材料和试剂

外科刀片（FEATHER安全剃刀，目录编号：23号）
1.5 ml微量离心管
移液器提示
传统针PrecisionGlide 23 G 1英寸（Fisher Scientific，目录号：14-826-6B）
制造商：BD，目录号：305193。
BD一次性注射器（BD，目录号：309628）
1号盖玻片22×30毫米（例如，康宁，目录号：2850-22）
显微镜载玻片（如，Fisher Scientific，目录号：12-552-3）
苍蝇表达肌节荧光标记（例如，Zasp52-GFP，表1）
定制的3.5％琼脂填充的60×15mm培养皿平板（BioShop，目录号：AGR003）
鬼笔环肽 - 四甲基若丹明B异硫氰酸酯（TRITC）（Sigma-Aldrich，目录号：P1951）
鬼笔环肽 - 荧光素异硫氰酸酯（FITC）（Sigma-Aldrich，目录号：P5282）
安装介质ProLong Gold Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：P36934）
氯化镁（MgCl 2）
乙二醇 - 双 - 四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
三磷酸腺苷（ATP）（BioShop，目录号：ATP007）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（BioShop，目录号：DTT001）
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
甘油（BioShop，目录号：GLY001）
Triton X-100（BioShop，目录号：TRX777）
8％多聚甲醛水溶液玻璃瓶（电子显微镜科学，目录号：157-8）
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
磷酸二氢钾（K 2 HPO 4）
放松的解决方案（见食谱）
放松甘油溶液（见食谱）
8％多聚甲醛（见食谱）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
1x PBS，0.1％Triton X-100（PBST）（见食谱）

设备

CO 2 2 Flypad，标准尺寸（8.1×11.6厘米）（Genesee Scientific，Flystuff，目录号：59-114）
刀片刀柄（FEATHER安全剃刀，目录号：4）
玻璃培养皿; 60×15毫米（VWR，目录号：89000-770）
制造商：DWK生命科学公司，KIMBLE ®，产品目录号：2306-10010。
立体显微镜（徕卡显微系统，型号：徕卡MS5）
杜蒙＃5镊子（精细科学工具，目录号：11251-30）
孵化器设置为25°C
P2，P20，P100和P1000微量移液器（例如，Gilson，目录号：F144801，F123600，F123615和F123602）
平台混合器（例如，Speci-Mix试管摇杆）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：M71015Q）
中型尖头刷子
标准的飞行饲养设备

软件

斐济（ https://fiji.sc/ ）
R统计软件包（ https://www.r-project.org/ ）

程序

准备苍蝇解剖
1. 麻醉苍蝇使用标准的CO 2垫。使用5-10天的苍蝇。
2. 使用细刷将苍蝇转移到定制的琼脂平板上。将所有苍蝇集中在盘子的中心。
3. 添加100μL的松弛甘油溶液（见食谱）苍蝇使用以前削减枪头。
切半个胸部
这一步的主要目标是将胸部分成两个对称的一半（图1和视频1）。这一步是比较容易的，但要注意不要粉碎肌肉。如果刀片变钝，请用新的刀片替换。
1. 使用两个罚款镊子去除腹部。只留下胸部和头部。
2. 放置并对齐胸部和背侧朝向你的眼睛。
3. 使用手术刀刀片和快速切片运动将胸部切成两半对称。
  如果仍然附着在胸部，请将头部剪掉
4. 在这一点上，IFM应该在解剖显微镜下可见。
5. 镊子半胸部，并放置在1.5毫升微量离心管
6. 加入100μl的放松甘油缓冲液。
  
  图1.胸部分为两半。 A-D。视频1中的快照显示了重要的解剖步骤。 A.放置胸部，背侧向上; B.轻轻触摸胸部，确保刀片正好位于中间位置，胸部不会移动。 C.将刀片的尖端对准头部/胸部固定部位（箭头）。 D.用尖锐的推开胸部; E.代表性的胸部分为两部分。在这个阶段可以观察到肌肉纤维（红色星号）。比例尺= 200微米。
  
  视频1
去除线粒体
在不加搅拌的情况下，在-20℃的放松 - 甘油缓冲液中孵育过夜，可以将样品中的线粒体完全去除（图2）。去除线粒体使成像和染色更容易。如果线粒体必须保存，请跳过这一节。

