材料和试剂

动物
小鼠：C57BL / 6J（8周龄）
注：我们建议三到四只小鼠建立单层细胞培养。对于神经球分析实验，我们推荐每个96孔板使用一只小鼠。
一般材料和试剂

离心管15毫升和50毫升
反应管1.5毫升
Parafilm
70％乙醇
双蒸水（ddH2O）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
不含谷氨酰胺的DMEM / F-12（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21331020）
4％多聚甲醛（PFA）在0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4中
1. PFA（Merck，目录号：1040051000）
2. 磷酸二氢钠（Merck，目录号：1063421000）
3. 磷酸氢二钠二水合物（Acros Organics，目录号：343810025）
4. 氢氧化钠（NaOH）（Carl Roth，目录号：6771）
生长介质（见食谱）
1. Neurobasal培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21103049）
2. B-27补充物（50x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17504044）
3. Pen / Strep 100,000U / ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：15140122）
4. GlutaMAX TM补充物（100×储备液）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：35050061）

火抛光移液器
1. 玻璃巴斯德吸管（1毫米直径）
涂层
1. 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）（Sigma-Aldrich，目录号：P7280）
2. 层粘连蛋白（Roche Diagnostics，目录号：11243217001）
大脑解剖
培养皿（直径10厘米）
SVZ组织解离
1. 培养皿（直径6厘米）
2. 手术刀（＃10）（Fisher Scientific，目录号：11995756）
  制造商：B.BraunMelsungen，目录号：5518059。
3. Falcon40μm细胞过滤器（Corning，Falcon ，产品目录号：352340）
4. 0.05％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300054）。
5. 含有DNAse I的胰蛋白酶抑制剂（见食谱）
  1. 胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：T6522）
  2. DNA酶I（Roche Diagnostics，目录号：10104159001）
DG组织解离
1. 培养皿（直径6厘米）
2. Falcon40μm细胞过滤器（Corning，Falcon ，产品目录号：352340）
3. 神经组织解离试剂盒（P）（Miltenyi Biotech，目录号：130-092-628）
4. β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M7522）
  注：此产品已停产。
5. Hank's缓冲盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14175）
单层文化
1. 组织培养瓶（T25和T75）
2. 24孔组织培养板（生长增强处理，γ消毒，不含热原，不含RNA / DNA，DNA酶，核糖核酸酶）
3. 盖玻片滑动12毫米（Fisher Scientific，目录号：12-545-82）
  注：此产品已停产。
4. 肝素（MP Biomedicals，目录号：0210193125）
5. 人类EGF（PeproTech，产品目录号：AF-100-15）
6. 人类FGF2（PeproTech，目录号：100-18B）
7. Accutase溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A6964）
8. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
9. 正常的驴血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：017-000-121）
10. 台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：15250061）
11. BrdU（Sigma-Aldrich，目录号：B5002）
12. 冷冻混合（见食谱）
13. 抗体溶液（见食谱）
神经球测定
1. 培养皿（直径10厘米）
2. 96孔组织培养板（生长增强处理，γ消毒，不含热原，不含RNA / DNA，DNA酶，核糖核酸酶）
3. 24孔组织培养板（生长增强处理，γ消毒，不含热原，不含RNA / DNA，DNA酶，核糖核酸酶）
4. 盖玻片滑动12毫米（Fisher Scientific，目录号：12-545-82）
5. 肝素（MP Biomedicals，目录号：0210193125）
6. 人EGF（Peprotech，目录号：AF-100-15）
7. 人类FGF2（PeproTech，目录号：100-18B）
8. 阻止解决方案（见食谱）

染色剂

显微镜载玻片SuperFrost®（VWR，Thermo Scientific，目录号：631-0706）
Triton X-100（Carl Roth，目录号：3051）
1N HCl（来自37％储备液）（Sigma-Aldrich，目录号：435570）
注：此产品已停产。
0.9％NaCl
正常的驴血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：017-000-121）
Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：62249）
一抗（见表1）
Aqua-Poly / Mount（Polysciences，目录号：18606）

