材料和试剂

播种机（640 x 230 x 185毫米）（Iris Oyama E型，PR650EMK）
蛭石（粒度3-6毫米）
土壤（含泥炭土的盆栽土）
玻璃纸（Asahi KASEI）
尼龙网（10μm，25μm，58μm和94μm）（Kyoshin Riko）
微型载玻片（Matsunami Glass，目录编号：S011260）
玻璃试管（10毫升）（IWAKI，目录号：TEST15-105NP）
凝胶加样尖（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，目录号：010-Q）
样品管（1.5 ml）（INA•OPTIKA，目录号：ST-0105F）
微量杯（100μl）（Beckman Coulter，目录号：523270）
注：本产品已停产。任何可以在分光光度计中固定的微量比色皿（100μl）都可以替代。
搅拌杯（100毫升）（Waring实验室，目录号：MC2）
玻璃吸管（10毫升）（Sansyo，目录号：73-0045）
玻璃离心管（50毫升）（Sansyo，目录号：84-0182）
橙色电影（柯达，Cinemoid 5A）
滤纸（3MM CHR CHROMATOGRAPHY PAPER，GE Healthcare，目录号：3030-928）
拟南芥生态型Col-0
拟南芥突变体 aha1-10
Bradford蛋白测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006JA）
抑肽酶（Merck，Calbiochem，目录号：616399）
蛋白酶抑制剂混合物组III（Merck，Calbiochem，目录号：539134）
MG132（Sigma-Aldrich，目录号：M8699-1MG）
三氯乙酸（TCA）（NACALAI TESQUE，目录号：06275-24）
抗兔IgG HRP（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706515）
抗-H + -ATP酶抗体（Kinoshita和Shimazaki，1999）或Agrisera抗H + -ATP酶抗体（Agrisera，目录号：AS07 260）
清晰的Western ECL底物（Bio-Rad Laboratories，目录号：1705061）
纤维素酶R-10（Yakult，制药工业，日本东京）
Macerozyme R-10（Yakult，制药工业，日本东京）
聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP-K30）（NACALAI TESQUE，目录号：28314-95）
牛血清白蛋白（BSA）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：30036727）
甘露醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：130-00855）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：031-00435）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（NACALAI TESQUE，目录号：02442-44）
纤维素酶RS（Yakult，制药工业，日本东京）
盐酸（HCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：081-03475）
氯化钾（KCl）（NACALAI TESQUE，目录号：28513-85）
Fusicoccin（Fc）（Sigma-Aldrich，目录号：F0537-1MG）
DMSO（和光纯药工业，目录编号：046-21981）
三（羟甲基）氨基甲烷（Wako Pure Chemical Industries，目录号：514-98121）
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
十二烷基硫酸钠（SDS）（NACALAI TESQUE，目录号：31606-75）
过氧二硫酸铵（和光纯药工业，目录编号：012-20503）
30％（w / v）丙烯酰胺/ Bis混合溶液（37.5:1）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：018-25625）
N'，N'-四甲基乙二胺（NACALAI TESQUE，目录号：33401-72），N，N'，N'-四甲基乙二胺
二硫苏糖醇（DTT）（NACALAI TESQUE，目录号：14112-94）
Nα - 甲苯磺酰-Lys氯甲基酮（Merck，Calbiochem，目录号：616382）
Ponceau S（NACALAI TESQUE，目录编号：28322-72）
乙酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-00251）
吐温20（MP Biomedicals，目录号：0210316890）
脱脂牛奶（雪牌奶制品有限公司）
甘氨酸（和光纯药工业，目录号：077-00735）
甲醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：137-01823）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：343-01861）
蔗糖（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-00015）
考马斯亮蓝G-250（NACALAI TESQUE，目录号：09409-42）
2-巯基乙醇（NACALAI TESQUE，目录号：21417-52）
1消化液（见食谱）
2消解液（见食谱）
2x H - - 抽取缓冲区（请参阅食谱）
用于H +泵送的反应混合物（见食谱）
Fc储备液（见食谱）
反应混合物的抑制剂处理（见食谱）
HCl储备液（见食谱）
10倍TBS（见食谱）
4倍分离缓冲液（见食谱）
4倍堆叠缓冲区（请参阅食谱）
过氧二硫酸铵储备液（见配方）
10％丙烯酰胺凝胶（见食谱）
DTT原液（见食谱）
TLCK储备液（见食谱）
Ponceau S（见食谱）
吐温20储备液（见食谱）
阻塞缓冲区（见食谱）
T-TBS（见食谱）
传输缓冲区（见食谱）
3倍SDS缓冲液（见食谱）
1x SDS样品缓冲液（见食谱）