图2.甘油提取对线粒体的影响。 A和B.代表性的IFM表达线粒体：GFP蛋白和mCherry标记的Zasp52。 A.在非甘油化IFM中可以检测到线粒体; B.在甘油IFM中不能检测到线粒体。比例尺= 10微米。
多聚甲醛固定
1. 加入150μL的8％多聚甲醛（见食谱），在缓冲缓冲液中含有胸腔的管中。最终的多聚甲醛浓度应该在4％左右。也可以使用4％的甲醛固定溶液。
2. 在慢速搅拌（〜50 rpm）下室温孵育45分钟。
3. 用PBST代替固定溶液清洗（见食谱）。在慢速搅拌（〜50rpm）下，在PBST中孵育15分钟。重复这个步骤三次。胸腔迅速沉入微量离心管的底部。
解剖肌肉纤维
这个步骤的主要目标是将DLM纤维与屠体分离而不损坏它们（图3和视频2）。视频2显示了详细的实时解剖，在尝试解剖肌肉纤维以了解整个过程之前，先看看它。
1. 使用先前切割的移液器尖将转移到玻璃培养皿
2. 添加足够的PBST来覆盖组织（多余的液体将使解剖具有挑战性）。
3. 将针连接到注射器，以制造两个解剖针。
4. 使用两个解剖针解剖尸体肌纤维（细节见图4和视频2）。
5. 将纤维尽可能分开，不要撕裂纤维。
6. 使用先前切割的移液管尖端将纤维转移至1.5 ml带有PBST的微量离心管中。
  
  图3. IFM的一般描述A.一个胸部纵断面的示意图，显示了IFM的位置。两种类型的肌肉构成IFM，背侧纵肌（DLM，橙色）和背侧腹肌（DVM，绿色）。这个协议的目标是剖析DLM。 B.具有代表性的孤立DLM，橙色星号表示单独的DLM光纤（另见视频2）。比例尺= 200微米。
  
  图4.分解DLM光纤的分步指南 A-F。视频2中的快照。A.使用左针找到并保持半胸部。将针放在DLM正下方和腿上方。 B.在DLM后部附着部位做一个小切口。 C.在DLM上方做一个长切口，将肌纤维从背侧角质层完全分开。 D.将右侧针移到腹侧DLM（靠近左侧针）。 E.用右针将DLM纤维推出胸腔。 F.分离的DLM可以进一步分离成单独的纤维。 G.说明解剖过程的动画片。虚线的红线标记解剖针。注意解剖板中的少量液体（〜100μl）以防止半胸的浮动。比例尺= 200微米。
  
  视频2
鬼笔环肽染色和安装
1. 用无洗涤剂的PBS代替PBST溶液。小心不要吸入纤维。
2. 在无Triton的PBS中加入FITC-或TRITC-鬼笔环肽（1：1,250）。
3. 在慢速搅拌（〜50 rpm）下室温孵育1-2小时
4. 在慢速搅拌（〜50 rpm）下，用PBST清洗三次
5. 将肌纤维转移到载玻片上。
6. 使用Kimwipe干燥样品。
7. 添加一滴安装介质，与荧光标签兼容。盖上与共焦显微镜兼容的盖玻片。
8. 在4°C储存。
共聚焦显微镜
1. 在放大20倍的明视野下找到肌纤维。
2. 将目标更改为63x / 1.4 NA，并使用明场调整焦点以保护样品。
3. 使用共聚焦软件扫描肌纤维，对准光纤，并以9x放大倍数1,024 x 1,024像素拍摄全分辨率扫描图像。
4. 在肌肉纤维内的不同位置拍摄几张9x图像，以获得表型的准确表示，特别是在处理来自突变体的组织时。

数据分析

图像分析
1. 从这个协议获得的图像可以用来识别肌节表型。直接比较来自突变肌肉和对照肌肉的图像应该足以检测甚至微妙的肌节表型。由于健康的IFM是非常规则的结构（对照例见图5），突变表型可以通过直接计数对照和突变肌肉中正常肌节的数量来评分。
2. 当计数表型排除出现在焦点外的所有肌节，不具有定义明确的肌动蛋白染色或每个肌节有多于一个Z-盘。这些通常是由重叠的肌原纤维引起的伪迹的迹象。计数表型时，应始终使用肌动蛋白染色作为复染色。
  
