材料和试剂

15毫升管（SARSTEDT，目录号：62.554.002）
注射器过滤器filtropur S，0.2μm（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
10毫升Luer-Lok无针注射器（BD，目录号：300912）
Milli-Q级（或类似）水（电阻率25°C，18MΩcm）
蒸馏AR级硝酸（Avantor Performance Materials，MACRON，目录号：1409-46）
ICP-MS多元素标准溶液VI（Merck，目录号：1105800100）
Na 2 N 2 - 乙二胺四乙酸（EDTA）（Carl Roth，目录号：8043.2）
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Carl Roth，目录号：6763.3）
EDTA洗涤缓冲液（见食谱）

设备

用于15ml试管的冷却离心机（Beckman Coulter，型号：GS-6）
铁氟龙杯（Savillex，定制）
分析天平（KERN＆amp; SOHN，型号：ALJ 220-4M）
涡旋混合器（Eppendorf，型号：MixMate ）
清洁实验室Class 5000（根据美国FED STD 209E，根据更新的ISO 14644-1和ISO 14698标准，将在ISO6和ISO 7之间）
化学罩（Wesemann）
热板（陶瓷搅拌热板）（IKA，目录号：35810.01）
ICP-MS 7500cx（安捷伦科技公司，型号：ICP-MS 7500cx）
Neubauer改进的血细胞计数器（Marienfeld-Superior，目录号：0650030）

程序

取样和清洗（图1）
注意：

将样品放在冰上以减缓代谢活动。
洗涤步骤是时间敏感的，因为它们通过去除所有外部Mn而停止实验。除去所有的外部锰都保留了样品在所采取的时间点的状态，并且样品的元素组成不再变化。
在数据分析中计算样品体积和最终洗脱体积。因此，本协议中的所有卷都是大致的数量，只要它们的权重是准确的。所有的转移都可以通过浇注来完成。移液是不必要的，甚至可能会添加污染物。

A.采样和洗涤的工作流程A.细胞内（样品C）和周质（样品E1和E2）Mn池通过EDTA洗涤步骤分离。 B.为了测量总细胞Mn含量（样品T），将细胞从培养基中分离并重悬于Milli-Q水中。

对于每个样品，准备四个15毫升的试管，标有样品号和T1（总细胞），E1（第一EDTA洗），E2（第二EDTA洗）和C1（细胞内锰含量）。
称重并记下每个试管的重量，包括盖子。
取2ml样品（OD 750〜0.75，注3），并将它们转移到T1和C1管中（注4）。
从管T1中取出30μl用于细胞计数。
称重并注意管T1和C1的重量。
注：从样品管中减去空管的重量可以得到样品的重量。
3000×g离心管T1和C1，4℃5分钟。
丢弃上清。
注意：如果需要，可以将上清液分析为样品M（中等）。如果是这样的话，称量样品，然后通过0.2μm注射器过滤器过滤，以消除剩余的细胞。剩余细胞的生长将改变培养基的Mn组成，并且需要样品消化。过滤后，样本不需要进一步处理。
通过在约4毫升Milli-Q水中涡旋振荡重悬样品T1。
在室温下储存样品直至样品消解
向样品C中加入4ml EDTA洗涤缓冲液并通过涡旋重悬。重复步骤1f。
将EDTA上清液转移到标记为E1的试管中。称重并记下重量。将管E1保存在室温下。样品不需要进一步处理（注5）。
注意：大多数ICP-MS设备不接受未消化或未经过滤的样品。因此，如上所述可能需要过滤EDTA洗涤液。然而，潜在的残余细胞不能生长，因为它们在EDTA洗涤缓冲液中而不是中等。
向样品C中加入4ml EDTA洗涤缓冲液并通过涡旋重悬。重复步骤1f。
将EDTA上清液转移到标记为E2的试管中。称重并记下重量。将管E2储存在室温下。样本不需要进一步处理。
加入4毫升Milli-Q水，涡旋重悬。
从管中取出30μl用于细胞计数。

样品消化
注意：从这里开始，在洁净室环境下执行所有步骤是非常重要的。
1. 对于每个样品，准备另外一套两个15毫升的试管（标有样品编号和C2或T2）。
2. 称量4毫升的Milli-Q水到试管C2和T2
3. 每个样品T1和C1加入2毫升硝酸。
4. 轻轻摇晃或颠倒5分钟。
5. 在化学罩内预热热板至200°C（注6）
6. 将每个样品（仅限于T1和C1）放入适合热板的聚四氟乙烯杯中，并将样品置于热板上。
7. 让样品蒸发，直到最小的液滴保留;
  在样品完全挥发之前从热板上取下（注7）
8. 将相应试管中的所有水加入聚四氟乙烯杯中，小心重新悬浮样品，并将样品返回到同一试管（例如，从管T2到蒸发样品T的水，然后返回管T2）。
样品测量（不需要洁净室）
1. 从每个样品（T2，C2，E1和E2）转移2 ml到适合ICP-MS样品处理器的样品管。
2. 储存每个样品剩余的2毫升，以便进行额外的测量。
3. 根据您的ICP-MS设备的说明分析样品。
细胞计数
1. 根据您的血细胞计数器的使用说明书，对采样和洗涤（步骤1d和1n）样品进行细胞计数。

