材料和试剂

无菌吸头，1,000μl（Corning，目录号：9032）
无菌过滤枪头，10μl（Corning，目录号：4807）
无菌Falcon 6孔平底板（Corning，Falcon ，目录号：353046）
羽毛81-S剃刀刀片（Dominique Dutscher，目录号：711164B）
制造商：羽毛安全剃刀，型号：81-S。
手术刀片N°10（Dominique Dutcher，产品目录号：132510）
无菌50毫升无菌猎鹰管（康宁，目录号：430290）
无菌培养皿，35毫米（Corning，Falcon ，产品目录号：351008）
用于细胞培养的无菌移液管5ml Falcon（Corning，Falcon ，目录号：356543）
无菌Whatman纸张（用于海马切片过程）（GE Healthcare，目录号：10347510）
无菌PTFE板60 x 60 x 5 mm用于小脑切片（ePlastics，0.250“PTFE板12”x 12“）
孔径为0.22μm的无菌注射器过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGV033RS）
无菌Millicell细胞培养插入物，30mm，亲水PTFE，0.4μm（EMD Millipore，目录号：PICM0RG50）
96孔，白色平板带盖透明底（康宁，目录号：3610）
猎鹰12孔平底板（Dominique Dutscher，目录号：064023）
幻灯片和盖玻片
过滤装置Stericup GP Millipore，孔径0.2μm（EMD Millipore，目录号：SCGPU05RE）
针（Hamilton Bell，目录号：6980）
出生后第6天至第10天（男性和/或女性）新生鼠（鼠，大鼠，仓鼠）
注意：根据我们的经验，动物的性别并不影响我们的结果，但是在使用其他病毒而不是MeV的时候应该认真考虑这个参数。
病毒实例：编码增强型绿色荧光蛋白（MeV-EGFP-1.10×10 7 pfu / ml）的重组麻疹病毒（IC323菌株）
70％乙醇
盐酸氯胺酮（MWI Animal Health，NDC 13985-584-10）
碘化丙啶溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4864）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）1x，无钙/镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190094）
AlarmarBlue细胞活力试剂储备液10x（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：DAL1025）
在BPS 1/700使用的抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）兔多克隆（Agilent Technologies，Dako，目录号：Z0334）
在BPS中以1/500使用的抗NeuN兔多克隆（EMD Millipore，目录号：ABN78）
在BPS 1/700使用的抗Calbindin D-28K兔多克隆（Swant，目录号：CB38）
在BPS 1/250处使用的抗Iba1（Wako Pure Chemical Industries，目录号：019-19741）
在BPS中1/200使用的抗olig2（少突胶质细胞谱系转录因子2）（R＆amp; D Systems，目录号：AF2418）
在BPS中以1/750使用的抗兔IgG Fab2 Alexa Fluor 488（Cell Signaling Technology，目录号：4412S）
在BPS中以1/750使用的抗山羊IgG（H + L）交叉吸附的第二抗体Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11055）
在BPS中以1/750使用的抗兔IgG Fab2 Alexa Fluor 555（Cell Signaling Technology，目录号：4413S）
Fluoprep（生物梅里埃，目录号：75521）
Opti-MEM减少血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：31985062）
RNA提取试剂盒NucleoSpin RNA（MACHEREY-NAGEL，目录号：740955.250）
475ml（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：7002）
iScriptTM cDNA合成试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-8891）
绿色qPCR SuperMix-UDG w / ROX（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：11744500）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266-1KG）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045-1KG）
适用于细胞培养的盐酸溶液（HCl），1.0 N BioReagent（Sigma-Aldrich，目录号：H9892-100ML）
重组人胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：91077C-100MG）
最低必需培养基（MEM），HEPES，GlutaMAX TM补充物，500ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：42360081）
热失活的马血清，100ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：26050070）
D-葡萄糖细胞培养级5g / L（Sigma-Aldrich，目录号：G7528）
犬尿酸（Sigma-Aldrich，目录号：K3375-5G）
HEPES 1M，100ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15630080）
Hibernate-A培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：A1247501）。
结晶PFA（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
胎牛血清（FBS），500毫升（Eurobio，目录号：CVFSVF0001）
Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
1 M MgCl 2溶液（见食谱）
0.1N NaOH溶液（见食谱）
人胰岛素50毫克/毫升（见食谱）
器官型大脑培养基（见食谱）
10倍犬尿酸溶液（见食谱）
解剖介质（见食谱）
8％多聚甲醛（PFA）（见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）（见食谱）
阻断和透化溶液（BPS）（见食谱）