  图5. IFM共聚焦图像的代表性实例A. Zasp52-mCherry用鬼笔环肽染色以显现肌动蛋白细丝。 B.GFP-肌动蛋白（GFP-Actn）和Zasp52-mCherry显示清晰的Z-盘共定位。 C. Flightin-GFP（Fln-GFP）标志着肌球蛋白头部存在的A带的部分。 Fln不与Zasp52-mCherry共同定位。 D. Obscurin-GFP定位到M线。比例尺= 10微米。
半自动Z盘或M线测量
来自Z-disc，M-line或A-band蛋白的荧光信号可用于自动检测单个颗粒（图6）。当需要对大量肌节进行非常精确的测量时（例如，估计Z-盘大小），这种方法是有用的。视频3显示了该协议的屏幕录制版本。
1. 使用斐济的ImageJ软件包打开图像（Schindelin ，2012年）。
2. 打开图像/调整菜单下的阈值菜单。选择“黑暗的背景”和“自动”。
3. 在“分析”菜单下，选择“设置测量”。检查面积，标准偏差，边界矩形，形状描述符，平均灰度值和显示标签框。
4. 在“分析”菜单下，选择“分析粒子”
5. 调整尺寸值（0.3-1）和/或圆度以排除不希望的对象（例如，突变肌肉中的蛋白质聚集体）。
6. 在下拉菜单中选择“轮廓”。
7. 应显示图像的测量和轮廓。如果轮廓包含不想要的对象，请调整“分析粒子”菜单中的参数。
8. 保存结果。
9. 用任何统计软件（例如，R统计编程语言）分析结果。
  
  图6.自动测量单个Z盘。：一种。 Zasp52-mCherry的共焦图像; B.以黑色显示要包含的像素的阈值图像。阈值步骤使用信号强度作为包含标准。 C.运行“分析粒子”步骤的结果。这一步使用大小和形状作为纳入标准。有关更多详细信息，请参阅视频3.比例尺= 10μm。
  
  视频3

笔记

抗体染色
抗体染色与IFM非常吻合。但是，使用这个协议时，它们似乎并不完美。如果应该使用抗体，那么固定和解剖步骤必须颠倒。也就是说，过夜培养后，不要固定组织，首先解剖IFM纤维，如视频2所示。然后用放松的溶液清洗样品3次，然后进行固定步骤。虽然这极大地增强了抗体染色，但未固定的DLM肌肉比预先固定的纤维更难于解剖。
有用的荧光标记
当荧光标记可用时，该协议效果最好。从普通股中心可以获得许多不同的表达GFP标签蛋白的原料。表1显示了用于IFM成像的有用GFP储备的列表。为了补充现有的GFP库存，我们通过将mCherry盒与Zasp52序列整合在一起，制成了ZmiP 52MI02908-mCherry 这个新的 Zamsp 52MI02908-mCherry 等位基因概括了Zasp52的表达和定位（图2,5和未发表的观察结果）。

表1.有用的荧光标记

注：*没有完整描述，可根据要求提供。
共焦图像
1. 所有图像都必须以相同的分辨率，放大倍率和方向进行采集。这可以直接比较图像，并节省时间安排数字。我们建议使用20 x 20μm的正方形图像，以1,024 x 1,024像素分辨率扫描并平均3次。
2. 将肌纤维尽可能靠近表面扫描。鬼笔环肽对IFM纤维的渗透有限。因此，肌动蛋白染色将在表面锐利但在内部模糊。更重要的是，IFM表型在肌纤维的表面和内部之间可能略有不同。

食谱

放松的解决方案
1. 溶于40ml ddH 2 O中 1000μl（终浓度为20mM）磷酸钠缓冲液储备液1M pH 7.0
  500μl（终浓度为5mM）0.5M MgCl 2 2 2.5 ml（最终浓度为5 mM）0.1 M EGTA
  2.5毫升（终浓度为5毫米）的0.1 M ATP储备液 250μl（终浓度为5 mM）1 M DTT
2. 添加1片蛋白酶抑制剂（cOmplete TM，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物，Roche）。
3. 用ddH 2 O调节体积至50ml
4. 在-20°C储存
放松甘油溶液
注意：准备基于约克改性甘油溶液（Peckham，1990）的放松 - 甘油溶液。
1. 混合松弛的解决方案与甘油1：1（V / V）
2. 加0.5％Triton X-100
3. 储存在10毫升等分试样中
8％多聚甲醛
1. 打开8％多聚甲醛水溶液玻璃瓶（电子显微镜科学）
2. 将小瓶内容物分成400μl等分试样并储存在-20℃。等分试样可以储存6个月以上
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1. 溶于800ml ddH 2 O
  80克的NaCl
  2.0克KCl
  14.4克Na 2 HPO 4 4 2.4克的K 2 HPO 4 4
2. 调整pH值到7.4。
3. 用ddH <2> O调整音量到1L
4. 用ddH 2 O稀释至1x PBS
1x PBS，0.1％Triton X-100（PBST）
加500μl的Triton X-100到500ml的1xPBS

致谢

这个协议是改编自其他人的工作。最初的IFM解剖技术由Belinda Bullard和John Sparrow描述和分发。我们感谢Anja Katzemich提供的技术建议，以及CIAN成像设备，帮助共聚焦显微镜。这项工作得到了加拿大卫生研究院的运营资金MOP-142475的支持。我们没有利益冲突要申报。

参考

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