硼酸盐缓冲液（见食谱）

硼酸（Carl Roth，目录号：6943.1）

氢氧化钠（NaOH）（Carl Roth，目录号：6771）

表1.用于免疫细胞化学的一级抗体

Antibody	Host	Clone	Isotype	Company	Catalog number
β-III-tubulin (β-tubulin)	Mouse	5G8	IgG1	Promega	G7121
5’-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU)	Rat	BU1/75 (ICR1)	IgG2a	Bio-Rad Laboratories	OBT0030
Glial fibrillary acidic protein (GFAP)	Rabbit	polyclonal	-	Agilent Technologies	Z0334
Map2ab	Mouse	AP-20	IgG1	Sigma-Aldrich	M1406
Nestin	Mouse	25/NESTIN	IgG1, κ	BD	611658
Oligodendrocyte marker 4 (O4)	Mouse	O4	IgM	R&D Systems	MAB1326
Sox2	Rabbit	polyclonal	-	Merck	AB5603

设备

本生燃烧器
高压灭菌器
解剖工具
1. 剪刀
2. 小铲子（精细科学工具，目录号：10093-13）
3. 弧形镊子（Fine Science Tools，型号：Dumont＃7，产品目录号：11271-30）
4. 有角度的镊子（Fine Science Tools，型号：Dumont＃5-45，目录号：11253-25）
5. （B.BraunMelsungen，目录号：4657705-02）
真空泵
立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZ61）
倒置显微镜（奥林巴斯，型号：CKX42）
用15毫升和50毫升离心管（Eppendorf，型号：5430 R）的摆动斗转子离心。
37℃，5％CO 2
培养箱
无菌层流罩
血细胞计数器（Neugebauer改进）
荧光显微镜（ZEISS，型号：Axio Imager.M2）
冷冻容器，Frosty TM先生（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Frosty TM先生，产品目录号：5100-0001 ）
37°C水浴
-80°C冷冻机
移液器
多级移液器（和提示）