设备

不锈钢制成的金属架（120 x 61 x 230厘米）（Iris Oyama，MR-230P）
搅拌器（Waring Lab，型号：51BL31，目录号：7011BU）*
漏斗（TGK，目录号：416-09-24-04）*
锥形瓶（500ml）（IWAKI，目录号：82-0088）
锥形瓶（300ml）（IWAKI，目录号：82-0087）
冷冻离心机（TOMY，型号：AX-310）*
冷冻离心机（TOMY，型号：MX-100）*
孵化器与振动筛（TAITEC，型号：个人Lt10）
单位恒温槽（TAITEC，THERMO MINDER型号：JR 80）*
分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU800）*
pH玻璃电极（Beckman Coulter，目录号：39532）*
pH计（Beckman Coulter，型号：Φ71pH计）*
图表记录仪（横河电机工厂，型号：3066）*
磁力搅拌器（RANK BROTHERS，型号：300型）
冷水浴循环器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：RTE7）
LED面板（CCS，型号：ISL 150X150 H4RRHB，按订单生产）
注意：红色和蓝色的LED固定在同一个面板上，每个LED都可以通过电源打开和关闭。
LED电源（CCS，型号：ISC-201-2）
显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse TS100）
移液器（P200）
电源（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac TM HC大电流电源）
转移细胞（Bio-Rad Laboratories，型号：Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell）
电泳容器（ATTO，型号：AE6200，目录号：2392385）*
化学发光分析仪（Bio-Rad Laboratories，型号：ChemiDoc TM Touch成像系统）
凝胶盒（ATTO，型号：AE-6210）

注：此产品已停产。

软件

图片J

程序

从拟南芥叶制备保卫细胞原生质体
1. 在土壤和蛭石混合物（1：1）中播种200个拟南芥种子/
  。
2. 在白光（60μmolm -2 s -1）下，用14 / 10h光照/植物生长拟南芥植株4-6周，在24°C的黑暗周期（见图1）。
  
  图1.在白光下生长的四周龄的拟南芥（Arabidopsis）植物在白光下（60μmolm ）生长4周> -2秒-1），在24℃下进行14/10小时光照/黑暗循环。酒吧代表1厘米。
3. 从200株植物中收获完全展开的莲座叶，取下主叶柄（〜2厘米长，见图2），然后抽紧。
  
  图2：从4周龄的拟南芥完全展开的叶子从拟南芥中收获完全展开的叶子，并且在抽薹之前除去主叶柄。酒吧代表1厘米。
4. 将叶子（25克）放入冰水中（见图3）。
  
  图3.在冰冷的水中的叶子将收获的叶子放入盛有冰水的玻璃烧杯中。
5. 将冰冷的叶子移入Waring搅拌器杯中（参见图4A）。在70ml冰冷的蒸馏水中，将覆盖有两层玻璃纸的搅拌器中的叶子全速均匀化（参见图4B）45秒。将得到的匀浆倒在放在漏斗上的尼龙网上（见图5）。在整个协议中丢弃滤液（流通）。
  
  图4.带有搅拌杯的挥舞着搅拌器。 B.充分展开的莲座叶放入装有冰水的搅拌杯中。搅拌杯用玻璃纸密封。
  最大速度均化叶片45秒。
6. 通过倒入冰冷的蒸馏水（参见视频1）将保留在58μm筛上的表皮组织（参见图5）转移到Waring搅拌器杯中，并使其在70ml水中全速再次均化1分钟，并通过如上所述通过58μm尼龙网过滤收集它们。
  尼龙网可以在用蒸馏水清洗后重新使用
  