数据分析

周质Mn浓度是样品E1和E2中Mn的总和。样品C2是细胞内Mn浓度，即细胞质和类囊体系统。应用方程1来计算样品E1，E2的周质Mn浓度以及来自C1的体积和细胞数。类似地，使用等式2使用样品C1和C2计算[原子池-1]中的细胞内Mn浓度。

ICP-MS结果通常以百万分之一（ppm）表示，相当于[μgml -1 -1]或十亿分率（ppb），相当于[μgL -1] 1 ]。确保将输入数据转换为正确的单位。请注意，方程式1和2中的分子量（MW）为[μgmol -1]。
也可以使用OD 750或叶绿素含量来标准化，而不是细胞计数。但是，我们推荐细胞计数。作为对照，样品C2，E1和E2中的Mn的总和应等于样品T2中的Mn浓度。您可以像样本C2一样计算样本T2。
图2显示了一个计算的例子。用于计算的数字是从我们标准条件下生长的WT样品获得的（注1）。

图2.计算Mn浓度的示例确保输入数据的单位是正确的。在我们的例子中，例如，ICP-MS结果是[μgL -1 -1]。请注意，Mn的分子量（MW）是[μgmol -1]。在我们的实验中，E1 + E2 + C2和T2之间的差值在0.1-10×10-3 [原子单元-1]的范围内。

笔记

突变株系基于并与日本的集胞藻 sp进行比较。 PCC 6803，由Martin Hagemann（德国罗斯托克大学）获得。我们的标准生长条件是30℃，100rpm摇动和100μmol光子m-2秒-1 。
这是一个元素分析，不区分锰结合到蛋白质，复杂的锰和游离锰。
待分析的原始样品量取决于样品的细胞密度。密集的样品需要更少的体积，稀释的样品需要更多。没有必要调整其他卷。在我们的实验中，我们采取了2毫升的样品，OD 750〜0.75。
这个协议没有必要使用移液器。这样可以最大限度地减少样品的污染。
所有从一个管到另一个管的转移都应该通过浇注来完成
原则上，可以组合样品E1和E2并一起测量它们。如果这样做，则计算中的样本量需要相应地改变。然而，根据实验的生理条件，这些样品中Mn的含量可能已经接近样品E1中的检测极限。因此，我们宁愿不用样品E2进一步稀释样品E1。
处理大量样品时，热板的温度可以低至180°C。这样做会减慢这个过程，以便更好地跟踪热板上的所有样品，以避免燃烧。
最小可能的液滴大小主要取决于进行实验的人的经验。重要的是，在测量之前将液滴尺寸包括在样品重量中意味着较大的液滴不会影响测量。这一步骤仅仅是为了通过减少样品中的硝酸量来保护ICP-MS泵。如果样品完全蒸发，加入1毫升硝酸并充分混合。继续小心蒸发。
所有的样品可以在室温下保存直到消化，只要实验已经停止了洗涤步骤。在消化过程中所有可能的污染都将被消除，但不能改变样品的元素组成。我们没有意识到样品在消化之前有任何特定的保存期限，但是在消化之前我们储存样品的时间最长是三周。消化后，我们建议冷冻样品，以防止可能影响ICP-MS机器的微生物生长，而不是样品成分。

食谱

EDTA洗涤缓冲液
20mM HEPES-KOH，pH 7.5
5 mM EDTA
注意：EDTA洗涤缓冲液可以在室温下保存数月。

致谢

这项研究得到了德国科学基金会（EI 945 / 3-1至M.E.）和以色列科学基金会（2733/16至N.K.）的支持。作者声明不存在利益冲突。

参考

Brandenburg，F.，Schoffman，H.，Kurz，S.，Kramer，U.，Keren，N.，Weber，A.P。和Eisenhut，M.（2017）。 Synechocystis 锰出口商Mnx对于蓝藻中的锰稳态是必不可少的。 / a> Plant Physiol 173（3）：1798-1810。
Keren，N.，Kidd，M.J。，Penner-Hahn，J.E。和Pakrasi，H.B。（2002）。在光合细菌集胞藻中大量积累锰的光依赖机制 > sp。 PCC 6803. 生物化学 41（50）：15085-15092。