程序

一般准备
细胞培养皿的涂层
单层培养物以及神经球的分化需要聚-D-赖氨酸（PDL）/层粘连蛋白涂覆的表面进行附着。
1. 加入适量的PDL（ddH2O中5μg/ ml），并确保表面或盖玻片完全覆盖（体积见表2）。
2. 在室温下孵育至少4小时或过夜
3. 去除溶液并用ddH 2 O清洗容器三次。
4. 让它们适当干燥，直到没有残留的水。
5. 加入层粘连蛋白（5毫克/毫升冷DMEM / F-12）孵育至少4小时或37°C过夜。
6. 直接使用它们或将其储存在-20°C直到需要。
火抛光移液器
在隔离过程中，需要具有小或中等大小的孔的火焰抛光移液器。
1. 在本生灯的热蓝色火焰上旋转玻璃巴斯德吸液管约3秒，直到边缘变圆。小巴斯德移液管显示内径为0.3-0.4毫米，而中等大小的移液管孔大小为0.6-0.8毫米。
2. 移液器应在使用前进行高压灭菌。
大脑解剖
注意：单层培养需要涂层的24孔板，应至少在分离前两天准备好。
神经前体细胞分离的方案基于Babu等人的方案。（2011），Walker和Kempermann（2014）（其中还包括解剖程序视频）以及Ehret et al。（2016）。可以使用一个小鼠/神经球实验（每个96孔板）进行神经球测定。单层培养也可以使用一只小鼠产生，但是我们建议将3-4个脑组合起来。
1. 麻醉6-8周龄的老鼠根据适当的制度指导。执行颈椎脱臼。
2. 用70％乙醇喷头消毒，并减少毛皮附着在解剖工具和组织上。
3. 使用锋利的剪刀将脑干基部的动物斩首
4. 沿着中线纵向切开皮肤，直到眼睛之间的一点。暴露头骨。
5. 将一把小小的剪刀插入每个眼腔中，以在眼睛之间进行颅骨的冠状切割。之后，在颅底做两个侧切，然后沿着矢状缝进行纵切。
6. 用一把镊子将颅骨剥去，露出大脑
7. 使用小铲子从颅骨中取出大脑，并将其放入冷PBS中。
8. 将大脑转移到含有PBS的10cm塑料培养皿中（见图1B）。
9. 将培养皿放在低倍镜下的立体显微镜下，将大脑置于腹面。用小角钳取出嗅球，小脑保持大脑正常。
SVZ解剖
1. 将大脑旋转到背侧，使用手术刀在视交叉区域进行冠状切割（见图1C）。
2. 对于SVZ的显微切割（更多细节请参阅Azari等人（2010）和Walker和Kempermann，2014），使脑部的头侧部分暴露切割的冠状面的侧脑室。增加放大倍率，使用细弯钳除去和去除隔膜。
3. 通过将一对细弯钳中的一个刀片的尖端放置在紧靠胼os体的侧脑室的侧角并且另一个大致1mm进入紧邻心室的组织中来解剖SVZ。将钳子向下压向盘基部和心室的腹侧以去除小的三角形组织（参见图1E）。将解剖的组织放入冰上的小培养皿中。
DG解剖
1. 对于DG的显微切割（更多细节参见Hagihara等人（2009）和Walker和Kempermann，2014），将大脑的尾部置于培养皿中并使用手术刀切割纵向裂缝（见图1D）。
2. 用小角钳小心地去除小脑和间脑
3. 重新调整显微镜的焦距以显示DG周围的边界。要卸下DG，请使用27 G¾针，并小心地沿着DG和Ammons喇叭之间的边界滑动。
4. 使用细角钳将周围组织中的DG释放（见图1F）。将解剖的组织放入10μlPBS冰上的小培养皿中。
SVZ组织解离
1. 在15ml离心管中，在37℃的水浴中预热1ml的0.05％胰蛋白酶-EDTA 10-15分钟。
2. 用6厘米培养皿中的解剖刀切碎SVZ组织约1分钟（见图1G）。
3. 将组织碎片转移到温热的胰蛋白酶-EDTA中并在37℃孵育7分钟。
  轻轻颠倒管道轻轻混合
4. 通过加入1毫升含有DNaseI的胰蛋白酶抑制剂（参见食谱）停止酶反应，并轻轻地搅拌混合。
5. 在300×g离心5分钟
6. 使用P1000移液器小心吸取7-10次，轻轻地将沉淀重悬于1ml生长培养基中（见食谱）（见图1H）。
  注意：为了增加细胞死亡，非常温和地研磨组织非常重要。
7. 加入多达5毫升的生长培养基，并通过一个40微米的细胞过滤器细胞悬液进入一个50毫升的离心管。
8. 在300×g离心5分钟
9. 重悬细胞悬液在500μL的生长培养基。
DG组织解离
注意：可以从一只动物获得的细胞的平均产量取决于动物的年龄以及应变。但是，为了提供一个粗略的估计，我们通常从一只8周龄的C57BL / 6J动物中获得约100,000-200,000个细胞/ ml。
为了从分离的DG组织获得单细胞悬浮液，含有木瓜蛋白酶的神经组织解离试剂盒（P）如下应用：
1. 为了制备酶混合物1，将1,900μl缓冲液X和50μl酶P（均在试剂盒中提供）加入到15ml离心管中。为了增加酶的稳定性和细胞活力，向缓冲液X中加入β-巯基乙醇至终浓度为0.067mM。
2. 预热酶混合物1在37℃的水浴中10-15分钟。
3. 用解剖刀在6厘米培养皿中解剖DG组织约1分钟（见图1G）。
4. 将组织块转移到1,950μl预热的酶混合物1中。
5. 在37°C孵育15分钟，每3-5分钟轻轻搅拌一次
6. 准备酶混合2通过添加20μL的缓冲液Y到10μL的酶A（都在试剂盒中提供）。
7. 将酶混合物2添加到组织酶混合物中。
8. 用火焰抛光的巴斯德吸管用中孔轻轻吹打上下吸取组织，机械分离组织。
  注意：为避免细胞死亡增加，非常温和地研磨组织非常重要。
9. 在37°C孵育10分钟，每3-5分钟轻轻搅拌一次
10. 进一步使用小口径火焰抛光巴斯德吸管通过上下轻轻移液10次（见图1I），机械地分离组织。
11. 要洗细胞悬液，添加汉克的缓冲盐溶液达10毫升。
12. 在300×g离心5分钟
13. 用500μl生长培养基重悬沉淀，适用于置于50ml离心管中的40μm细胞过滤器。
  
