材料和试剂

厚的沃特曼纸（Fischerbrand 色谱纸）（Fisher Scientific，目录号：05-714-4）
明胶包被的载玻片（Superfrost Plus）（Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
显微镜盖玻璃（24×50mm）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：3422ERI）
ImmEdge疏水屏障笔（Advanced Cell Diagnostics，目录号：310018）
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34133）
铝箔纸
小鼠（来自THE JACKSON LABORATORY的C57BL / 6，目录号：000664）
RNAscope阳性对照探针-Mm-Ppib（肽基脯氨酰异构酶B）（Advanced Cell Diagnostics，目录号：313911）
RNAscope阴性对照探针-DapB（Advanced Cell Diagnostics，目录号：310043）
RNAscope探针-Mm-Tgfβ1（转化生长因子β1）（Advanced Cell Diagnostics，目录号：407751）
RNAscope探针-Mm-IL1β（白细胞介素1β）（Advanced Cell Diagnostics，目录号：316891）
RNAscope探针-Mm-TNFα（肿瘤坏死因子α）（Advanced Cell Diagnostics，目录号：311081）
RNAscope探针-Mm-Arg1（精氨酸酶1）（Advanced Cell Diagnostics，目录号：403431）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），10倍溶液（Fisher Scientific，目录号：BP39920）
多聚甲醛（PFA）储备液制备4％（w / v）PFA，PRILLS（电子显微镜科学，目录号：19200）
蔗糖结晶储备液（Fisher Scientific，目录号：S5）制备在超纯水中稀释的30％（w / v）溶液
超纯水（如，Milli-Q）
在超纯水（例如，Milli-Q水）中新鲜制备的50％（v / v）乙醇溶液
在超纯水（例如Milli-Q水）溶液中新鲜制备的70％（v / v）乙醇
无水乙醇（200级乙醇）（Fisher Scientific，目录号：BP28184）
RNAscope H 2 O 2 2＆lt;蛋白酶加试剂（Advanced Cell Diagnostics，目录号：322330）
RNAscope 2.5 HD检测试剂-REP（Advanced Cell Diagnostics，产品目录号：322360）（阅读注释1）
RNAscope®目标检索试剂（Advanced Cell Diagnostics，目录号：322000） - 以前称为预处理2溶液
正常山羊血清（NGS）封闭液（Vector Laboratories，目录号：S-1000）
Triton X-100
多克隆抗兔Iba-1（离子钙结合适配体分子-1）抗体（Wako Pure Chemical Industries，目录号：019-19741）
多克隆抗兔P2Y12抗体（AnaSpec，目录号：AS-55042A）
多克隆抗大鼠F4 / 80抗体（R＆amp; D systems，目录号：MAB5580）
山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11034）
山羊抗大鼠Alexa Fluor 488二抗（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11006）
氟胶（含Tris缓冲液）固定介质，20ml（电子显微镜科学，目录号：17985-10）
甘油
乙二醇
RNAscope洗涤缓冲液试剂（4×60ml）（Advanced Cell Diagnostics，目录号：310091）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
防冻液（见食谱）
1倍洗涤缓冲液（见食谱）
1x抗原修复液（见食谱）
DAPI解决方案（请参阅食谱）

设备

Gilson TM PIPETMAN Classic TM吸管（Gilson，型号：P20，P200，P1000，目录号：F123600，F123601，F123602）
2升烧杯
超长镊子（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：10-316A）
定时器，可溯源TM Nano TM（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，产品目录号：14-649-83）
幻灯片持有人手柄，24幻灯片（电子显微镜科学，目录号：62543-06）
滑动切片机MicromHM 430（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：HM 430，目录号：910010）
HybEz TM杂交系统（Advanced Cell Diagnostics，目录号：310010）
ACD HybEZ TM带有盖子的湿度控制盘（Advanced Cell Diagnostics，产品目录号：310012）
用EasyDipTM载玻片染色（Electron Microscopy Sciences，目录号：62540-01）组织Tek载玻片染色组
ACD EZ-slide holder / rack（Advanced Cell Diagnostics，产品目录号：310017）
带有磁力搅拌器的Thermix 210T型电热板（Fisher Scientific，型号：210T型，目录号：11-493-210T）
使用Photometrics相机（CoolSNAP，fx，Axioskop，Roper Scientific，序列号：A02M86017）在Axioplan 2显微镜（Carl Zeiss，型号：Axioplan 2，目录号：451485）上获取荧光图像。
徕卡SP8共聚焦显微镜（徕卡显微系统，型号：徕卡TCS SP8）

