材料和试剂

剃刀片
双面胶带（永久双面胶带）（Scotch，目录号：3136）
玻璃显微镜幻灯片（75×25毫米）（VWR，目录号：48300-025）
充电显微镜幻灯片（75×25毫米）（VWR，目录号：48312-905）
0.2微米过滤器（Whatman GD / X 25毫米无菌PVDF注射器过滤器）（GE Healthcare，目录号：6900-2502）
新鲜洋葱鳞茎（洋葱cepa ，cv。Cometa），直径约8厘米
指甲油（硝酸纤维素溶于丁基和乙酸乙酯）
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸钠盐（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H7006）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
乙酸钠，无水（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
洗涤缓冲液（见食谱）
成像缓冲区（见食谱）

设备

镊子
布鲁克尺寸图标原子力显微镜与ScanAsyst和PeakForce QNM（定量Nanomechanical属性映射）操作包
Scanasyst-fluid +原子力显微镜（布鲁克，加州）
摇摆平台（VWR，型号：200型）
幻灯片加热器（50°C）（Fisher Scientific，型号：77型，目录号：12-594）

软件

用于AFM操作的纳米镜和用于图像分析的纳米分析（Bruker）

程序

从当地的杂货店购买新鲜的洋葱鳞茎（洋葱cepa ，cv。Cometa或类似的白色品种，直径〜8厘米）。洋葱可以在4°C储存两周。
去除干燥的纸质外层。肉质鳞片连续编号为1,2,3 ...，n，鳞片＃1是最老的最外层（图1A）。
将5号刻度作为〜1厘米宽的条带，并将2×1.2厘米的双面胶带压在洋葱刻度的上中部（靠近尖端）的凸面，背面上（图1B）。
用手剥去表皮（用胶带），修剪至〜1.5×1.2厘米（图1C），并将胶带和样品放在干净的载玻片上，样品面朝上。按下样品的周长到幻灯片上。
用一条细小的指甲油密封样品的周边，在样品中心加一滴水（〜20μl）清洗缓冲液（见配方），以防止其干燥（图1D）。洗涤缓冲液不应淹没周围静止的指甲油。步骤2至5应在约30秒内完成。

图1.原子力显微镜下洋葱表皮的制备步骤A.刻度＃1的洋葱鳞片是最老的最外层。通常使用5号刻度的表皮来进行成像，但是其他的刻度与这个程序是一致的。 B.切下1厘米宽的条状物，并将双面胶带压在洋葱鳞上部中部（尖端附近）的远轴侧。 C.表皮与胶带一起剥离。 D.将表皮和胶带压在载玻片上，并将一滴洗涤缓冲液加到样品的中心。
在加入更多相同的洗涤缓冲液（〜100μl）之前，让指甲油固化约2分钟或更长时间，并在摇摆平台上轻轻摇动至少20分钟。将玻片置于盖子关闭的培养皿中以减少蒸发。在扫描之前，检查光学显微镜下的剥离，以确认表皮细胞壁确实与细胞的其余部分分开，暴露出壁的内表面直接与AFM尖端接触。
注意：根据我们的经验，离轴表皮的剥离导致外（周边）细胞壁与表皮细胞层的其余部分分离。然而，这并不总是一致的，并且必须通过在洗涤剂清洗步骤之后通过光学显微镜检查剥离来验证。具有锯齿状边缘或类似牙齿特征的细胞通常是开放的，并且是AFM成像的良好候选者（图2）。应该没有核和其他细胞器。对于原子力显微镜的观察，并不是所有的细胞都以这种方式分裂是不必要的。 AFM成像可以忽略具有完整细胞壁的果皮区域。洋葱鳞片表皮的优点是它通常以这种方式非常可重复和均匀地剥离。来自其他组织的表皮层有时会以相似的方式分裂，其他组织则不会。这必须通过反复试验来确定。

图2.光学显微照片显示AFM尖端盘旋在表皮细胞上方。锯齿状的牙齿状结构是表皮细胞分裂开的好迹象。
根据制造商的协议，用干净的载玻片将AFM尖端的偏转灵敏度（〜50-60 nm / V）和弹簧常数（0.2-0.7 N / m）校准。需要手动输入尖端半径（〜1.8nm），尖端半角（17.5°）和样品泊松比（估计为0.3）。这里给出的数值是基于我们经常使用的提示（Scanasyst-fluid + AFM提示），对于其他提示可能会有所不同。
在整个扫描过程中，将样品浸入成像缓冲液（20mM HEPES缓冲液[pH 7.0]或20mM乙酸钠[pH 4.5]中，参见食谱）。
以2 x 2μm大小和512 x 512采样率开始扫描（因此分辨率约为4 nm /像素）。对于高分辨率的图像，扫描0.5 x 0.5μm或更小的样品。所有材料的扫描参数并不相同，但通常落入以下经验确定的范围：峰值力设定点（600pN-1.5nN），扫描速率（0.4-0.7Hz），峰值力频率（1 kHz），尖端速度（0.9-1.5μm/ sec）。增益由软件自动控制，但设定值和扫描速率通常由用户控制，以保证整个成像的一致性（图3）。
对于标准细胞壁成像，扫描每个样品至少5个不同的细胞，并选择代表性的图像进行进一步分析。

