在800毫升高纯度水中溶解8.8克氯化钠，1.2克Tris碱和0.5毫升吐温20
  2. 使用HCl将pH调节至7.4
  3. 加入高纯度水至1,000 ml（最终浓度为0.01 M Tris，0.15 M NaCl和0.05％吐温20）
  4. 过滤溶液通过一个0.22微米的过滤器和存储在4°C
  5. 使用前请将溶液置于室温下
Duolink原位洗涤缓冲液B
1. 备用1用Duolink原位洗涤缓冲液B
  要制备1x缓冲液，将一个小袋的内容物溶解在高纯度水中，最终体积为1000 ml。
  在室温下储存袋子注：到期日期在每个批次上标记。 1x溶液可以在室温下保存一小段时间（一周或更短）。长时间储存于4°C。使用前将溶液置于室温。
2. 备选方案2 - 使您自己的Duolink原位洗涤缓冲液B
  1. 溶解5.84克NaCl，4.24克Tris碱和26.0克Tris-HCl在500毫升高纯度水中
  2. 使用HCl将pH值调节至7.5
  3. 将高纯度水加到1000毫升（终浓度为0.2M Tris和0.1M NaCl）
  4. 过滤溶液通过一个0.22微米的过滤器和存储在4°C
  5. 使用前请将溶液置于室温下

致谢

这项工作得到了NIH R21HL125021和迈阿密大学机构支持（SB）的部分支持。作者声明没有利益冲突。所有数据的数据都是专门为本协议生成的。然而，PLA方案适用于我们以前的出版物（Banerjee等人，2015），SciRep 5：11384的J774细胞;本协议的第一号参考文献），在16HBE14o（人支气管上皮细胞系）上进行。如文中所述，对肺组织的PLA进行了改良和修改。

参考

Banerjee，S.，Ninkovic，J.，Meng，J.，Sharma，U.，Ma，J.，Charboneau，R.和Roy，S。（2015）。吗啡妥协支气管上皮TLR2 / IL17R信号串扰，肺IL17稳态所必需 < em> Sci Rep 5：11384。
Cleaver，JO，You，D.，Michaud，DR，Pruneda，FA，Juarez，MM，Zhang，J.，Weill，PM，Adachi，R.，Gong，L.，Moghaddam，SJ，Poynter，ME，Tuvim， MJ和Evans，SE（2014）。肺上皮细胞是肺炎的诱导性抗性的重要效应物粘膜免疫学 7（1）：78-88。
Gay，N.J。，Gangloff，M.and O'Neill，L.A。（2011）。 Myddosome结构告诉我们什么是天然免疫的启动。免疫学32（3）：104-9。
Ho，P.C.，Tsui，Y.C.，Feng，X.，Greaves，D.R。和Wei，L.N。（2012）。 NF-κB介导的共激活因子降解RIP140调节炎症反应并有助于耐受内毒素。（Nat Immunol）13（4）：379-386。
Xiong，Y.，Qiu，F.，Piao，W.，Song，C.，Wahl，L.M。和Medvedev，A.E。（2011）。内毒素耐受能力损害IL-1受体相关激酶（IRAK）4和TGF-β激活的激酶（TGF-β1） 1激活，K63连接的多聚遍在蛋白化和IRAK1，TNF受体相关因子6和IκB激酶γ的装配，并增加A20表达。。