软件

GraphPad Prism软件V. 5.0（GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA）
Adobe Photoshop CS5 V. 12.0（Adobe Photoshop，CC）
AxionVision 4V，4.8.2.0。，授权给：3018897（Carl Zeiss MicroImaging，GmbH）
ImageJ64软件（国家卫生研究院）

程序

使用RNAscope技术2.5红色荧光试剂盒对新鲜冷冻组织进行荧光原位杂交，并进行了一些修改。
所有目标探针由20个短的双Z寡核苷酸探针对组成，这些探针对是基因特异性的，并从ACD获得。

RNAscope探针-Mm-Arg1（登录号NM_007482.3，目标区2-1114）
RNAscope探针-Mm-TNFα（登录号NM_013693.2，目标区域41-1587）
RNAscope探针-Mm-Tgfβ1（登录号NM_011577.1，目标区域588-1913）
RNAscope探针-Mm-IL1β（登录号NM_008361.3，目标区域2-950）
RNAscope阳性对照探针-Mm-Ppib（登录号NM_011149.2，目标区域98-856）
RNAscope®阴性对照探针-DapB（针对细菌基因）

组织
1. 如前所述（Villapol等人，2017），用CO 2安乐死小鼠并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）经心脏灌注。
2. 用4％（v / v）PFA整夜固定整个大脑
3. 将小鼠脑转移到PBS中的30％（v / v）蔗糖溶液中，在4℃下脱水48小时，或者直到大脑完全下沉到管底部。
4. 使用滑动切片机将20μm厚的小鼠脑冠状切片切片
5. 在防冻液中冷冻保护大脑（见食谱），并保存在-20°C。
在开始之前
1. 准备1.5升的1倍洗涤缓冲液（见食谱）。
2. 将HybEZ TM 杂交系统设置为40°C。
3. 剪下Whatman纸，放在HybEZ TM湿纸盘底部的中央，加入约50毫升的超纯水。
4. 温热HybEZ TM TM湿度控制托盘，使用前应将湿的Whatman纸放置30分钟。
5. 在使用前允许“Pretreat 1”溶液（过氧化氢溶液）在室温（RT）下平衡
6. 在RT下平衡扩增试剂（AMP溶液1-6，从ACD获得）
7. 温度控制和目标探头在40°C下10分钟，在使用前在室温下冷却。
用于荧光原位杂交（FISH）的RNAscope 技术
1. 装载明胶涂层幻灯片上的冠状脑部分（20微米厚），并储存在-80°C，直到使用。尝试找到幻灯片底部的大脑部分，以避免在清洗过程中使用过量的缓冲液。
2. 将玻片放在垂直的塑料染色架上，浸入50％新鲜乙醇溶液中5分钟。
3. 将包含载玻片的垂直塑料染色架转移到含有70％乙醇溶液的EasyDip TM载玻片染色系统中5分钟（图1A和视频1）。
4. 将含有载玻片的垂直塑料染色架转移到含有100％乙醇溶液的EasyDip TM载玻片染色系统中5分钟。
5. 将含有载玻片的垂直塑料染色架转移到含有第二个100％乙醇溶液的EasyDip TM载玻片染色系统中5分钟（请参阅注释1）。
6. 从100％乙醇中取出载玻片，在载玻片架上放置30分钟。
7. 使用immEdge疏水屏障笔（图1B和视频1）在每个部分周围绘制疏水屏障
8. 从这一步开始，不要让大脑部分完全变干。
9. 预处理1（过氧化氢处理）
  1. 将载玻片放在ACD EZ载玻片架上，并在每个切片上添加60-100μl的预处理溶液1（图1C和视频1，请参阅注释2）。
  2. 在RT预处理溶液1中孵育脑部分10分钟。将预处理解决方案1添加到第一张幻灯片后启动计时器。
  3. 摒弃预处理解决方案1，将幻灯片滑入废物容器中，或者在必要时敲击Kimwipe上的幻灯片侧面。
  4. 将幻灯片放入浸在超纯水中的垂直塑料染色架中。
  5. 上下移动染色架以清洗载玻片
10. 预处理2（抗原修复液）
  1. 将350毫升1x抗原修复液（预处理溶液2）（见食谱）用热板煮沸。（通常需要40分钟才能煮沸。）建议用铝箔纸覆盖容器。
  2. 检查确保温度在100-104°C之间。
  3. 使用长弧形钳子，将载玻片的垂直塑料染色架慢慢浸入煮沸的抗原修复液中。
  4. 检查确保温度在100-104°C之间。
  5. 煮的幻灯片2至10分钟（这取决于组织的质量）。
  6. 用超纯水冲洗载玻片（重复一次）。
11. 预处理3（蛋白酶消化）
  1. 将幻灯片滑入废物容器中，或者在必要时敲击Kimwipe上的幻灯片侧面，以滗去超纯水。
  2. 将幻灯片放在ACD EZ滑轨架上。
  3. 每个脑组添加约60-100μl预处理溶液3（蛋白酶溶液）以覆盖整个组织切片（图1D和视频1，请参阅注释2）。
  4. 将ACD EZ载玻片固定器/支架放入预热的HybEZ TM带盖盖的烤箱中，在40°C孵育30分钟。
  5. 拆下ACD EZ滑块支架/支架，然后将ACD HybEZ TM 湿度控制托盘放回HybEZ TM烘箱杂交系统（图1E和视频1）。< br />
    
