材料和试剂

移液器提示
组织培养10厘米培养皿（Greiner Bio One International，目录号：664160）
胶原蛋白涂层组织培养6厘米的菜肴（康宁，目录号：354401）
Terumo注射器10ml（Terumo，目录号：SS-10ESZ）
Terumo针21 G x1½“（Terumo，目录号：NN-2138S）
预分离过滤器（Miltenyi Biotec，目录号：130-041-407）
MS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
15ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：339650）
组织培养48孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：150687）
Terumo注射器5ml（Terumo，目录号：SS-05SZ）
Millex-GV 0.45-μmPVDF 33-mm无菌注射器过滤器（Merck，产品目录号：SLHV033RB）
Corning Cell Lifter（Corning，目录号：3008）
Terumo注射器1 ml（Terumo，目录号：SS-01T）
Terumo针18 G x1½“（Terumo，目录号：NN-1838S）
组织培养12孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：150628）
瓶顶过滤器0.2-μmPVDF（Corning，目录号：431098）
五周龄雌性C57BL / 6JJcl小鼠（CLEA日本，东京，日本）
Platinum-E包装（PLAT-E）细胞系（Morita等，2000）（由Toshio Kitamura博士或Cell Biolabs，产品目录号：RV-101提供）
WEHI-3（ATCC，目录号：TIB-68）
pMSCV-neo载体（Takara Bio，Clontech TM，目录号：634401）
Lipofectamine TM 2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11668019）
Opti-MEM TM I培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：31985070）。
CD117微珠，小鼠（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-224）
G418解决方案（NACALAI TESQUE，目录号：16513-84）
Polybrene感染/转染试剂（10 mg / ml）（Merck，目录号：TR-1003-G）
β-巯基乙醇（NACALAI TESQUE，目录号：21418-84）
RNeasy®mini试剂盒（QIAGEN，目录号：74106）
用于RT-PCR的Superscript III第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：18080051）
氯化钠（NaCl）（NACALAI TESQUE，目录号：31320-05）
Na 2 HPO 4•12H 2 O（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-02835）。
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-22635）
氯化钾（KCl）（和光纯药工业，目录编号：160-22115）
胎牛血清（FBS）（NICHIREI，Sigma-Aldrich，目录号：172012-500ML）
青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（P / S）溶液（NACALAI TESQUE，目录号：06168-34）
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（NACALAI TESQUE，目录号：08459-64）
RPMI 1640（NACALAI TESQUE，目录号：30264-56）
乙二胺四乙酸（EDTA）（NACALAI TESQUE，目录号：15130-95）
胰蛋白酶-EDTA溶液（NACALAI TESQUE，目录号：32778-34）
氢氧化钠（NaOH）（和光纯药工业，目录号：198-13765）
氯化铵（NH4Cl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-02995）
碳酸氢钾（KHCO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：166-03275）
鼠干细胞因子（SCF）（PeproTech，目录号：250-03）
鼠白细胞介素-3（IL-3）（PeproTech，目录号：213-13）
鼠白细胞介素-6（IL-6）（PeproTech，目录号：216-16）
鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（PeproTech，目录号：315-03）
牛血清白蛋白（BSA）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：019-23293）
IMDM粉末（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12200036）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：195-14515）
甲基纤维素（粘度：4000cP）（Sigma-Aldrich，目录号：M0512）
针对鼠类Hoxa9和Gapdh的TaqMan探针探针
Hoxa9（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：Mm00439364_m1）
（Gapdh）（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：Mm99999915_g1）
TaqMan快速高级主混合物（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，产品目录号：4444557）
25X磷酸盐缓冲盐水Ca2 + / Mg2 + / PBS（见食谱）
D10媒体（见食谱）
R10媒体（见食谱）
R10W10媒体（见食谱）
0.5M EDTA溶液（见食谱）
ACK裂解缓冲液（见食谱）
SM缓冲区（见食谱）
细胞因子库存（见食谱）
交流媒体（见食谱）

