材料和试剂

60mm组织培养灭菌皿（Corning，Falcon ，产品目录号：353004）
25cm2组织培养无菌瓶（Corning，目录号：430639）
35毫米组织培养灭菌皿（Corning，Falcon ，目录号：353001）
无菌细胞刮刀（Corning，Falcon ，目录号：353086）
15毫升锥形无菌管（康宁，猎鹰，目录号：352096）
50毫升锥形无菌管（康宁，猎鹰，目录号：352070）
4孔组织培养无菌板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：176740）
6孔组织培养无菌板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：140675）
100mm组织培养无菌皿（Corning，Falcon ，目录号：353003）
60毫米超低附着培养无菌培养皿（康宁，目录号：3261）
5毫升塑料一次性无菌吸管（SARSTEDT，目录号：86.1253.001）
10毫升塑料一次性无菌移液器（SARSTEDT，目录号：86.1254.001）
25毫升塑料一次性无菌移液器（SARSTEDT，目录号：86.1685.001）
0.22μm无菌过滤系统（Corning，目录号：431097）
无菌玻璃巴斯德移液管（VWR，目录号：HECH40567001）
制造商：Glaswarenfabrik Karl Hecht，目录号：40567001。
无菌CryoTube样品瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：375418）
50/30μm二乙烯基苯/ Carboxen / PDMS（DVB / CAR / PDMS）与手动固定器（Sigma-Aldrich，目录号：57328-U）一起使用的SPME纤维组件，
用于手工取样（西格玛奥德里奇，目录号：57330-U）的SPME光纤支架
定制的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）盖子有60mm的组织培养皿（50mm i.d x 60mm h），具有适合于固相微萃取纤维插入（1mm i.d.×40mm h）的载体（图1）。该系统由三部分组成：a）盖子; b）SPME纤维支持物和c）岛津GC隔片（Shimadzu，目录号：201-35584）。详情见图2

图1.聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）中的定制盖子。该系统适用于60 mm以上组织培养皿的顶空生成，并配备了固相微萃取纤维插入支持，以实现顶空VOC采样。

图2. PMMA定制盖子的细节。：一种。盖子; B. SPME纤维支持; C.岛津GC隔片（岛津）。
A型（Sigma-Aldrich，目录号：G1890）猪皮明胶
达尔伯克磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）（Mediatech，目录号：21-031-CV）
XI型胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C7657）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
胰蛋白酶-EDTA（CARLO ERBA试剂，目录号：FA30WL0940100）
IV型胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C5138）
Accutase（Merck，产品目录号：SCR005）
聚-L-鸟氨酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4957）
2-乙基-1-己醇（Sigma-Aldrich，目录号：08607）
苯乙烯（Sigma-Aldrich，目录号：45993）
己醛（Sigma-Aldrich，目录号：18109）
3-己烯-1-醇，丙酸酯，（Z） - （Sigma-Aldrich，目录号：W393304）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：48358）
o-Cymene（在NIST 127和NIST 147质谱文库中，以替代品名称：苯，1-甲基-2-（1-甲基乙基） - ）（Sigma-Aldrich，目录号：255270）
1,4-环己二烯，1-甲基-4-（1-甲基乙基） - （Sigma-Aldrich，目录号：86476）
丙酸，2-羟基-2-甲基 - 乙酯（Sigma-Aldrich，目录号：E31200）
壬醛（Sigma-Aldrich，目录号：442719）
丁酸乙烯酯（Sigma-Aldrich，目录号：19390）
十三烷（Sigma-Aldrich，目录号：442713）
Decanal（Sigma-Aldrich，目录号：59581）
丙酸，2-甲基 - ，酸酐（Sigma-Aldrich，目录号：245771）
丁酸2-甲基丙酯（Sigma-Aldrich，目录号：94888）
十六烷（Sigma-Aldrich，目录号：442679）
甲酮，（4-氨基苯基）苯基 - （Sigma-Aldrich，目录号：A41402）
十七烷（Sigma-Aldrich，目录号：51578）
3,5-二甲基-4-辛酮（Sigma-Aldrich，目录号：S504696）
丁酸酐（Sigma-Aldrich，目录号：19270）
小鼠层粘连蛋白（Merck，目录号：CC095）
CHANG MEDIUM C冻干（Irvine Scientific，目录号：T101-019）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco，产品目录号：10270）
青霉素 - 链霉素溶液（CARLO ERBA试剂，目录号：FA30WL0022100）
L-谷氨酰胺（CARLO ERBA试剂，目录号：FA30WX0550100）
Dulbecco改良的Eagle's中高葡萄糖（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D5671）
DMEM / F-12 1:1（Sigma-Aldrich，目录号：D6421）
Knockout SR血清替代品（KOSR）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：10828028）
MEM非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11140050）。
2-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31350010）
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：PHG6015）
视黄酸（Sigma-Aldrich，目录号：R2625）
刺猬通路激活剂（Hh-Ag1.3）（Curis，Lexington，MA）
人类BDNF（PeproTech，目录号：450-02）
重组人CNTF（PeproTech，目录号：450-13）
人类GDNF（PeproTech，目录号：450-10）
张中（CVS中）（见食谱）
MEF介质（见食谱）
hiPS细胞培养基（见食谱）
EB介质1（见食谱）
EB介质2（见食谱）