  图5.用58μm尼龙网层收集的表皮组织在均化45秒后，用58μm尼龙网格层收集均质的表皮组织。将收集的组织再次放入搅拌器杯中并匀化1分钟（参见视频1）。用58μm尼龙网再次收集表皮组织，并重新悬浮在1消化液中。
7. 将12-13g湿的表皮碎片（参见图7）转移到500ml的锥形烧瓶中，通过使用洗瓶或10ml的注射器倒入1ml消化溶液（参见食谱）驹pipe吸管（见图6和视频1）。
  加入相同的溶液，将消解液的总体积调整到100毫升
  
  图6.带有硅橡胶灯泡的驹pipe吸管（10 ml）
  
  图7.通过1 st消化液除去叶肉细胞A. A.表皮碎片在1 st消化液处理前。叶肉细胞粘附于表皮组织。 B. 1消化液处理后的表皮碎片。所有的叶肉细胞都从表皮细胞分离。条纹代表10微米。
8. 将表皮碎片轻轻地通过同样的Komagome移液管上下几次，在100ml的锥形瓶中的1ml消化溶液中上下混合以彻底混合悬浮液并确保均匀消化（参见视频2）。
  
  视频2
9. 在24°C的锥形瓶中孵育悬浮液30分钟，以70次/分钟的速度摇动。
10. 通过Komagome移液管上下移动30次消化液中部分消化的表皮片段以除去附着的叶肉细胞（参见视频2）。
  使用显微镜（150x）检查微载玻片上附着于表皮碎片的叶肉细胞。
11. 重复步骤A9，直到所有附着于表皮的叶肉细胞都被除去（见图7）。
12. 将悬浮液通过58μm的尼龙网，并将表皮碎片保留在网片上。
13. 将表皮碎片倒入0.3M甘露醇和1mM CaCl 2溶液中，将溶液倒入网片上（参见视频1）。保持碎片在解决方案30分钟，以适应他们的高渗透压。
14. 通过渗透适应表皮穿过58微米尼龙网。用Komagome移液器（见视频1）将表面上的第二消化溶液（参见食谱）倒入300ml锥形瓶中，将保留在网上的表皮转移到300ml锥形瓶中。通过加入相同的2snd消解溶液将总体积调节至50ml。
  注意：由于表皮的部分消化和脆弱，在这一步不要触摸表皮。
15. 在第二次消化溶液中用50分钟min -1 -1的表皮在27℃孵育表皮50-60分钟。
16. 使用几个表皮碎片，检查大多数保卫细胞在显微镜下是否变成球形（见图8）。
  
  图8.通过第二次消化溶液进行的保卫细胞球化。将表皮片段与第二次消化溶液一起温育。在显微镜下观察保卫细胞的球形性质（黑色箭头）。该条代表10微米。
17. 将含有消化表皮的锥形瓶放在冰上，用Komagome移液管轻轻上下60次，使保护细胞原生质体从表皮脱落（见视频2）。
18. 将悬浮液通过94和25μm的两层堆叠的尼龙网（94μm网目位于25μm的网的顶部）以将保卫细胞原生质体与表皮残余物分开。
19. 将分离的保卫细胞原生质体通过两层10μm尼龙网以除去其他小组织的污染。
20. 在4℃下将保卫细胞原生质体的悬浮液在420gxg离心18分钟以收集保卫细胞原生质体作为沉淀。丢弃上清液。
21. 在50ml 0.4M甘露醇和1mM CaCl 2溶液中重悬沉淀。
22. 重复步骤A19和A20两次（总共三次）以除去残留的酶。
23. 在10ml试管中，将保卫细胞原生质体的沉淀重悬于200-500μl0.4M甘露醇和1mM CaCl 2中，并保持在冰上。
  注意：需要6-8小时从25克叶片制备保卫细胞原生质体。原生质体可以在黑暗中在冰箱中储存过夜，直到测量。保持原生质体在冰上至少1小时的黑暗中立即测量。一次测量所需的时间为2-3小时，因为需要1-2小时直到在红光（RL）下原生质体悬浮液的pH显示恒定的值。拟南芥的测量时间比蚕豆（Vicima faba）长（Shimazaki等，1986）。
24. 用Bradford法（Bradford，1976）用10μl原生质体悬浮液测定蛋白质浓度。
  