  图1.从SVZ和DG分离神经前体细胞A.需要的工具; B.孤立的大脑; C.使用手术刀在视交叉区域切除大脑的冠状动脉; D.切开纵向裂隙; E.解剖SVZ组织; F.解剖DG; G.用解剖刀切碎组织; H.重悬SVZ组织; I.酶促孵育后的DG组织。
单层文化
从原代细胞建立单层培养物，然后在增殖条件下将其作为贴壁细胞培养数代（图2A）。这导致相当均匀的文化，可用于执行单细胞分析。

图2.来自成年小鼠脑的神经前体细胞可以作为贴壁单层培养物（A）或作为神经球（B）培养。比例尺= 50微米。

培养
1. 添加20ng / ml FGF2,20ng / ml EGF和2μg/ ml肝素至从组织解离获得的生长培养基中的单细胞悬浮液中。
2. 将细胞悬浮液接种到24孔板的涂层孔中。
3. 接种后24小时，取出生长培养基，并用含有生长因子（20ng / ml FGF2,20ng / ml EGF和2μg/ ml肝素）的新鲜生长培养基交换。
  注意：如果单元格似乎没有充分连接，则可以跳过此步骤。
4. 24小时后，用预热的PBS洗涤细胞并添加具有生长因子（20ng / ml FGF2,20ng / ml EGF和2μg/ ml肝素）的新鲜生长培养基。
5. 每隔一天，用含有100％生长因子的新鲜生长培养基交换50％旧生长培养基以抵消残余培养基中的生长因子消耗（例如，对于含有5ml的T25烧瓶培养基中，取出2.5ml，加入含有40ng / ml EGF和FGF2和4μg/ ml肝素的2.5ml新鲜培养基）。
6. 一旦细胞达到70-80％汇合，取出介质，并用PBS洗一次。
  注意：这可能需要两周时间。
7. 加入150μl的Accutase，37°C孵育3分钟。
8. 强力地将钢板轻轻敲击表面以及侧面，以便搅动连接的电池。
9. 检查显微镜下如果细胞分离。如果没有，延长孵化时间（最多10分钟）。
10. 向细胞悬浮液中加入2ml生长培养基，并在300×g下旋转3分钟以沉淀细胞。
11. 取出上清液，并在1毫升生长培养基中重悬细胞。
12. 取出10微升的细胞悬液，并与10微升的台盼蓝混合。
13. 用血细胞计数器计数细胞。
14. 以最小密度种植细胞。在具有生长因子（20ng / ml FGF2和20ng / ml EGF;不再含有肝素）的生长培养基中培养1×10 4个/ cm 2。
进一步传代（一旦细胞达到70-80％汇合，通过）
1. 取出培养基，用PBS清洗一次。
2. 加入Accutase并在37°C孵育3分钟。
3. 强力地将钢板轻轻敲击表面以及侧面，以便搅动连接的电池。
4. 检查显微镜下如果细胞分离。如果没有，延长孵化时间（最多10分钟）。
5. 将细胞收集在4.5ml生长培养基中（体积为T25烧瓶），并在300xg下旋转3分钟以沉淀细胞。
6. 加10μl台盼蓝至10μl细胞悬液，用血细胞计数器计数细胞。
7. 以最小密度种植细胞。（20ng / ml FGF2和20ng / mlEGF）的生长培养基中培养1×10 4 c / cm 2（活细胞）。
冷冻
1. 准备冷冻混合物（见食谱），并在4°C储存。
2. 从烧瓶/平板上移除生长培养基，并用5毫升PBS洗。
3. 加入Accutase到培养瓶/培养板中，在37°C孵育3分钟，检查是否所有细胞都脱落。如果没有，延长孵化时间（最多10分钟）。
4. 将细胞收集在4.5ml生长培养基中（体积为T25烧瓶）并在300xg下旋转3分钟以沉淀细胞。
5. 去除上清液。
6. 重悬细胞在1毫升的生长介质。
7. 加入10μl台盼蓝到10μl细胞悬液。
8. 计数细胞并用生长培养基调整细胞密度至2×10 6 c / ml（活细胞）。
9. 每个冷冻小瓶加入0.5毫升的冷冻混合物
10. 每个冷冻小瓶加入0.5毫升的细胞悬液，混合，并放入冷冻容器。
11. 将冷冻容器直接放在-80°C冷冻箱中。
12. 12小时后，可将小瓶转移到液氮中。
在增殖条件下进行细胞接种和细胞特征分析（图3）
注意：为了分析增殖条件下的细胞特征，细胞可以在接种后48小时直接固定或用BrdU标记。