图3. AFM操作期间Nanoscope界面的屏幕截图。显示四个不同的通道：高度，峰值误差，DMT模量和粘附力。每条扫描线的曲线回扫曲线显示在每个通道下。实时力 - 距离曲线显示在右上角。＆nbsp;＆nbsp;

数据分析

在Nanoscope Analysis软件中，图像通常是平坦的，以消除每个扫描线上的倾斜或弯曲，并以TIFF格式输出。要输出灰度图像，请选择颜色表0.有代表性的数据请参见Zhang et al。（2014）。

笔记

所有的缓冲液必须纯度最高，使用ddH 2 O和0.2μm过滤器过滤。
虽然我们的大部分工作是洋葱5号标尺，但是也可以使用其他尺度的墙壁，并与光学技术同时进行研究（Kafle et。，2014）。
在获取图像时，应监测实时力曲线以优化针尖与表面的接触，从而生成更好的分辨图像和更精确的机械制图数据。此外，应该观察每个通道显示的跟踪 - 回扫曲线，以了解样本移动的指示或较差的端面相互作用。如果样品机械不稳定或尖端与表面没有良好接触，则分辨率可能较差或可能会产生成像伪影。
为了从洋葱薄壁组织中制备壁，剥离表皮层的背面和近轴面，并在液氮中研磨薄壁细粉。用20mM HEPES缓冲液（pH7.0）和0.1％Tween-20洗涤细胞壁沉淀三次，或直到上清液澄清（在1500gxg离心3分钟）。重悬在20毫米HEPES缓冲区的墙壁碎片，并添加一个样品液滴到一个干净的带电玻璃幻灯片。在一台载玻片加热器（50°C）上蒸发多余的水分，直到样品仍然明显湿润，但粘附在载玻片上（约15分钟）。在AFM扫描之前，立即用20mM HEPES缓冲液冲洗载玻片以除去松散结合的片段。我们假设中间的薄片保持完好（Zamil et al。，2014），所以唯一暴露的壁表面是细胞壁的内表面。这个假设对于其他组织来说可能不是这样。
（哥伦比亚）叶柄（4周龄，白天/夜间，16小时/ 8小时，温度，22℃/ 16℃），可以使用类似的研磨程序，（22℃下3天），黄瓜（Cucumis sativus ）下胚轴和玉米（ Zea mays ）胚芽鞘（暗生长的在27℃4天）。在光学显微镜下，表皮细胞壁通过其特征外观来识别（细长的矩形形状，图4）。
。表皮侧可以从获得的图像的平滑性和纤维状结构的缺乏中识别。

图4.用于AFM扫描的矩形表皮碎片的显微照片
注意可能由于温度波动或样品移动而导致钝角AFM尖端或漂移引起的伪影。在制造过程中或在扫描过程中，AFM针尖可能被污染或损坏，从而导致图像的锐利度较低或出现重影（图5）。漂移是一个常见的问题，应该在实验开始时通过禁用“慢轴扫描”（扫描参数选项）和反复扫描一行来检查。如果存在漂移，则成像特征将呈现倾斜而不是垂直笔直（图6）。在收集图像之前，漂浮可以通过在流体中稳定样品1或2小时来进行限制。如果问题仍然存在，请扫描其他单元格或其他样本。

图5.由于尖端钝化或断裂导致的AFM图像的常见伪影。：一种。洋葱表皮在正常条件下的代表性原子力显微镜图像; B.由于尖端断裂而导致AFM图像的倍增/重影特征; C.由一个钝的尖端引起的微纤维的人为扩大。

图6.禁用慢轴扫描以检查漂移。：一种。垂直笔直的特征表明没有或很少漂移。 B.倾斜的线条表示漂移。

食谱

清洗缓冲液
具有0.1％Tween-20，pH 7.0的20mM HEPES
成像缓冲区
20 mM HEPES（pH 7.0）或20 mM乙酸钠（pH 4.5）

致谢

该协议是从以前的工作改编的（Zhang等人，2014; Zhang等人，2016年）。我们感谢Ed Wagner和Liza Wilson提供技术援助和AFM维护以及Sarah Kiemle博士对手稿的评论。这项工作得到了由美国能源部科学基础能源科学局资助的能源前沿研究中心木质纤维素结构和形成中心（批准号：DE-SC0001090）的支持。作者宣称没有利益冲突。

参考

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