  图9. 0.4M甘露醇和1mM CaCl 2保卫细胞原生质体从拟南芥中分离的保卫细胞原生质体。将保卫细胞原生质体重悬于200-500μl0.4M甘露醇和1mM CaCl 2中。保卫细胞原生质体的典型产量为每5,000个叶片4.3×10 7个细胞，纯度为98％。该条代表10微米。
测量蓝光和依赖fococcin的H + +抽血
1. 蓝光取决于H - - 抽水
  1. 保持细胞原生质体在黑暗中4°C 2小时或过夜。
  2. 在24℃的有机玻璃水套中循环水以保持温度。将Xml的保卫细胞原生质体悬浮液（50μg蛋白质）与0.5-Xml的0.4M甘露醇和1mM CaCl 2在密封在水套中的开放式玻璃容器（见图10A）中混合。向该悬浮液中加入0.5ml 2×H 2 +抽吸缓冲液（见配方），使容器中的最终体积为1ml反应混合物。通过容器内的小型磁力搅拌器搅拌反应混合物中的原生质体。
    注意：在没有蓝光的情况下添加原生质体。
    用橙色薄膜覆盖荧光灯，从而消除蓝光部分。
    
    图10.被水套环绕的敞开的玻璃容器水通过尼龙（或硅树脂）管在水套周围循环。 A.空的玻璃容器; B.容器中pH玻璃电极和保卫细胞原生质体。
  3. 将pH玻璃电极放入反应混合物中，并通过pH计将记录来自电极的信号记录在记录仪上（见图10B）。
  4. 使用LED照明器（参见图11），通过打开红色开关，将红色光（600μmolm -2 s -1 sup ）施加到原生质体2小时光电二极管直到pH显示几乎恒定的值（见图13）。照明器到样品的距离约为10厘米。
    通过电压控制器调节样品的光强度
    
    图11. LED照明器。红色和蓝色LED固定在平板上。当LED关闭时，所有的LED灯泡被视为242-243个深褐色斑点（A.熄灭）。当红色LED亮起时，可以看到红色的光（B.红灯）。当红色和蓝色LED都打开时，可以看到粉红色的光（C.红色和蓝色光）。
  5. 使用LED照明器（见图11），将蓝光脉冲（100μmolm -2 sup-1 -1）施加到原生质体30秒，通过打开蓝色光电二极管叠加在红光。在红光下孵育原生质体约20分钟以跟踪混合物中的pH变化（图13）。
  6. 向混合物中加入3或5μl的1mM HCl，以计算响应于蓝光的H +泵浦的幅度。
2. Fusicoccin（Fc） - 依赖性H + +抽取
  1. 从B1a-B1f开始，按照上述相同的步骤。使用上面使用的相同样品。
  2. 添加2.5μL的4mM的Fc在DMSO中的悬浮液（10μM）通过凝胶加载尖端，而不是通常的提示，并诱导H + +泵。计算泵送恒定后（加入Fc后5分钟）的速率。
测定总H + -ATPase量