图3.在增殖条件下的单层培养物A.在增殖条件下的单层培养物表达神经系统的祖细胞例如巢蛋白（绿色）和Sox2（洋红色）的细胞标记物。 B.可以通过检查相对于细胞总数（Hoechst 33342，蓝色）的经历S-期的细胞部分（BrdU标记，绿色）来标记祖细胞以评估其增殖能力。比例尺= 50微米。
1. 解冻PDL /层粘连蛋白包被板（带盖玻片的24孔板）在37℃约15分钟。
2. 从24孔板中取出层粘连蛋白
3. 在增殖条件下（在培养基中添加20ng / ml EGF和20ng / ml FGF2），将20,000个细胞/孔平板涂布在24孔板孔中的涂布的盖玻片上。
4. 孵育48小时。
5. 将BrdU（终浓度10μM）加入到每个孔中，并在37℃孵育2小时。
  注意：如果不需要BrdU标签，则跳过此步骤并继续执行步骤6.
6. 去除培养基，在0.1M磷酸盐缓冲液中加入4％PFA到每个孔中并在室温下孵育20分钟。
7. 用PBS清洗两次，加入1毫升新鲜的PBS到井中。
8. 在4°C储存，直到进行染色。为了避免蒸发，用Parafilm密封板。
细胞接种和分化（图4A）
1. 解冻PDL /层粘连蛋白包被板（带盖玻片的24孔板）在37℃约15分钟。
2. 从24孔板中取出层粘连蛋白，用PBS洗板。
3. 在增殖条件下（在培养基中添加20ng / ml EGF和20ng / ml FGF2），将20,000个细胞/孔平板涂布在24孔板孔中的涂布的盖玻片上。
4. 孵化48小时。
5. 去除生长培养基，并添加含有5ng / ml FGF2的新鲜生长培养基。
6. 再过48小时后，取出生长培养基，加入不含生长因子的新鲜生长培养基。
7. 让细胞分化3-5天。
的固定
1. 删除生长介质。
2. 在每孔中加入300μl4％PFA的0.1M磷酸盐缓冲液并在室温下孵育20分钟
3. 用PBS清洗两次，加入1毫升新鲜的PBS到井中。
4. 在4°C储存，直到进行染色。为了避免蒸发，用Parafilm密封板。
染色
注意：步骤1-4只需要BrdU染色，其他染色直接从步骤5开始。
1. 用0.9％NaCl洗2次。
2. 用1N HCl在37℃孵育30分钟
3. 用硼酸盐缓冲液清洗1次（见食谱）。
4. 用PBS冲洗3次10分钟。
5. 用0.1％Triton X-100在PBS中透化10分钟。
6. 室温封闭溶液1小时
7. 在室温下用抗体溶液孵育1小时（参见表1）2小时，否则在4℃孵育过夜（300μl/孔）。
8. 用PBS洗3次。
9. 在室温下（300μl/孔）在黑暗中用稀释在抗体溶液中的适当的二抗（参见食谱）孵育1小时。
10. 用PBS清洗10分钟。
11. 孵育Hoechst 33342（1：4,000的PBS）10分钟在室温在黑暗中。
12. 用PBS洗1次。
13. 在ddH 2 O中浸洗。
14. 通过轻轻拍打薄纸干燥盖玻片，并使用荧光固定介质进行安装。
15. 在黑暗中过夜。
16. 在4°C储存。
17. 使用荧光显微镜的图像。
神经球分析
神经球培养很容易产生，并允许直接的数据分析方面的前体细胞数量和潜力的脑组织从个别小鼠（图2B）。
文化
注意：神经球在另外含有2μg/ ml肝素的生长培养基中培养
1. 稀释从20毫升含20ng / ml FGF2,20ng / ml EGF和2μg/ ml肝素的神经球生长培养基中获得的单细胞悬浮液。
2. 使用10 ml多步骤移液器，在96孔板上每孔平板200μl
3. 培养7天SVZ衍生的神经球培养物和DG衍生的神经球培养物12天在37℃。
  注意：延长孵育时间可能导致过度生长，并可能导致神经球核心中的自发附着，分化或细胞死亡。
4. 使用倒置光学显微镜计数和大小的神经球。
微分（图4B和4C）
注意：对于一个实验，我们建议每个96孔板至少播种4个随机大小的神经球的盖玻片。
1. 解冻PDL /层粘连蛋白包被板（带盖玻片的24孔板）在37℃约15分钟。
2. 从24孔板中取出层粘连蛋白，用PBS洗板。
3. 加入1毫升的生长培养基
4. 将含有神经球的培养基从96孔板的所有孔中收集到10厘米培养皿中。
5. 使用立体显微镜用P100移液管（终体积75μl）从培养皿中收集神经球，并将它们转移到24孔板的盖玻片上。每盖玻片，我们建议种子约15个神经球。
6. 在37°C的培养箱中分化神经球7天。这些细胞将在盖玻片上扩散并变得粘附。
  