设备

CO 2孵育器（37℃）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heracell TM 150i）
倒置显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse TE2000-S）
移液器（20μl，200μl和1000μl）（Gilson，目录号：F167300）
离心机（配备有带圆桶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM）的TX-200摆动桶式转子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：75003658）目录号：75003659）适用于加工多达20 x 15 ml的锥形管，适配器的灵活容量范围为15至50 ml，最高转速为5,500 rpm（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus TM Multifuge TM X1，目录号：75004210）
带有UV表面消毒辐照器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Herasafe TM KS，Class II，目录号：51022481）的Herasafe KS，II类生物安全柜
变焦立体显微镜（尼康仪器，型号：SMZ100）
气相色谱 - 质谱（GC / MS）系统（岛津，型号：GCMS-QP2010）
用于SPL注射器的SPME衬垫，特殊的SPME衬垫，无填充，苯基甲基钝化失活（Shimadzu，目录号：961-01482-01）
等量-5毛细管柱（聚（5％二苯基/ 95％二甲基硅氧烷）相; 30m长x 0.25mm i.d .;膜厚度：0.25μm）（Sigma-Aldrich，目录号：28089-U）
超高纯度氦气（99.999％）

软件

GCMS解决方案（版本2.4，岛津公司）
NIST 127和NIST 147质谱库（美国国家标准与技术研究院 - http://www.nist.gov/）
MATLAB ®（版本R2016 b，MathWorks）

程序

用于挥发性代谢物分析的细胞培养样品的制备
1. 来自三个独立样品的绒毛膜绒毛样品（CVS）
  1. 60毫米的培养皿用2毫升的0.1％明胶包被，并在37°C孵育至少20分钟。
  2. 经过几次PBS洗涤后，通过与胶原酶XI在37℃下连续温育30分钟，然后在37℃下0.25％胰蛋白酶-EDTA 10分钟，使CVS细胞解聚。
  3. 使用轻轻移液将集料解离，在266xg离心10分钟并如先前在Spitalieri等人所述用2ml Chang培养基（参见食谱）接种于三个涂有明胶的60mm培养皿上，2009年。
  4. 使用胰蛋白酶将CVS细胞从25cm 2培养瓶上分离，并用2mlChang培养基（参见食谱）以2.5×10 6接种于三个明胶包被的60mm培养物菜肴。
  5. 将细胞培养皿在37℃，含有5％CO 2的培养箱中温育24小时。
2. 人诱导多能干细胞（hiPSC）
  1. CVS细胞在人多能干细胞（hiPSC）中使用单个慢病毒“干细胞盒”重编程，两侧是loxP位点（hSTEMCCA-loxP），其编码重编程因子（OCT4，SOX2，KLF4和c-MYC）单个多顺反子载体（Spitalieri等人，2015）。详情见图3.
  2. 一旦获得，hiPS细胞被扩增，当达到汇合时使用立体显微镜下的机械通道（请参见注释1），并放置在辐射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上，直到在35mm培养板中良好建立至少5通道。
  3. hiPSC培养基（见食谱）每天更换。请参阅注释2.
  4. 将具有不同基因型的三个独立的hiPS细胞系在60mm培养皿（4×10 6个细胞/培养皿）上用2ml hiPSC培养基辐射的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层进行传代。请参阅注释2.
  5. 将细胞培养皿在37℃，含有5％CO 2的培养箱中温育24小时。
    