在1.5ml取样管中，将10μg保卫细胞原生质体的蛋白质悬浮在反应混合物中（150μl，见食谱）。根据测量步骤A22-A23确定了保卫细胞蛋白质的浓度。
通过上下移液轻轻混合原生质体悬浮液。
将蛋白酶或蛋白酶体的抑制剂加入到悬浮液中，每15分钟上下吸取轻轻混合。
如下所示的抑制剂分别施用于原生质体：
1. 10μM抑肽酶（丝氨酸蛋白酶抑制剂）和2 mM DTT。
2. 1mM Nα-Tosyl-Lys氯甲基酮（TLCK;丝氨酸蛋白酶抑制剂）。
3. 1％（v / v）蛋白酶抑制剂混合物组III（含有各种蛋白酶抑制剂）。
4. 50μMMG132（蛋白酶体抑制剂）。
将含有抑制剂或无抑制剂的原生质体悬浮液作为对照，在24℃下每15分钟上下移液30分钟。
向悬浮液中加入10％三氯乙酸（TCA）以停止反应，并通过PIPETMAN（P200）轻轻地上下吸取悬浮液10次以使蛋白质变性。
悬浮在冰上10分钟，以避免过度变性。
在4℃下将悬浮液在17,800×gg离心10分钟以收集蛋白质。
取出上清液并用200μl50mM Tris-HCl（pH8.0）悬浮沉淀。重复步骤C7-C8两次，以删除TCA。
在脉搏后2.5分钟左右的H +泵抽速最陡的斜率处绘制一条近似直线，计算出H +泵的最大速率（见红色线）。
根据这条线确定图表上的pH值下降。在3分钟内显示出4.0cm的pH下降（参见C）。
根据所使用的保卫细胞蛋白质计算H +泵的最大速率。由于每脉冲的pH降低为1.33cm / min（4.0 / 3），而1nmol H +对应于1.07cm的pH降低，所以最大速率计算为是1.33cm / 1.07cm×60nmol h -1 /50μg蛋白质是1.49nmol H + -h -1蛋白质+ -1 。

图13.响应于蓝光（BL）的保卫细胞原生质体的H + +抽吸的时间进程照射包含50μg蛋白质的反应混合物中的保卫细胞原生质体与RL（600μmolm -2 s ^{-1 ）。纵轴和横轴分别表示pH和时间。在脉冲之后，泵送开始30秒的pH降低，并在脉冲之后2-3分钟达到最大速率。在记录仪上以20cm h -1（= 1cm 3 min -1）的速度记录泵送。 A：通过加入3nmol H + +降低pH值的大小。 B：响应于BL的脉冲的H +泵的量值。 C：响应于BL，3分钟内H +泵的强度。}

笔记

根据保卫细胞原生质体的生存能力，H +抽提活性不同。获得有活力的保卫细胞原生质体的重要标准是酶质量（纤维素酶RS和R-10）。经常引起原生质体回收减少的活性和毒性随酶批号而变化。我们通常通过制备原生质体和H +抽吸测量来检查酶活性。如果这批产生可行的原生质体，我们购买大量。