设备

直镊子，类型N°5长度11厘米去除皮肤和头骨（多米尼克Dutscher，目录号：005092）
冰容器
5％CO 2培养箱中保持在37℃和潮湿的气氛下（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Series 8000 Water-Jacketed，目录号：3423） br />
生物安全柜
注意：建议在水平流罩中进行切片制备，BSL2垂直流罩用于BSL2病原体和感染后续病毒感染步骤。但是，如果BSL2机柜上的保护玻璃可以维持，切片可以用同样的方法准备。根据我们的经验，即使在这些条件下无菌性保存得不好，污染率仍然很低。在任何情况下，生物安全水平必须根据病毒感染病毒（BSL2，BSL3或BSL4）进行调整，并采取后续步骤。
不锈钢解剖剪刀长度11厘米（多米尼克Dutscher，目录号：005064）
烧杯，250毫升
McIlwain组织砍刀（Campden Instruments，型号：TC752）
吸管灯泡（Fisher Scientific，目录号：03-448-29）
不锈钢解剖剪刀超细长度12厘米切割和删除头骨（多米尼克Dutscher，目录号：005068）
Dumont镊子＃5用于解剖大脑和去除脑膜，0.1 x 0.06，Dumoxel（世界精密仪器公司，产品目录编号：14098）
不锈钢镊子圆形末端长度130毫米，用于在解剖过程和切片分离期间保持大脑（Dominique Dutscher，目录号：442256）
Lanceolate尖抹刀去除中脑（imLab，目录号：NE010）
弯曲的镊子类型N°7长度11厘米为中脑去除并且从培养插入物收获切片（多米尼克Dutcher，编目：005093）
P1000移液器（Gilson，目录号：F123602）
P20 Pipetman（Gilson，目录号：F123600）
用于切片分离的KOLLE持针器（Hamilton Bell，目录号：6780）
水浴
具有冷却单色照相机（Photometrics，型号：CoolSNAP HQ2）和用于碘化丙锭的荧光过滤器组（例如：激发550-580nm，发射600-660nm）的Widefield荧光显微镜（ZEISS，型号：Axioplan 2） />
Tecan Infinite <200> PRO系列读板机（Tecan，型号：M Plex）
共聚焦光谱显微镜（徕卡，型号：徕卡TCS SP5）
TPersonal 48热循环仪（Analytik Jena，Biometra，型号：T-Personal 48，目录号：846-050-551）
StepOnePlus TM实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：StepOnePlus TM，目录号：4376600） >
解剖的立体显微镜（徕卡，型号：徕卡LED2000）
通风柜
-20°C冷冻机
-80°C冰箱

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ [Schneider et al。，2012]）与Gabriel Landini的插件“Auto Local Threshold”（ http://fiji.sc / Auto_Local_Threshold＃安装）
注意：斐济（ http://fiji.sc/ 可以使用[Schindelin et al。，2012]代替ImageJ，因为它捆绑了所需的插件。下载宏文件'OBC_IP_mortality.ijm'来分析碘化丙啶染色。将文件保存在ImageJ / plugins文件夹中。插件菜单中会出现“OBC IP死亡率”。
GraphPad Prism（GraphPad软件 - https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）和/或R软件（ https://www.r-project.org/）
StepOnePlus软件（ https://www.thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/software-downloads/StepOne-and-StepOnePlus-Real-Time-PCR-System.html ）<无线电通信/>

程序

培养板制备
1. 切片脑外植体前一天，准备6孔培养板加入1毫升器官型培养基（见食谱）到每个井中，并放置在顶部使用直镊子培养插入，以扭转聚四氟乙烯的疏水性和允许切片的良好喂养（表1）。
  