    图3.CVS细胞和hiPSC中GC / MS分析的时间线。从人类样品中分离CVS细胞，通过与GC / MS连接的SPME分析挥发性代谢物，然后在hiPSC中重新编程。在感染14天后在饲养层上观察到胚胎干细胞样集落，并且在利用机械通道的膨胀之后进行VOC分析。
3. 浮动EBs
  第1至6天
  1. 根据Nakahama和Di Pasquale在2016年报告的一些修改，形成被称为胚状体（EB）的细胞聚集体后，进行神经诱导。
  2. 将hiPS细胞系用胶原酶IV / Accutase溶液在37℃下处理8分钟，并使用细胞刮刀从平板底部分离。
  3. 将菌落收集在15ml锥形试管中，在17℃下离心5分钟，并以2：1的比率（平板）接种在不含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的hiPSC培养基上例如，对于两个35mm的hiPSC培养皿，使用1个60mm超低附着培养皿的培养皿）。细胞沉淀物轻轻地重新悬浮，避免破坏团块太多。请参阅注3
  4. 在没有bFGF的hiPSC培养基中，除了通过后的第一天，每天更换6天。请参阅注释4.
  5. 将改变的培养基EB收集在15ml锥形管中，在17℃下离心5分钟，轻轻地重新悬浮在新鲜培养基中。
  6. 将3个独立的浮动EB样品（2×10 6个样品/培养皿）置于2ml不含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的hiPSC培养基上，在60mm超低附着培养皿中。
  7. 将细胞培养皿在37℃，含有5％CO 2的培养箱中温育24小时。
  第7至13天
  1. 在第7天，使用10ml移液管将EB收集到立体显微镜下的15ml锥形管中，在17gxg下离心5分钟并轻轻地重悬在EB培养基1中（参见配方4） br />
  2. 将细胞培养皿在37℃下在具有5％CO 2的培养箱中孵育，并且EB培养基1每天更换一周。
  第14至20天
  1. 在第14天，按照上面在步骤A3e中报告的相同程序，将EB培养基1移出并用EB培养基2代替（参见方案5）。
  2. 将细胞培养皿在37℃下在具有5％CO 2的培养箱中孵育，并且EB培养基2每天更换另外的7天。
  第21天
4. 早期神经祖细胞（NPs）
  1. 60mm培养皿在37℃下用0.01％聚-L-鸟氨酸包被过夜，然后用20μg/ ml层粘连蛋白在37℃包被2小时。用PBS洗板3次，留在层流罩中干燥（Varga et al。，2014）。
  2. 将漂浮的EB收集到15ml锥形管中，在17℃下离心5分钟，轻轻地重悬浮并转移到60mm聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的平板（Varga等，2014）在2ml EB培养基2中。
  3. 细胞培养皿在37℃，5％培养箱中孵育24小时。所有的样品制备都按照Capuano等人在2017年描述的方法进行。
    图4显示了hiPSC分化为NPs的时间表和分析时间表。
    
    图4. NPs分化过程中GC / MS采样的时间线人类诱导的多能干细胞（hiPSCs）通过形成浮游胚状体（EB）而分化成早期神经祖细胞（NPs）。挥发性有机化合物的分析是在分化的不同日子进行的（浮动EBs第1-4天，浮动EBs第9-11天，浮动EBs第15-18天和早期NPs电镀后24小时）。
GC / MS联用分析SPME对挥发性代谢物的影响
1. 该协议适用于以下样本的分析：
  1. 在24小时的孵育时间后（分别在步骤A1d和A2d后）CVS和hiPSC;
  2. 在第1天，第4天，第9天，第11天，第15天和第18天（分别在A3e，A3g，A3i阶段）进行不同分化阶段的浮动EB;
  3. 早期神经祖细胞（NPs）在电镀24小时后（步骤A4b之后）;
  4. 张中;
  5. hiPSC中等;
  6. 不含bFGF的hiPSC培养基;
  7. EB介质1;
  8. EB介质2。
  注意：在VOC采样之前，细胞培养基总是预先孵育24小时。这些是分析每个细胞系的“样品零点”。
2. 为了防止培养物污染，定制的盖子在生物罩的紫外线下进行20分钟的灭菌处理。
3. 消毒后立即将盖子放在含有在培养箱中培养的感兴趣的细胞培养物的培养皿中。
4. SPME光纤支架已经组装（图5）。
  为确保挥发性化合物取样的重复性，建议将SPME针的深度设定为相同的值。在这个实验中，采样系统需要将其设置在柱塞上的4深度量规上。
  注意：为防止SPME纤维污染，最好在使用前立即组装。在任何取样程序之前的12个小时，SPME纤维已经按照SUPELCO指导原则进行了调整：DVB / CAR / PDMS纤维在270℃下烘烤1小时，然后储存在自己的盒子中直到使用。
  