食谱

注意：第一次和第二次消化的酶溶液应该新鲜制备。

1 消解溶液
0.5％（w / v）纤维素酶R-10
0.05％（w / v）macerozyme R-10
0.1％（w / v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K30）
0.2％（w / v）BSA
0.25 M甘露醇
1mM CaCl 2•2H 2 O 0 10 mM MES-KOH（pH 5.4）
2 消解溶液
1.5％（w / v）纤维素酶RS
0.5％（w / v）macerozyme R-10
0.2％（w / v）BSA
0.4 M甘露醇
1mM CaCl 2•2H 2 O 0 10 mM MES-KOH（pH 5.4）
用2N HCl将pH调节至5.4
2x H - - 抽取缓冲区
0.25mM MES-KOH（pH 6.0）
20 mM KCl
0.4 M甘露醇
1mM CaCl 2•2H 2 O 0 在4°C储存
反应混合物用于H +泵 - 泵 500μl2x H <+> - 泵缓冲液
Xμl保卫细胞原生质体（50-100微克蛋白质）
500-Xμl0.4M甘露醇和1mM CaCl 2
Fc储备液
4mM Fc在DMSO中
在-20°C储存
用于抑制剂处理的反应混合物
75μl2x H - 抽吸缓冲液
Xμl保卫细胞原生质体（10微克蛋白质）
75-μμl0.4M甘露醇和1mM CaCl 2
HCl储备液
1 mM HCl
在室温下储存
10倍TBS
200mM Tris-HCl（pH 7.4）
1400 mM NaCl
在室温下储存
4倍分离缓冲液
1.5M Tris-HCl（pH8.8）
4％（w / v）SDS
在室温下储存
4倍堆栈缓冲区
1.0M Tris-HCl（pH6.8）
4％（w / v）SDS
在室温下储存
过氧二硫酸铵储备液
过氧二硫酸铵在蒸馏水中10％（w / v）
在4°C储存
10％丙烯酰胺凝胶
1. 分离凝胶
  6.7 ml丙烯酰胺/ Bis混合溶液（30％[w / v]，Wako Pure Chemical Industries） 5.0毫升4X分离缓冲液
  200μl1％（v / v）过氧二硫酸铵储备液
  20μl0.1％（v / v）N，N，N'，N'-四甲基乙二胺
  加入蒸馏水到溶液直到20毫升
  按要求准备
2. 堆叠凝胶
  1.67ml丙烯酰胺/ Bis混合溶液（30％[w / v]，Wako Pure Chemical Industries） 2.5毫升4×堆栈缓冲液
  100μl过氧二硫酸铵储备液
  10微升N，N，N'，N' - 四甲基乙二胺
  加入蒸馏水到溶液中，直到10毫升
  按要求准备
DTT库存解决方案
1 M DTT在蒸馏水中
在-20°C储存
TLCK库存解决方案
在DMSO中的100mM TLCK
在-20°C储存
Ponceau S
0.5％（w / v）Ponceau S
1％（v / v）乙酸
在室温下储存
吐温20储备液

25％（v / v）Tween 20在1x TBS缓冲液中在4°C储存
阻塞缓冲区
T-TBS中5％（w / v）脱脂牛奶
按要求准备
T-TBS
1％TBS中的0.5％（v / v）吐温20 在室温下储存
传输缓冲区
39 mM甘氨酸
48 mM Tris
20％（v / v）甲醇
在室温下储存
3倍SDS缓冲液
30 mM Tris-HCl（pH 8.0）
3 mM EDTA
3％（w / v）SDS
30％（w / v）蔗糖
在-20°C储存
1x SDS样品缓冲液
10 mM Tris-HCl（pH 8.0）
1 mM EDTA
10％（w / v）蔗糖
1％（w / v）SDS
0.04％（v / v）2-巯基乙醇
0.003％（w / v）考马斯亮蓝G-250
按要求准备

致谢

该协议是从Shimazaki et al 改编的。（1986），上野等人。（2005）和Yamauchi等人。（2016）。这项工作得到了JSPS KAKENHI资助号码26251032（K.S.）的支持。没有利益冲突。

参考

Assmann，S.M.，Simoncini，L。和Schroeder，J.I。（1985）。蓝光激活Vicia faba保卫细胞原生质体中的电生成离子泵。 />自然 318：285-287。
Bradford，M.M。（1976）。利用蛋白质 - 染料结合的原理，快速而灵敏地定量蛋白质的微克数量。 Anal Biochem 72：248-254。
Kinoshita，T。和Shimazaki，K。（1999）。蓝光通过磷酸化激活质膜H + -ATPase在气孔保卫细胞中的C端。 EMBO J 18（20）：5548-5558。
Shimazaki，K.，Iino，M.和Zeiger，E。（1986）。保卫细胞原生质体蓝光依赖质子挤压蚕豆（Vicia faba）。 Nature 319,324-326。
上野，K.，Kinoshita，T.，井上，S.，Emi，T.和Shimazaki，K.（2005）。质膜H +的生化表征 - ATPase在拟南芥保卫细胞原生质体中对蓝光的响应。植物细胞生理学（Plant Cell Physiol）46（6）：955-963。
Yamauchi，S.，Takemiya，A.，Sakamoto，T.，Kurata，T.，Tsutsumi，T.，Kinoshita，T。和Shimazaki，K。（2016）。质膜H + -ATPase AHA1在气孔中起主要作用开放以响应蓝光。植物生理学 171（4）：2731-2743。