设备

5％CO 2培养箱37℃
5％CO 2培养箱32°C
MACS多中心（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）
移液器P2，P20，P200，P1000
Portable Pipet-Aid XP移液管控制器（Drummond Scientific，目录号：4-000-101）
显微镜
细胞计数器
高压灭菌器
1升玻璃瓶
摇床
手术剪刀和钳子
层流柜
离心15毫升锥形管
MiniMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-102）
StepOnePlus TM实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：StepOnePlus TM，目录号：4376600）。
用于Western印迹和SDS-PAGE的通用设备

软件

GraphPad Prism（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）

程序

附表（见图1）：
第一天1.开始从冷冻的原料培养PLAT-E细胞第3天。Replate PLAT-E细胞转染
第4天。转染PLAT-E细胞
第5天c-kit阳性细胞的制备
第6天。将逆转录病毒转导到c-kit阳性细胞中
第7天加入G418
第十二天第一段
第十七天第二次通过
第22天：殖民统计和第三次通过
第27天殖民地计数

图1.小鼠骨髓祖细胞转化实验的时间表

<强>

病毒制备
1. 在第1天，从冷冻原液中解冻PLAT-E细胞，并在37℃5％CO 2中用10ml D10培养基（见食谱）在10cm培养皿中培养4×10 6个细胞。 2>孵化器。
2. 在第3天，在37℃的5％CO 2中用5ml D10培养基重新铺板6cm胶原蛋白包被的培养皿中的8×10 5 PLAT-E细胞，孵育器（一个阳性对照[MLL-ENL]，一个阴性对照[空载体; pMSCV-neo]，两个用于G418选择的模拟对照和样品[至多16个样品]）。
3. 第4天，用8μgDNA和20μlLipofectamine TM 2000转染试剂转染PLAT-E细胞。转染时，细胞汇合度应为60-70％。（详细地说，在500μlOpti-MEM TM培养基中稀释8μgDNA，并在500μlOpti-MEM TM培养基中稀释20μlLipofectamine TM 2000转染试剂， 5分钟后，将DNA溶液与Lipofectamine TM 2000溶液合并，轻轻混合并在室温下孵育20分钟，加入DNA-Lipofectamine混合物每个培养皿中，并在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。）6小时后，用新鲜的D10培养基代替培养基并在32℃5％CO 2，孵化2天。
  注意：病毒上清液应该在每个实验中新鲜制备，因为逆转录病毒是不稳定的储存。
制备c-kit（CD117）阳性的祖细胞
1. 在第5天，从五周龄的C57BL / 6J小鼠（图2A）尽可能彻底地收获股骨和胫骨并去除周围肌肉。
2. 切割股骨和胫骨的末端，并用10毫升PBS冲洗骨髓（参见食谱），使用附带21 G针的10毫升注射器（图2B）（视频1）。
  
  视频1
3. 通过21G针轻轻匀化骨髓细胞几次
4. 在室温下将细胞在400×g下旋转5分钟（图2C左），然后尽可能多地除去上清液。
5. 重悬细胞在1毫升的ACK裂解缓冲液（见食谱），并在冰上孵育1分钟。
6. 加入10毫升R10W10培养基（见食谱），在室温下将细胞在400×g下旋转5分钟，然后除去上清液。
7. 将细胞重悬于10ml SM缓冲液（参见食谱）中，并在室温下400×g下旋转5分钟（图2C右），然后除去上清液。
8. 用0.5 ml SM缓冲液重悬细胞，加入20μlCD117微珠，在冰上或冰箱中孵育20分钟。
9. 加入10ml SM缓冲液并在室温下400×g离心5分钟，然后取出上清液洗涤细胞。
10. 按照步骤B9再次清洗细胞。
11. 在磁力架上安装MS柱，并用1 ml SM缓冲液平衡。
12. 将预分离过滤器放在色谱柱顶部，通过预分离过滤器（图2D）将细胞加载到MS色谱柱上。
  