  图4.单层培养物和神经球可以分化A.单层培养的分化细胞与GFAP阳性星形胶质细胞（绿色）和Map2ab阳性神经元（洋红色）。 B.用β-III-微管蛋白阳性神经元（品红）和GFAP阳性星形胶质细胞（绿色）分化的神经球培养物。 C.用O4阳性少突胶质细胞分化的神经球培养物（红色）。比例尺= 50微米。
的固定
1. 取出培养基，用PBS洗2次，去除死细胞和碎片。
2. 在每孔中加入300μl4％PFA的0.1M磷酸盐缓冲液并在室温下孵育20分钟
3. 去除PFA，用PBS洗两次。
4. 在4°C储存在1毫升PBS。为了避免蒸发，用Parafilm密封板。
染色
注意：使用推荐的O4抗体进行染色时，请勿将Triton加入封闭液和抗体溶液中，并使用合适的IgM二抗。
1. 用含有2倍分化的神经球的盖玻片清洗
2. 在室温下孵育含有0.2％Triton X-100封闭液（参见食谱）30分钟的盖玻片。
3. 在含有0.2％Triton X-100的抗体溶液中，在室温下（300μl/孔）与针对神经元和星形细胞标记物或少突神经胶质细胞标记物O4（参见表1）的一级抗体孵育1小时。
4. 用PBS洗4次。
5. 在室温下避光孵育30分钟，加入含有0.2％Triton X-100的抗体溶液（300μl/孔）。
6. 用PBS洗2次。
7. 孵育Hoechst 33342（1：4,000的PBS）10分钟在室温在黑暗中。
8. 用PBS洗2次。
9. 在ddH 2 O中浸洗。
10. 将盖玻片安装在带有荧光固定介质的显微镜载玻片上，在黑暗中风干一夜。
11. 在4°C储存。
12. 使用荧光显微镜的图像。
细胞培养体积和密度（表2）