  表1.每个步骤建议的持续时间
2. 在37℃潮湿的5％CO 2气氛中将平板培养过夜。
解剖准备
1. 如果有的话，使用70％的乙醇水溶液对生物安全柜的墙壁和地板进行净化，并照射紫外线15分钟。
2. 在解剖过程之前，用高压灭菌器对所有的设备，即剪刀，镊子，PTFE板进行消毒，并将其放在生物安全柜的下面。准备一个用70％乙醇水溶液半杯的烧杯，以便在手术过程中去除清洁物质（表1）。
3. 用70％的乙醇清洁组织切碎机，剃刀刀片和立体显微镜，确保切片平台正确的去污，然后让一切干燥。使用螺丝和螺母将刀片安装在组织切碎机上，然后将仪器放在生物安全柜内，再用乙醇喷雾（表1）。
4. 在生物安全柜下放置一个装满冰块的灭菌容器。
5. 准备解剖介质（见食谱）“食谱”部分中描述使用无菌50毫升锥形管。在35毫米培养皿底部放置6毫升培养基（1个海马培养皿，1个培养皿小脑），并保持解剖的盖子。解剖介质必须保持在冰上，整个解剖过程必须在4°C（冷的介质）进行，以限制组织损伤和细胞变性。
6. 用5毫升解剖介质填满培养皿盖，以便在整个切片过程中获得冷的新鲜培养基。
7. 用手术刀切除5毫升塑料移液管的圆锥形末端，然后将带有梳理棉的顶部插入移液器球管（定义为5毫升截头移液管）。
解剖和切片程序
注意：
1. 每个步骤的持续时间请参阅表1。
2. 表2总结了故障排除和建议的解决方案。
1. 用70％乙醇轻轻喷雾动物的颈部和头部，并迅速进行下一步骤。
2. 我们建议使用6到10天的动物。由于颈椎脱臼不适合哺乳动物，应使用剪刀进行断头处理。这个行动必须由熟练的认可人员来执行。在这个阶段，有必要尽快开展工作。
  注意：
  1. 当动物产生少量的婴儿时，哺乳动物可能更大，而且斩首更加困难。为了防止潜在的疼痛并为实验者提供更舒适的手术，可以使用麻醉剂。我们推荐使用150mg / kg剂量的氯胺酮，这是一种有效的活化依赖的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体通道阻滞剂，导致兴奋性毒性的降低并防止神经元死亡。与解剖介质中含有的犬尿酸组合，氯胺酮提供了良好的抗兴奋性神经保护作用。
  2. 来自年轻动物（P3到P6之间）的脑更难以切成规则的平行切片，因为它们更柔软。另外，许多具有迁移特性的非完全分化细胞可能改变感染实验的重现性。大龄动物的大脑（P10到P12以外）很不适合，因为增加的细胞死亡可能增加分析的偏倚。
  3. 这个程序必须遵循当地的动物伦理规程，并且必须提及使用的物种和菌株。
    
    在任何试验之前，物种的任何变化都必须根据道德协议进行修改和验证。
3. 将头部握在拇指和指甲之间，用超细剪刀尽可能地去除皮肤和肉。
4. 用超精细剪刀的尖端将头骨从可见的脊髓顶部的空腔切开到含有嗅球的空腔。
5. 将Dumont镊子的尖端插入嗅球下方，从头部取出大脑，轻轻抬起直至从颅骨脱离。
6. 将大脑直接置于35mm培养皿中的冷的解剖介质中。在这个阶段，有必要分离和剖析解剖介质中的大脑结构，以维持细胞活力。
7. 如下分离小脑（从C16到C20的切片过程）与大脑的脑部（图1A），并在制备海马切片过程中在冷切割介质中保存（解剖和切片过程 - 从步骤C8到步骤C15）。
8. 将两个半球沿着中线分开（图1B），取出中脑（图1C），用镊子夹住半脑，使用披针尖刮刀或弯曲的镊子（每个脑需要约1分钟的适当训练）。此时，海马是可见的（箭头 - 图1D）。
9. 用手术刀切割并移除含有嗅球的嘴嘴部分（图1D-每个半球约10秒）。
10. 使用Dumont镊子＃5去除脑膜。
  海马和皮质已准备好切片过程
11. 将海马面朝下放在Whatman纸上的延伸方向上（图1E-大约需要1分钟）。
12. 把它放在McIlwain组织切碎器的切片平台上（见图1-箭头2-约需1分钟）。
13. 用5毫升截头移液器加一滴解剖介质，以防止组织粘在剃刀刀片上。
14. 通过打开仪器快速进入切片（图1E-30秒，切片两个海马）。
  注：所有切片参数，即厚度（通常在200-500μm之间），刀片力（通常为最大力）和刀片速度（通常为每秒一片）应在初步测试中确定。
15. 在切片平台上取下Whatman纸，并在组织上大量添加冷切片
16. 使用披针状尖端刮刀，通过轻轻地将刮刀的尖端在组织和纸张之间滑动，从Whatman纸上取下组织。
17. 在解剖小脑期间，将组织放回含有冷清扫介质的培养皿中。
18. 在冷剥离介质和立体显微镜下，用钳子夹住小脑，用Dumont镊子＃5，下丘和脑干（图1B'）轻轻地去除脑膜。
19. 与剃刀刀片（图1C'）相比，将矢状面上的小脑置于PTFE板上。
  注意：切片过程中的rostro-caudal平面并不重要，当切片平台上放置小脑时，可以将切片的端侧或尾端部分朝向实验者。然而，在我们的实验中，如图1A和1B'所示，小脑的尾部部分在切片过程中总是面对实验者。
20. 使用P1000移液器移除整个培养基以改善小脑对PTFE板的粘附。
21. 继续按照海马描述的切片（图1D'）。
  