    图1. RNAscope方案的组成部分。：一种。在蒸馏水中洗涤; B.在每个部分周围绘制疏水屏障; C.加入预处理溶液; D.扩增溶液; E.持有人/机架。
    
    视频1
  6. 如果需要的话，将幻灯片滑入废物容器中或者通过敲击Kimwipe上的幻灯片的侧面来滗析预处理溶液3。
  7. 将幻灯片放入浸在超纯水中的垂直塑料染色架中。
  8. 上下滑动滑动架来清洗滑梯
12. 目标探针杂交
  1. 将幻灯片滑入废物容器中，或者在必要时敲击Kimwipe上的幻灯片侧面，以滗去超纯水。
  2. 将幻灯片放在ACD EZ滑片架上（请参阅注3）。
  3. 每个脑区添加60-100μl的目标探针或对照探针以覆盖整个组织切片（请参阅注释2）
  4. 将ACD EZ载玻片固定器/支架放入预热的ACD HybEZ TM 湿度控制盘中，并在HybEZ TM 杂交系统中于40°C孵育2小时。
  5. 卸下ACD EZ滑块支架/支架，然后将ACD HybEZ TM 湿度控制托盘放回到HybEZ TM 杂交系统中。
  6. 通过滑动幻灯片到废物容器中或通过敲击Kimwipe上的幻灯片边来滗析控制探头和目标探头。
  7. 将载玻片放入浸在1倍清洗缓冲液中的垂直塑料染色架中。
  8. 将载玻片架上下移动数次，清洗载玻片2分钟。
13. 放大步骤（AMP 1-AMP 6）
  1. 通过将幻灯片滑动到废物容器中或通过敲击Kimwipe上的幻灯片的侧面来滗析1x清洗缓冲液。
  2. 将幻灯片放在ACD EZ载玻片架上，不要让组织片完全干燥。
  3. 在每个组织切片中加入60-100μl每个脑切片的AMP溶液（请参阅注2）
  4. 将ACD EZ载玻片固定器/支架放入ACD HybEZ TM 湿度控制盘中，根据表1进行培养。
    