  图5. SPME光纤设备。组分（a），（b）和（c）构成用于手工取样的SPME光纤夹持器;元素（d）是包含和保护DVB / CAR / PDMS光纤的针系统。
5. 将针头保护的SPME纤维插入适当的盖子支架，然后将纤维暴露于细胞培养顶部空间。
6. 挥发性代谢物使用固相微萃取（SPME）技术（Capuano等人，2017）预浓缩。将50/30微米的二乙烯基苯/ Carboxen /聚二甲基硅氧烷（DVB / CAR / PSMS）纤维（SUPELCO）插入细胞培养顶部空间1小时。为了避免对细胞生长的任何应力作用，将样品在培养器中在37℃和5％CO 2的温度下维持在培养器中（Capuano 等，2017）。
7. 挥发性有机化合物吸附后，将纤维拉入针内并从支架上取下放入其中，纤维储存在4°C直到GC / MS分析，在三个小时内进行。
8. 使用配备Equity-5（或等效）毛细管色谱柱和SPME（适用于SPME）的适当衬管的GCMS-QP2010（Shimadzu）进行GC / MS分析（详情请参阅设备章节）。吸附在DVB / CAR / PDMS纤维上的挥发性化合物在GC注射口中在250℃下以不分流模式解吸3分钟。使用高纯度氦气作为载气，流速为0.7毫升/分钟，总流量为5.9毫升/分钟，压力为24.9千帕。以30.2厘米/秒的线速度恒定模式进行分析。进口，离子源和传输线的温度保持在250°C。保持40℃的初始烘箱温度5分钟，然后以7℃/分钟升温至220℃，然后以15℃/分钟升温至300℃的最终温度，保持3分钟总运行时间：39分钟）。质谱仪是以电子电离模式操作的单四极杆分析仪，具有70eV的电子能量。质谱在全扫描模式下从40到450m / z记录。
  图6总结了从B2到B8的步骤。
  
  图6. SPME与气相色谱 - 质谱联用分析细胞培养物的VOC分析工作流程
9. 使用Shimadzu工作站软件GCMS解决方案（版本2.4）进行色谱图采集和数据处理。检测到的峰的化学鉴定使用NIST 127和NIST 147文库进行。图7和图8显示了GC / MS谱图的实例。
  
  图7.浮游EB细胞在第9天培养的挥发性代谢物的GC / MS谱图来源于总离子色谱图GCMS解决方案软件详细阐述的数据。由于细胞培养条件改变和/或细胞系不同，挥发性化合物的分布可能与组成和浓度有所不同。
  
  图8.绒毛膜绒毛（CVS）（红线），浮动胚状体（EB）在第9天（黑线）的挥发性代谢谱，人诱导的多能性的总离子色谱图干细胞（hiPSCs）（蓝线）和早期神经祖细胞（NPs）（粉红线）。使用GCMS解决方案软件详细阐述数据。由于改变细胞培养条件和/或不同的细胞系，挥发性化合物的分布可能与组成和浓度不同。
10. 通过比较样品色谱图中记录的保留时间和质谱与由标准化合物和培养基组成的溶液分析得到的保留时间和质谱，证实了表1中可商购的那些化合物的特性。 VOC收集和分析按照与样品相同的步骤进行（参见步骤B6-B8）。这些化合物的子集的丰度在细胞系中被发现有统计学差异（Capuano et al。，2017）。
  
  表1.在所有样品的色谱图中发现的化合物列表，并且已经通过分析标准对其进行了鉴定
11. 苯乙烯和2-乙基-1-己醇通过比较保留时间和质谱与用分析标准得到的质谱鉴定和定量。制备三种浓度的苯乙烯和1-己烯醇-2-乙基，在60毫米培养皿中稀释1,10,100倍于2毫升不同培养基中的纯化合物。顶空挥发性有机化合物通过DVB / CAR / PDMS-SPME纤维在样品中暴露1小时进行收集。苯乙烯和2-乙基-1-己醇在标准溶液顶部空间中的浓度（Cx）按照安托万定律（以十亿分之几体积（ppbv）计算）：
  