  图2. c-kit阳性祖细胞分离的代表性图像A.收获的胫骨和股骨; B.用PBS冲洗骨髓; C.通过ACK缓冲液处理去除红细胞; D.通过MACS的c-kit阳性细胞分离。
13. 用1 ml SM缓冲液清洗柱子两次
14. 从磁力架上取下柱子，放在新的15毫升锥形管上。
15. 向柱中加入1 ml SM缓冲液，通过重力流动（任选使用活塞）洗脱c-kit阳性细胞。
16. 加入10ml R10W10培养基，室温下400×g离心5min，取出上清液。
17. 重悬在1毫升R10W10中的所有细胞，并转移到48孔板的一个孔中。
18. 加入细胞因子（10ng / ml SCF，10ng / ml IL-3,10ng / ml终浓度的IL-6）并将细胞在37℃5％CO 2培养箱过夜。
病毒转导和细胞培养
1. 在第6天，计数细胞。预计每只小鼠总共有1-2×10 6个c-kit阳性细胞。
2. 加入适量的R10W10培养基以制备1×10 5个细胞/ ml悬浮液并加入1/250体积的10mg / ml聚凝胺溶液。
3. 将0.5 ml细胞悬液分装到15 ml锥形管中（另外准备两个模拟感染对照）。
4. 用5毫升注射器吸取5毫升病毒上清液，将一个过滤器（0.45微米）连接到5毫升注射器，并将病毒上清直接添加到c-kit阳性细胞悬液。
5. 在32℃下将细胞悬浮液在1,100×g下旋转2.5小时（Spinoculation）。
6. 在接种过程中，在PLAT-E细胞中加入1ml PBS，使用细胞提取器收获细胞，并将细胞转移到新管中。
7. 再次用1ml PBS洗涤包装细胞，并在500μlWB裂解缓冲液中制备全细胞裂解液。
8. 接种后，取出病毒上清液（留下大约200μl培养基），将细胞重新悬浮于残留培养基中，加1ml AC培养基（参见食谱），使用装有18G针头的1ml注射器，通过涡旋混合。
  注意：使用1毫升注射器和针头取1毫升AC介质，因为这种介质非常粘稠。移液器不能使用。
9. 将含有细胞的15-ml锥形管在37℃5％CO 2培养箱中培养过夜。
10. 第7天，加入20μlG418溶液，涡旋混合，并使用装有18G针的1ml注射器将细胞转移至12孔板中。对于两个模拟控制，在一个管中添加G418以确保G418选择正常。
  注意：样品应放置在12孔板的中央6个孔中，PBS应添加到外围6个孔中以防止AC介质中的培养物干燥。
11. 在37℃5％CO 2培养箱中孵育5天（图3）。如果培养过程中由于细胞过多而使培养基变成橙色，则添加1毫升含G418的AC培养基。
  注：保持良好的文化条件是重要的。过度生长会严重影响下一轮文化中的殖民地形成。
12. 任选地，可以在第一轮培养期间通过WB检查包装细胞中转基因的蛋白质表达。
  