表2.细胞培养体积和密度

数据分析

在神经球测定中，神经球的大小和数量可以被确定，并用作前体细胞增殖潜力的间接测量，例如在不同的外部刺激或处理的影响下，或在不同的遗传背景之间。神经球进一步允许分析球形细胞的分化潜能。这可以通过Hoechst 3342（DAPI）染色确定的细胞总数中Map2ab /β-III-微管蛋白和GFAP阳性细胞的百分比来量化。神经球测定不能得出关于绝对干细胞数量的结论。
此外，对于生物学复制，我们建议进行神经球测定实验至少5次作为技术重复，因为可能会有一些日常的差异，我们总是强烈建议在同一时间进行控制和治疗实验，以尽量减少一个批处理效果。
根据具体的实验设置，数据分析使用学生的检验或方差分析结合适当的事后检验进行。
基于单层培养的实验可以评估单细胞水平上的特征。 BrdU数据通过评估在BrdU存在的情况下通过S-相的细胞的数量作为间接测量细胞增殖潜力的量度。对于分化实验，分析Map2ab /β-III-微管蛋白阳性细胞和GFAP阳性细胞的数量，作为通过Hochest33342（DAPI）染色测定的细胞总数的百分比。我们建议在相同的盖玻片上同时进行两种染色以获得可比较的结果。对于一个分化实验，我们分析四个盖玻片，并采取随机位置上的每个盖玻片至少五个图像来计数细胞。
请注意，冻融循环和传代事件可能会影响细胞和结果数据。因此，在同一段落中进行实验以及对经过类似处理的细胞进行实验，以获得可再现的数据至关重要。我们建议执行至少五个技术重复。数据分析是根据学生的实验设置，使用Student's test或者ANOVA结合适当的post-hoc test进行的。

食谱

含有脱氧核糖核酸酶I的胰蛋白酶抑制剂
0.125毫克/毫升胰蛋白酶抑制剂
0.01毫克/毫升DNase I
在没有谷氨酰胺的DMEM / F-12中
生长介质
神经基础培养基
0.5％B-27补充剂（50x）
0.25％Pen / Strep 100,000 U / ml
0.25％GlutaMAX TM（100x股票）
冻结介质
生长介质
20％DMSO
硼酸盐缓冲液
硼酸
ddH 2
10N氢氧化钠调节pH至8.5
抗体解决方案
1x PBS
3％正常驴血清
阻止解决方案
1x PBS
10％正常驴血清

致谢

作者宣称没有竞争的经济利益。这项工作是由德国联邦银行SFB655和德国联邦理工学院联合资助的。图像采集和处理使用DZNE德累斯顿成像平台的设备。我们感谢Fanny Ehret博士对稿件的有益评论。这里描述的协议代表了Babu等人（2011），Walker和Kempermann（2014）和Ehret等人描述的协议的变化和进一步发展。（2016）。

参考

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Babu，H.，Claasen，J.H.，Kannan，S.，Runker，A.E。，Palmer，T。和Kempermann，G。（2011）。从小鼠齿状回分离和富集单层培养神经前体细胞的方案
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Ehret，F.，Vogler，S。和Kempermann，G。（2016）。神经球共培养实验。 Bio Protoc e1883。
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Horster，H.，Garthe，A.，Walker，TL，Ichwan，M.，Steiner，B.，Khan，MA，Lie，DC，Nicola，Z.，Ramirez-Rodriguez，G.and Kempermann，）。 p27kip1是功能相关的成年海马神经发生所必需的。 >干细胞 35（3）：787-799。
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