    表1.扩增溶液及其相应的孵育时间和温度
  5. 通过将幻灯片滑入废物容器或轻敲Kimwipe上幻灯片的侧面来滗析AMP解决方案。
  6. 将玻片放在垂直的塑料染色架上，浸入1x洗涤缓冲液中。
  7. 将载玻片架上下移动数次，清洗载玻片2分钟。
14. 检测信号（室温10分钟）
  1. 每张载玻片上混合60μl红色-A和1μl红色-B溶液。避光。
  2. 通过将幻灯片滑动到废物容器中或通过敲击Kimwipe上的幻灯片的侧面来滗析1x清洗缓冲液。
  3. 将幻灯片放在ACD EZ载玻片架上，不要让组织片完全干燥。
  4. 每个组织部分添加60μL的检测解决方案（阅读注2）。确保从正面和负面的控制幻灯片开始。
  5. 在带有盖子的ACD HybEZ TM 湿度控制盘内，在室温下孵育10分钟。避光。将检测解决方案添加到第一张幻灯片后立即启动计时器。
  6. 通过比较阳性对照和阴性对照，每隔两分钟检查杂交信号的进展。阳性对照应该是红色的，而阴性对照应该显示很少或没有背景。
  7. 通过将幻灯片滑入废物容器或敲击Kimwipe上幻灯片的侧面来滗析检测解决方案。
  8. 将幻灯片放置在浸入超纯水中的垂直塑料染色架上。
  9. 将载玻片架上下移动数次，清洗载玻片2分钟。
  10. 在进行免疫组织化学之前，在显微镜下检查杂交信号。阳性杂交信号由表示mRNA转录物的几个点状信号（红色点）组成（Wang等人，2012）（图2）。
    
    图2.在选择的脑切片上的阳性对照探针和细胞核（DAPI，蓝色）的代表性图像比例尺= 50μm。
15. 免疫荧光
  1. 将含有载玻片的垂直塑料染色架转移到含有PBS的EasyDip TM载玻片染色系统中。
  2. 通过上下移动滑动架多次清洗滑道。重复三次。
  3. 在补充有0.3％（v / v）Triton X-100（PBST）的PBS中的5％（v / v）正常山羊血清（NGS）中在室温下封闭1小时（或在4℃过夜）在ACD HybEZ带有盖子的TM湿度控制盘。
  4. 在PBST中的5％（v / v）NGS中的一级抗体中孵育过夜，在以下稀释度下在4℃下过夜：
    多克隆抗兔Iba-1（1：500）
    多克隆抗兔P2Y12（1：1,000）
    多克隆抗大鼠F4 / 80（1：200）
  5. 将幻灯片放在淹没在PBS中的垂直塑料染色架上。通过上下移动滑动架多次清洗滑道。重复三次，每次5分钟。
  6. 在ACD HybEZ TM 中室温孵育相应的Alexa Fluor 488二抗（PBST中5％（v / v）NGS中1：1,000） >带有盖子的湿度控制盘。避光。
  7. 将幻灯片放在淹没在PBS中的垂直塑料染色架上。通过上下移动滑动架多次清洗滑道。重复三次，每次5分钟。避光。
  8. 在显微镜下检查免疫荧光信号。阳性免疫荧光信号由鲜绿色的抗原检测组成（图3）。
  9. 用DAPI溶液反击细胞核（见食谱）10分钟。避光。
  10. 将幻灯片放在淹没在PBS中的垂直塑料染色架上。通过上下移动滑动架多次清洗滑道。重复三次，每次5分钟。避光。
  11. 用Milli-Q水冲洗干净。
  12. 用含有Tris缓冲液的Fluoro-gel封闭脑切片。让干。
    
    图3.使用特异性探针检测TGFβ结合（红色）和DAPI染色核（蓝色）和免疫染色的RNAscope荧光测定的代表性共焦图像TBI后皮层内的小胶质细胞/巨噬细胞（Iba-1） A和B（50μm）和C-E（20μm）的正交投影共聚焦图像和比例尺。

数据分析

（Allen等人，2016; Barrett等人，2017; Barrett等人，2017）提供了关于定量免疫荧光和原位mRNA杂交的细节。 Villapol 等，2017）。简述：