  表2.故障排除表
  
  图1.从啮齿类动物的P6到P10之间哺乳的OBC制备OBC海马切片制备（A-F，左图）。 A.断头后收集大脑，用虚拟刀片用小刀片分开小脑。 B.用手术刀片分开两个半球。 C.去除中脑以暴露海马区域。 D.移除大脑的头侧部分（含有嗅球），以便可视化海马（黑色箭头）。 E.将解剖的大脑在前后轴上放置到组织切碎机（1）的切片平台（2）上并垂直切割剃刀刀片（3）并沿虚线切割。 F.依靠OBC培养基将切片分离并转移至毫微孔插入培养系统。小脑切片准备（A，B'-D'，F，右图）。 A.将小脑与其余的大脑分开。 B”。去除小脑下丘（IC）和脑干（BS）。 C'。根据前后轴将小脑置于聚四氟乙烯板上，并转移至组织切碎机的切片平台。 d”。按照虚线切断。 F.转移到含有解剖介质的培养皿中，小心地将这些切片彼此分开，并将其放在插入培养系统中。
22. 小心地将组织转移到含有冷解剖介质的培养皿中。
23. 在立体显微镜下，使用镊子小心地分离海马和/或小脑切片，以将组织和安装在KOLLE持针器上的针头放在冷的解剖介质中。主要集中在组织的顶部，切片之间的空间易于可视化，这有助于将它们精确分开（海马分片需要10到15分钟，小脑只需要5分钟）。
  注意：确保立体显微镜的光源是冷的（即光纤），以避免在切片分离过程中因介质过热而引起细胞应激。
24. 在立体显微镜下选择文化的切片。
  注意：海马应该含有CA（Cornu Ammonis）区域和齿状回。小脑应该包含深核，并且不同的细胞层例如浦肯野细胞（PC）层或分子层（ML）应该是可见的。有关更多详细信息，请参阅“大脑图谱”，例如 Allen Brain Atlas / A> 。
25. 使用安装在移液器球管上的5ml截头移液管，每Millipore细胞培养插入膜最多铺放4个海马或5个小脑切片。为了有利于切片的适当进食和氧合，在插入板上铺平板后在每个脑外植体周围尽可能多地切除介质，并在37℃，5％CO 2下在湿润大气。
文化程序
注意：
1. 在切片过程的第二天更换介质，然后每2-3天更换一次。
2. 每个步骤的持续时间请参阅表1。
1. 用镊子从6孔板上夹住插入物的边缘，用P1000移液管移除旧的培养基。
2. 将插入物放回到6孔板中，加入1ml在37℃预热的水浴中的新鲜培养基以避免热冲击。
3. 确保PTFE膜和介质之间没有气泡。如果是这样的话，将6孔板以〜45°的角度弯曲并轻轻摇动，让气泡到达培养插件的边缘。
培养的脑外植体的存活力：细胞代谢/死亡率评估-Alamarblue®和碘化丙啶染色
注意：
1. 在感染研究之前，确保脑外植体在体外是健康的并且确定可以使用切片的最佳时间窗是非常重要的。
2. 基于我们的经验，如果OBC制备保持与本方案中描述的相同，并且可以使用三个独立批次的切片进行一次全部评估，则每个时间点总共15个切片分析，可行性进展是可重现的。但是，我们建议定期评估可行性，至少采用两种方法中的一种，以确保程序仍能正确设置。
1. 在PTFE膜上轻轻剥离培养基，切除外膜边缘的切片。＆nbsp;
2. 使用截短的5毫升移液管轻轻转移到96孔板的组织。
  注意：经过长时间的培养（4〜7天）后，切片可能太粘，不能被剥离而无损伤。插入物的PTFE膜适用于荧光显微镜，并且不影响IP染色的观察，Alamarblue测定的读取和共聚焦分析（无自荧光），因此我们推荐使用这种类型的插入物来支持OBC切片。
碘化丙啶染色
1. 在96孔板中，将切片浸入200μl碘化丙啶溶液（5μg/ ml）于培养基中，37℃，5％CO 2孵育45分钟，加湿大气层。
  注：碘化丙锭进入死亡的细胞导致红色荧光核染色。碘化丙啶标记的核在整个组织表面的表面密度被用于监测细胞死亡，并为统计分析提供必要的量化（参见数据分析部分）。请注意，在染色之前不需要清洗切片。
2. 取出碘化丙锭溶液，用200μl1x DPBS（37℃）洗涤3次。
3. 将切片转移到12孔板中，并在室温下用1ml 4％多聚甲醛溶液（参见食谱）固定它们30分钟。
4. 在载玻片和盖玻片之间轻轻地切片。确保不要挤压组织，尤其是在厚切片（300和500μm）上。
5. 用宽视野荧光显微镜获取图像，每个切片至少6个随机场，每个时间点5个切片。使用5倍的目标，以获得大的视野。
6. 使用提供的Macro（ImageJ中的即，脚本）分析ImageJ中的图像。运行宏（点击插件＆gt;'OBC IP死亡率'）并按照说明操作：首先，选择要分析的图像。它将在ImageJ中以增强的显示方式打开（请参见图2）。点击切片外部的区域（如图2中黄色部分所示的区域）。如果区域太小或太大，可以调整棒工具的公差：双击ImageJ菜单中的棒工具（在图2中的红色框中），并调整公差的值默认为200）。当区域显示正确时，按T键将其保存在ROI管理器中。重复图像中的所有区域。最后，窗口应该如图3所示。
  
