材料和试剂

BALB/cAnN-nu（裸鼠）6到8周龄的雌性小鼠
肿瘤细胞
Matrigel矩阵（BD Biosciences，Falcon ，目录号：354234）
10％福尔马林溶液中性缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128-4L）
抗大鼠CD34（Santa Cruz，目录号：sc-18917）
生物素山羊抗大鼠IgG（BD Biosciences，目录号：559286）
链霉亲和素 - 过氧化物酶缀合物（Dako，目录号：P0397）
二氨基联苯胺（DAB）（Dako，目录号：K3467）
石蜡
氯化钾
磷酸二氢钾
氯化钠（NaCl）
磷酸氢二钠
苏木精和曙红（H& E）
胰蛋白酶
完成媒介
普通介质
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）

软件

Aperio ScanScope系统
ImageScope v10软件（Aperio，Vista）

设备

Aperio Scanscope CS-S显微镜载玻片扫描系统
肿瘤细胞培养设置
血细胞计数器
离心机
24G注射器
T175烧瓶

程序

从含有80-90％铺满的单层肿瘤细胞（例如鼻咽癌HONE1细胞）的T175烧瓶中取出培养基，并用PBS洗涤细胞。
通过与3ml胰蛋白酶孵育5-10分钟来分离肿瘤细胞; 用10ml完全培养基停止胰蛋白酶消化
用血细胞计数器计数细胞数，以1,200rpm旋转细胞5分钟，并用PBS洗涤一次。
用50μl普通培养基和250μl冰冷的基质胶混合总共5×10 6个/〜1×10 7个细胞（细胞类型依赖性）（基质胶维持在2-8℃下为液体形式，并在22-37℃下快速固化）
使用带有24G一英寸针的冰冷注射器将300μl细胞基质胶混合物皮下注射到5只雌性无胸腺裸鼠的小鼠腹部（每只小鼠一个注射部位）。
聚合与细胞混合的基质胶以形成固体凝胶塞，其允许细胞生长和血管形成。
接种7天后，切除基质胶，用福尔马林固定过夜，包埋在石蜡中，并切片到载玻片上。
用苏木精和伊红（H& E）染色载玻片用于组织学观察
将在150μl内皮细胞标记CD34单克隆抗体（1:40）形成的血管在4℃和150μl第二生物素偶联的山羊抗大鼠IgG抗体（1:100）在室温下1小时（RT ）。
将抗体与150μl链霉抗生物素蛋白 - 过氧化物酶缀合物（1：200）在室温下孵育1小时。
添加基材DAB用于信号检测。
通过Aperio ScanScope系统扫描幻灯片，并通过ImageScope v10软件对信号进行量化

图1.来自基质胶栓测定的代表性结果。如棕色染色所指示的，用抗CD34抗体染色内皮细胞（由箭头指示）。在具有生长的肿瘤细胞的凝胶塞部分中形成大量的毛细血管。 B.在缺乏毛细血管形成的肿瘤结节的中心区域中观察到的细胞坏死的代表性图像（由星号表示）。

食谱

PBS（pH 7.4）
2.67mM氯化钾
1.47mM磷酸二氢钾 137.93mM氯化钠（NaCl） 8.1mM二水基无水磷酸钠

致谢

研究资助由中华人民共和国香港特别行政区研究资助委员会拨款：拨款HKU6617/08M及HKU6415/06M至MLL; 美国国家卫生研究院AR49930授予SSA; 和瑞典癌症协会，瑞典研究委员会，瑞典研究所，洛杉矶纽约/关注基金会的癌症研究所和爱沙尼亚的卡罗林斯卡研究所。

参考文献

Cheung，A.K.，Ko，J.M.，Lung，H.L.，Chan，K.W。，Stanbridge， Zabarovsky，E.，Tokino，T.，Kashima，L.，Suzuki，T.，Kwong，D.L.，Chua， D.，Tsao，S.W.and Lung，M.L。（2011）。富含半胱氨酸肠蛋白2（CRIP2）作为NF-κB介导的阻遏物促血管生成细胞因子转录以抑制肿瘤发生 angiogenesis。 Proc Natl Acad Sci U S A 108（20）：8390-8395。
结果显示，与正常对照组相比，对照组患者的生存率明显高于对照组，差异有统计学意义（P <0.05）。，Stanbridge，EJ和Lung，ML（2012）。候选肿瘤抑制基因（Fibulin-2）在鼻咽部的抗血管生成和肿瘤抑制作用癌。癌基因 31（6）：728-738
HL，Cheung，AK，Apte，SS，Chan，KW，Kwong，FM，Ko，JM，Cheng，Y.，Law，S.，Srivastava，G.，Zabarovsky，ER，Tsao，SW ，Tang，JC，Stanbridge，EJand Lung，ML（2010）。细胞外蛋白酶ADAMTS9通过抑制血管生成抑制食道和鼻咽癌肿瘤形成。 Cancer Res 70（13）：5567-5576