阳性原位mRNA杂交信号由代表单个mRNA转录物的点状信号组成（Wang et al。，2012）。
用10倍和20倍放大倍率的Leica SP8共聚焦显微镜拍摄图像。在感兴趣的大脑区域内取3-6个显微镜视野。所有的显微镜和照相机设置（即，
将颜色标签分配到远红色（激发647nm，发射690±10nm）用于mRNA杂交信号。将感兴趣抗原的颜色标签指定为绿色。
用AxionVision软件分析图像，并用ImageJ64软件（National Institute of Health）量化杂交信号。
手动计数与DAPI细胞核共同定位的mRNA阳性细胞的数量，代表用感兴趣的抗原检测的阳性细胞的数量。用作对照的阴性探针不应含有任何染色的细胞。
使用Adobe Photoshop CS5裁剪和调整图像大小
将亮度和对比度的变化同样应用于整个图像以及同一数据集内的所有对应图像。
使用GraphPad Prism软件v.5.0（GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA），用Bonferroni事后检验用双因素方差分析（ANOVA）分析数据。两个独立变量是性别（女性对男性）和时间点（例如，在TBI后4小时，1天，3天，7天和30天）。 A＆lt; em＆gt; P＆lt; em＆gt;值＆lt; 0.05被认为有统计学意义。用平均值±SEM表示所有的数字和表格。

笔记

安装的脑切片可以在连续脱水程序后储存在100％EtOH中。在这个阶段，幻灯片可以储存在-20°C一个星期。
在每个预处理和放大步骤中，确保大脑部分覆盖在溶液中。我们使用鼠标大脑部分，因此，较大的组织可能需要更多体积的溶液来覆盖该部分。不这样做会导致更高的噪音信号。
分析过程中保持湿度盘温热。
因为在原位杂交过程中组织保持湿润或潮湿是重要的，所以建议成组工作。
始终检查疏水屏障的完整性是否受损。
所有试剂均按制造商推荐的方式储存。

食谱

防冻液
30％（v / v）甘油
30％（v / v）乙二醇
40％（v / v）0.01M PBS
1次洗涤缓冲液
1.47L超纯水（例如，Milli-Q水）
30毫升的50倍洗涤缓冲液
混合好
1x抗原修复液（以前称为预处理液2）
35毫升的10倍抗原修复液

315毫升的超纯水充分混合，煮沸（20分钟煮沸）
DAPI解决方案
将PBS中的DAPI稀释到1：50,000的溶液。
彻底涡旋。如果不这样做，将导致组织蓝色沉淀

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R03NS095038（S. Villapol），R01NS067417（M.P. Burns）和乔治敦大学医学中心（I. Mocchetti）提供的生物医学研究院院长（Toulmin试点项目）的支持。我们要感谢Kathy Maguire-Zeiss博士让我们使用她的荧光显微镜，并感谢Lucas Djavaherian在录像中的帮助。该协议已经被改编自（Barrett等人，2017，Villapol等人，2017）。作者声明，研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，可能被认为是潜在的利益冲突。

参考

Allen，M.，Ghosh，S.，Ahern，G. P.，Villapol，S.，Maguire-Zeiss，K.A。和Conant，K.（2016）。蛋白酶诱导的可塑性：基质金属蛋白酶-1通过激活蛋白酶活化的受体1促进神经结构改变。 a> Sci Rep 6：35497。
Barrett，J.P.，Henry，R.J.，Villapol，S.，Stoica，B.A.，Kumar，A.，Burns，M.P.，Faden，A.I。和Loane，D.J。（2017）。 NOX2缺乏症通过IL-10 / STAT3依赖性机制改变巨噬细胞表型：影响创伤性脑损伤。 J Neuroinflammation 14（1）：65.
Grabinski，T.M.，Kneynsberg，A.，Manfredsson，F.P。和Kanaan，N.M。（2015）。将RNAscope原位杂交与免疫组织化学结合的方法，漂浮的大脑切片和主要的神经元文化。 PLoS One 10（3）：e0120120。
Villapol，S.，Loane，D.J。和Burns，M.P.（2017）。对创伤性脑损伤的炎症反应中的性别二态性 65（9）：1423-1438。
Wang，F.，Flanagan，J.，Su，N.，Wang，L.C.，Bui，S.，Nielson，A.，Wu，X.，Vo，H.T.，Ma，X.J。和Luo，Y。（2012） RNAscope：一种新颖的原位RNA分析平台，用于福尔马林固定，石蜡包埋的组织。 J Mol Diagn 14（1）：22-29。