  图2. MacroJ ImageJ中的碘化丙啶染色分析可以方便地安排窗户。原始图像位于左侧，右侧显示增强显示。说明在底部。可以通过双击红色方块来调整魔杖工具的公差。
  
  图3.碘化丙啶染色分析的第二步。这些区域保存在绿色框架右侧的ROI管理器中。用户可以点击红色框中的“确定”。
7. 点击“OK”（见图3中的红色方块）。宏将自动分割碘化丙啶染色（使用“Auto Local Threshold”插件 https：// imagej。 net / Auto_Local_Threshold＃Bernsen ），并测量这种染色的面积和切片的面积。
8. 当过程完成时，碘化丙啶区域在图像上显示为红色覆盖层，切片区域被黄色包围，目视检查分割的结果（见图4）。可以通过在“通道”窗口中选中/取消选中通道1框来激活/取消激活红色叠加（见图4）。数据结果（碘化丙啶面积“面积”和整个切片面积“切片面积”以像素为单位，以百分比表示）显示在一张可以保存的电子表格中（更多详细信息，请参阅数据分析第3点）。可以批量分析多个图像，并将结果保存在同一个文件中：只关闭前一个图像，并以与步骤E8相同的方式再次运行宏。结果将被添加到电子表格的底部。
  
  图4.碘化丙锭染色分析的结果染色区域显示为红色。切片的区域用黄色表示。在右下角，结果表格可以通过菜单文件＆gt;另存为。
  保存
的阿尔玛蓝的 ®
1. 在96孔的白色平板中，将切片浸入培养基中的200μl1x Alamarblue 溶液中。
2. 在37℃，5％CO 2下在潮湿的气氛中培养2小时。
  注意：Alamarblue试剂与切片的细胞代谢成比例地变红，反映了活性细胞的比例，因此全球OBC健康状态。
3. 根据制造商的协议，使用Tecan Infinite 200 PRO系列酶标仪读取580-610nm的荧光发射。
4. 为了分析代谢活动，只评估动物和切片（随机）因素。我们应用了Kruskal-Wallis检验，因为数据显示违反了方差分析的假设。
5. 使用Kruskal-Wallis检验分析时间（D0，D1和D7）的死亡率（图5A和5C）和代谢活性（图5B和5D）的变化。对于每一天，使用Wilcoxon检验比较小鼠和仓鼠之间的变异系数（标准差和平均值的比率）（更多细节参见数据分析第3点）（图6）。
  注意：根据我们的经验，当两个参数中的一个超过或在前两天变化超过20％时，我们不推荐使用OBC，因为它可能极大地影响切片中细胞群的维持，它们的趋化因子反应以及结果的重现性。
  
  图5.培养14天后小鼠和仓鼠OBC活力的研究。：一种。小鼠或仓鼠（3只动物/组，每个子结构/动物至少4片）通过碘化丙啶染色评估海马和小脑切片死亡率，并用Axioplan Imager荧光显微镜分析。 B.小鼠或仓鼠（n = 3），每个子结构/动物至少3片）通过与Alamarblue试剂盒孵育评估海马和小脑切片代谢活性，并使用Infinite 200 PRO Tecan酶标仪分析。图形显示了培养期间细胞代谢（反映健康）的演变。
  