  其中，P是蒸气压（bar），T是工作温度（K）。参数A，B和C是NIST数据库中使用可用参数的物质性质的经验常数（ http： //webbook.nist.gov/chemistry ）。在细胞培养顶部空间（CVS，hiPSC，不同阶段和早期NP中的EB）中的苯乙烯和2-乙基-1-己醇（以ppbv计）的量（A x）是从样品中的峰面积（PA ）和标准（PS ）的峰面积计算的，如下所示：
  
  注意：该程序适用于任何由分析标准鉴定的化合物。

数据分析

各种细胞系和培养基在独立样本中复制三次
测量的色谱图被整合，并且每个峰的绝对面积被认为是估计VOC丰度。
色谱峰校准是手动进行的，考虑到保留时间和几个色谱图中峰的质谱。
GC / MS VOC丰度数据排列在矩阵中，其中每行对应于样品，列中每个积分峰的曲线下包含区域。数据已经用多元分析技术进行分析，如主成分分析（PCA）（Capuano等人，2017）。
通过应用于不同细胞系之间的二元比较的参数Kruskal-Wallis秩和检验评估不同细胞系中VOC丰度的统计显着性（表2）。对培养基相关数据进行相同的测试，以消除表征不同培养基的VOC而不是细胞代谢。

表2.使用Kruskal-Wallis秩和检验考虑进行二元比较的细胞培养夫妇
在多元数据分析中不考虑由Kruskal-Wallis秩和检验得出的文化媒体歧视中的重要化合物。
通过Kruskal-Wallis秩和检验选择的所有化合物的丰度（ p <0.05）形成了细胞顶空的模式。未使用主成分分析（PCA）分析归一化数据。这种多变量方法允许比较不同的细胞系数据，以便以图形方式表示它们之间的差异和相似性。
在Capuano 等，2017年对PCA的结果进行了充分的讨论。
所有数据分析都使用MATLAB进行。

笔记

hiPS细胞的机械通道必须在常规层流罩下使用立体显微镜进行。细胞应该大约每5天传代一次，大约在60-75％的汇合度，细胞不接触，使用拉式玻璃巴斯德吸管移除分化区域。
hiPS细胞培养基必须每天更新以获得最佳生长，然而，偶尔的双重喂养（在一次饲喂期间添加所需量的培养基两倍）是可能的，而不影响培养质量。例如，可以在星期五执行双重输入，下个媒体在星期天更改。 hiPS细胞培养基必须在室温下预先加热，避光，建议在使用前解冻并在培养基中添加生长因子。
。避免过度移液，过分分解菌落，检查立体显微镜下的大小。

食谱

张中等
CHANG MEDIUM C冻干含有以下补充剂：
10％胎牛血清（FBS）
100U / ml青霉素
100毫克/毫升链霉素
2mM L-谷氨酰胺
MEF中等
含有以下补充剂的D-MEM：
10％胎牛血清（FBS）
100U / ml青霉素
100毫克/毫升链霉素
2mM L-谷氨酰胺
hiPS细胞培养基
包含以下补充的DMEM / F-12：
20％KnockOut血清替代品（KOSR）
100U / ml青霉素
100毫克/毫升链霉素
2mM L-谷氨酰胺
1％MEM非必需氨基酸
0.1 mMβ-巯基乙醇
最后，使用0.22μm瓶顶真空过滤器并补充10ng / ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）来对培养基进行灭菌。
EB介质1
不含bFGF的hiPS细胞培养基补充有：
1μMRA（视黄酸）
500mM Hh-Ag1.3（声波刺猬蛋白通路激动剂）
EB介质2
hiPS细胞培养基减去补充有：
的bFGF 1μMRA
500 mM Hh-Ag1.3（Sonic Hedgehog途径激动剂）
20 ng / ml睫状神经营养因子（CNTF）
10 ng / ml脑源性神经营养因子（BDNF）
10 ng / ml胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）

致谢

这是Capuano等人（2017）报道的分析的详细方案，根据以前的工作（Spitalieri等人，2015; Murdocca等人。2016a; Murdocca等人，2016b）。作者声明他们没有竞争利益。

参考

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