  图3.第一轮和第四轮培养期间的菌落图像
第一段
1. 在第12天，用10ml PBS收集细胞，转移到15ml锥形管中，并在室温下400×g下旋转5分钟。
2. 用10毫升的PBS洗细胞。
  注意：通过剧烈的移液来清除AC介质的碎屑是非常重要的。
3. 将细胞重悬于1ml R10W10培养基中，并计数细胞。
4. 转移4×10 4细胞到一个新的15毫升锥形管，并添加适量的R10W10准备200-μl细胞悬液。
5. 加入1毫升AC介质，涡旋混合。使用1-ml注射器连接18 G针将细胞转移到新的12孔板的孔中。
  注意：样品应放置在12孔板的中央6个孔中，PBS应添加到外围6个孔中以防止AC介质中的培养物干燥。
6. 将细胞在37℃5％CO 2培养箱中孵育5天。如果在培养过程中媒体变成橙色，则再向孔中添加1毫升交流媒质。
7. 任选地，如方法E中所述，将残余细胞收集到新管中并裂解含有RNeasy Mini试剂盒的1％β-巯基乙醇的RLT裂解缓冲液中的细胞用于RNA分离。
细胞收集和分析
1. 使用RNeasy®mini试剂盒分离RNA，并使用带有oligo-dT引物的Superscript®III第一链合成系统合成cDNA。
2. 通过定量PCR评估基因表达。在通过MLL-融合基因进行的骨髓祖细胞转化的情况下，Hoxa9基因表达是永久化的一个很好的指标。
第二段
1. 第17天，收集细胞并计数
2. 培养2×10 4个细胞/孔。
殖民统计和第三次通过
1. 在第22天，在显微镜下计数菌落数。
  注意：在载体对照中不应该观察到菌落。设定一个定义殖民地的标准并在整个研究中使用这个定义是很重要的。我们通常认为一个有100多个细胞群作为殖民地。
2. 像第一代一样收获和计数细胞。
3. 培养1×10 4个细胞/孔。
菌落计数
在第27天，在显微镜下计算菌落数（图3）。

数据分析

由于实验的变化，这个检测必须执行至少三次。
为了统计分析，我们使用GraphPad Prism软件。为了比较两个数据集，我们执行Student's t -test。为了比较三个或更多的数据集，我们进行方差的单向分析和事后Tukey校正。

食谱

（PBS）（1L）的25x磷酸盐缓冲盐水Ca 2 + / Mg 2+ /
1. 混合200g NaCl，72.4g Na 2 HPO 4•12H 2 O，5g KH 2 PO 4， 4克和5克KCl
2. 用蒸馏水调至1L
3. 在121°C高压灭菌20分钟
4. 用蒸馏水稀释至1x以获得工作溶液
D10媒体

加入55毫升FBS和5.5毫升P / S溶液到500毫升DMEM中
R10媒体
加入55毫升的FBS和5.5毫升的P / S溶液到500毫升的RPMI 1640
R10W10媒体
1. 培养WE10在R10媒体融合
2. 当媒体变成橙色时，收集和过滤媒体
  （0.22-μm）
3. 分装和存储在-80°C
4. 加入55毫升FBS，55毫升WEHI-3培养基和5.5毫升P / S溶液到500毫升RPMI 1640中。
0.5M EDTA溶液
1. 称取93.06克EDTA
2. 用蒸馏水调至1升，用NaOH调节pH至8.0
ACK裂解缓冲液
1. 混合8.29克NH 4 Cl和1克KHCO 3。
2. 用蒸馏水加1升
3. 加200μl的0.5M EDTA溶液
4. 过滤（0.2-μm）并在4°C保存
SM缓冲区
1. 加入15 ml FBS到500 ml 1x PBS中
2. 过滤（0.2-μm）并在4°C储存
细胞因子库存
1. 在PBS + 0.1％BSA中将细胞因子（SCF，IL-3，IL6，GM-CSF）溶解至50μg/ ml
2. 分装和存储在-80°C
AC介质（或者STEMCELL Technologies，Vancouver，Canada的Methocult M3231）
1. 将IMDM粉末溶于500ml蒸馏水中，加入3g NaHCO 3和过滤器（0.2-μm）。
2. 在1升玻璃瓶中称量16克甲基纤维素
3. 在121℃高压灭菌甲基纤维素粉20分钟
4. 将无菌甲基纤维素溶于300ml无菌水和500ml IMDM的振荡器中过夜。
5. 加200毫升的FBS和7微升的β-巯基乙醇
6. 分装每瓶100毫升，并储存在-20°C
7. 使用前，加20μLSCF，20μLIL-3,20μLGM-CSF和1mlP / S溶液到100ml培养基中

致谢

这项研究得到了JSPS KAKENHI对H.O.的资助。（编号17H07379）和A.Y. （编号16H05337）。该协议基于Lavau等人的先前报道（1997）。作者宣称没有利益冲突。

参考

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