  图6.变异系数分析每天计算死亡率和代谢活性的变异系数（CV），并使用Wilcoxon检验在仓鼠和小鼠之间进行全球比较。
  小鼠和仓鼠之间在统计学上没有显着差异（ P <-value = 0.7987）。
脑外植体的免疫染色
注意：作为初步试验，我们建议在开始感染研究之前通过免疫染色来评估主要细胞群的维持（图7）以及培养过程中的结构保存（图8），以排除任何与实验者。
1. 如上所述，使用5ml截头移液管将切片放置在12孔板中并在室温下用PFA固定它们。
  注意：在感染的切片的情况下，可以直接在培养插件上进行PFA固定。培养基必须被移除，并且在培养插入物的下方和上方添加1毫升PFA以完全覆盖切片。
2. 在室温下轻轻搅拌下，用1ml阻断和透化溶液（BPS）（见配方）进行至少45分钟的阻断和透化组织。
3. 除去BPS并添加在BPS中稀释的一级抗体（Ab）（即，星形细胞标记物GFAP，神经元标记物NeuN或CB-28K-小胶质细胞标记物Iba1或少突胶质细胞标记物Olig-2，见图7）并在室温下孵育2小时（也可能在4°C下）。
  注意：
  1. 确保Ab能在BPS中存在的Triton X-100存在下结合表位。如果没有，在此步骤中取出Triton X-100，并在1×DPBS / 4％FBS溶液中洗涤3次。
  2. 通过使用48孔板，染色溶液的体积可以小至150μl。
  3. 例如，为了突出海马和小脑结构，分别使用神经元标记物NeuN（图8A）或Purkinje细胞标记物CB-28K（图8B）。 CB-28K染色减少主要是由于浦肯野细胞损失和神经元重组入脑片。然而，在第7天，仓鼠CB-28K的明显较低的染色是由于获得这个图像。事实上，这个图的所有左边的面板是与100μmz结合的瓷砖重构。由于组织的不规则形状和安装过程，即使曝光时间相同，也很难保持均匀的染色，因为整个切片的细胞密度可能不同。 >
4. 取出抗体并用1×DPBS每次清洗3次，每次10分钟。
5. 在BPS中稀释次级抗体，在室温下孵育至少2小时。
6. 重复清洗步骤。
7. 使用fluoprep安装介质在玻片和盖玻片之间安装切片注意：这一步切片还是很厚的，因此免疫染色成像必须使用共聚焦显微镜进行。
  
  图7.大脑的主要细胞类型存在并可通过免疫荧光容易地检测到。：一种。小鼠（GABA能神经元）的特征性Purkinje细胞（PC）在小鼠小脑切片中用Calbindin-28k标记在DIV0处检测到。箭头显示PC的体型;箭头显示PC的树状树，Ax指定重组PC轴突。 B.在DIV0使用特定的神经元核标记NeuN对小鼠海马神经元进行染色以揭示海马的内部组织。 C.小鼠海马星形胶质细胞已经使用DIV0处的特异性胶质细胞星形胶质细胞蛋白（GFAP）标记进行染色。 D.使用小鼠海马中的特异性标记Iba1将小胶质细胞在DIV7染色。 E.使用小鼠海马中的Olig2特异性核标记在DIV5染色少突胶质细胞。 CA1：Cornu Ammonis区域1，CA3：Cornu Ammonis区域3，DG：齿状回。
  
  图8.培养7天后小鼠或仓鼠OBC生存力的形态重排和动力学研究。：一种。在培养的第0天和第7天，将来自小鼠或仓鼠的海马切片用抗NeuN抗体（神经元标记）染色。图片显示了至少7天的海马的保守的一般组织，包括与神经元死亡相关的仅有限的细胞密度损失（白色箭头）的阿蒙氏角（Cornu Ammonis CA）区域和齿状回（DG）。 B.小鼠或仓鼠的小脑切片在培养的第0天和第7天用Calbindin28K（CB28K-Purkinje细胞标记）染色。图中的箭头显示神经元丢失，箭头显示Purkinje细胞层的中断。细胞核用DAPI复染。用Leica SP5共焦显微镜在指定的培养时间拍摄的图像显示在每天的低（在每天的重构的瓷砖左栏中）的切片内或在每天的右列的高放大率下的切片内形态演变（每天的左图中的20x物镜在每一天的右侧面板上对应于白色方块的40倍物镜）。
脑外植体的感染过程
1. 在Opti-MEM培养基中稀释病毒原液以感染具有限定数量的噬斑形成单位（pfu）的培养切片（在6孔板中）。例如，使用麻疹病毒（MeV-EGFP）10 4至4×10 4 pfu。对于模拟对照切片，应用与感染相同体积的Opti-MEM。
  注意：感染所需的剂量应通过实验确定每种病毒/脑结构/动物模型组合。
2. 使用P20移液管，在切片顶部轻轻地放置2至10μl稀释的病毒原液，并确保接种物均匀分布。
  注：如果研究需要病毒传播研究的单一入口（Ehrengruber等人，2002），则可以在此步骤使用微量注射器（具有适当的设备）。
3. 在37°C，5％CO 2的湿润环境中孵育平板
4. 在EGFP表达病毒的情况下，可以使用荧光显微镜监测病毒复制产生的荧光（图9）。
  
  图9.表达EGFP的重组麻疹病毒的OBC感染大鼠小脑切片在切片当天用2×10 4 pfu的MeV IC323-EGFP感染准备（DIV 0）。使用倒置荧光显微镜（ZEISS）和照相机（AxioCam，ZEISS），在低（A）或高放大倍数（B）下5天后观察到MeV-EGFP荧光。
通过RT-qPCR监测细胞或病毒基因表达
1. 使用弯曲的镊子，根据制造商的建议（RNA提取试剂盒-Macherey Nagel）从培养插入物中取出待分析的切片并将其置于裂解缓冲液RA1-10％2-巯基乙醇中。
2. 在处理每个切片之间，用RNase Away溶液去除RNase。
3. 用无水乙醇消毒镊子。
4. 用无RNase的水冲洗。
5. 根据Macherey-Nagel的建议，在-80℃冻结裂解物，然后使用RNA提取试剂盒进行RNA分离。
6. 使用TPersonal 48热循环仪使用iScript RT cDNA合成试剂盒准备cDNA。
7. 使用Platinum Green SYBR Green qPCR SuperMix-UDG w / ROX试剂盒，根据目标cDNA对病毒或细胞进行定量PCR。根据制造商的建议和StepOnePlus TM实时PCR系统。
8. 所有的结果都应该归一化为来自管家基因（如GAPDH）的mRNA，并在其他地方详细分析（Welsch et al。，2013）。

数据分析

免疫染色的分析需要使用共聚焦显微镜，因为OBC相对较厚，通常在150-500μm之间（图7和8）。
对于实验设计，细胞或病毒基因表达的分析需要来自分离的动物的每个条件和/或时间点的至少12个切片，即来自3个不同供体（n = 6）的2个切片，其在至少2次（n = 12）。对于免疫荧光实验，我们推荐使用来自3个不同供体的1个切片重复至少3次（n = 9）。
注意：关于生存能力和结构的进化分析，我们的结果显示，来自小鼠或仓鼠的OBC（对于大鼠也是如此 - 数据未显示）导致这些参数的类似的进化，表明我们的方案可以是与主要的实验室啮齿动物物种一起使用，并确认了我们的方法的多功能性。
对于生存力统计分析，死亡率和代谢活动变量应分别进行分析（表3）。关于死亡率，在不同的培养日（D0，D1和D7）评估几个因素：动物，来自同一动物的切片和对同一切片重复的（即，来自同一切片的几张图像）。因此，这个实验有一个层次结构，模型写成：

M ij ij =μ+ A i + S j（i）+ e ij

其中，M ij是第i个动物的第j个切片的死亡率值，μ是总体均值，A i第i个动物的作用，S（i）第i个动作的切片效应>动物，而e 是随机效应。
使用在R软件中实施的嵌套方差分析（嵌套ANOVA）对这些各种效应进行统计学检验，如下所示：

（公式=死亡率〜动物+切片％％动物+图像％切片，数据=文件名））。

这个分析是针对培养的每一天进行的（D0，D1和D7）。
注意：应该检查方差分析的假设（因变量的正态性，同方差性，图形诊断程序如残差与预测值的关系图和正常的残差QQ曲线图）。如果不是的话，应该使用非参数的Friedman检验来比较切片内的图像差异和动物内的切片差异，以及用于动物差异的非参数Kruskal-Wallis检验。
对于统计分析，我们使用GraphPad Prism和R软件。或者，一个名为“生物统计手册”（John H. McDonald）的网站详细介绍了该方法，并提供了2至4级嵌套方差分析的电子数据表和建议，可以通过以下地址访问： http://www.biostathandbook.com/nestedanova.html 。例如，如果要分析时间效应，请使用专用于4级嵌套ANOVA的电子表格，并填写以下列：日/动物/切片/图像/荧光值分别表示组/子组/子组/子组。对于动物效应的分析，您可以执行三级嵌套方差分析，并填写如下：动物/切片/图像/荧光值分别代表组/子组/子观察/观察（再次注意，您需要尊重ANOVA假设，如果不是简单地应用Kruskall-Wallis测试）。

表3. OBC生存力的统计分析

注：根据上述统计分析，统计时间，动物，切片和图像效果。报告用ns进行的每个测试的P值（非显着P> 0.05），** P < 0.01，*** P < 0.001。

食谱

注意：所有溶液必须使用Stericup过滤装置进行消毒，包括大量（器官型培养基，解剖介质和10倍犬尿酸），或使用孔径为0.22μm的注射器过滤器进行消毒。

1M MgCl 2（1L）
1. 重量为95.21克MgCl2•2％
2. 用蒸馏水加1升
3. 保持在室温下1年
0.1N NaOH（500ml）
1. 重量1.99克的NaOH
2. 带上蒸馏水至500毫升
3. 保持在室温下1年
50毫克/毫升胰岛素溶液（2毫升）
1. 用2毫升0.005 N HCl溶液重新整理小瓶
2. 分装（1毫升），并在-20°C存储
器官型脑培养基（500毫升）
添加所有组件：
375 ml的MEM GlutaMAX
125毫升热灭活的马血清（在-20°C储存血清）
2.5克D-葡萄糖
1毫升50毫克/毫升的人胰岛素（终浓度0.1毫克/升）
过滤消毒（0.22微米），并在4°C储存长达2周
注意：在手术过程中保持无菌状态不需要添加抗生素，但可能有助于预防污染。使用青霉素时，浓度应保持在0.08mM以下，以避免潜在的突触活性干扰（见表2）。
10×犬尿酸溶液（浓缩兴奋性毒性抑制剂溶液）（200ml）
1. 将378毫克犬尿肽溶于170毫升H 2 O中
2. 加入20毫升1M的MgCl 2 2/2
3. 使用0.1N NaOH将pH调节至7.4
4. 加1毫升的HEPES
5. 调整容量为200毫升
6. 过滤消毒，避光，并在室温下保持2周
解剖介质（Hibernate -A / 5g / L D-葡萄糖/ 1×犬尿酸）（50ml）
1. 准备500毫升补充了葡萄糖的Hibernate -A加入2.5克D-葡萄糖
2. 使用Stericup过滤装置过滤消毒，并在4°C下保存6个月。
3. 解剖当天，混合45毫升的Hibernateâ~A/ 5克/升D-葡萄糖与5毫升的10倍犬尿酸
4. 解剖
8％多聚甲醛（PFA）（100毫升）
在通风橱里：
1. 在烧杯中称取8克结晶性PFA，加入100毫升1×DPBS
2. 加热溶液，直到粉末完全溶解到65°C（不会更高，因为PFA会降解）
3. 分装和存储在-20°C
4. 用1x DPBS稀释至4％（使用前新鲜）
封闭和透化溶液（BPS）（1×DPBS / 0.3％Triton X-100/4％FBS）（50ml）
添加所有组件：
47.85毫升的1x DPBS
2毫升FBS
150μl的Triton X-100
涡旋并在37℃的水浴中孵育以帮助溶解Triton X-100达30分钟

4°C储存至2周注意：确保溶液中没有细菌或真菌在使用前增殖，如果有的话，准备一个新的批次。

致谢

这项工作得到了法国ANR NITRODEP资助（项目ANR-13-PDOC-0010-01）的支持（ http：/ / （ANR-11-IDEX-0007）项目内的里昂大学的LABEX ECOFECT（ANR-11-LABX-0048）由法国国家研究机构（ANR）提供。感谢Isabelle Dussart博士（法国巴黎大学皮埃尔•玛丽•居里大学06，法国巴黎URS 7102,75005）和法国马赛大学的Helene Clot-Faybesse博士（INMED，INSERM U29，Universite de laMéditerranée，法国马赛））对OBC文化的宝贵意见。该协议是从Stoppini 等改编的。（1991）稍作改动。作者声明不存在利益冲突或竞争。

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