材料和试剂

圆底35mm共焦盘（MATTEK，目录号：P35G-0-14-C）
24孔板（Corning，Costar ®，产品目录号：3524）
无菌管（0.6,1.5和/或2.0毫升）（Fisherbrand）
无菌吸头（白色，黄色和蓝色的提示）
细胞系（即。，HeLa）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SH30028.02）
纯DMEM培养基（无血清和抗生素）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：10567014）
用于细胞培养的合适培养基（即，HeLa细胞，DMEM，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：10567014）
Alexa Fluor 488 NHS酯（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A20000）
ArgNP金纳米颗粒的储备溶液（约50μM在水中，实验室合成）
电子标记的蛋白质（实验室纯化）

设备

移液器（P2，P10，P20，P200，P1000）
BSL-2细胞培养安全柜
在5％CO 2和37℃下的细胞培养孵育器
共聚焦显微镜（任何品牌）
流式细胞仪（即em，即BD，型号：LSR II）

程序

有两个关键的步骤成功的高效胞质蛋白递送。首先，E-tag的长度决定了传递效率。对于每种蛋白质，长度可能不同。因此，建议用户用至少几个不同的E标签（具有不同的E标签长度，例如E5，E10，E15和E20）制造他们感兴趣的蛋白质。对于大多数平均分子量的蛋白质（MW <50kDa），E10标签提供高效递送，然而，对于大蛋白质如Cas9（MW = 160kDa），E20标签产生最佳递送。其次，ArgNPs与E标记蛋白质的摩尔比决定了递送效率。再次，对于每种蛋白质，这个比率可能不同。因此，也建议使用者测试几种不同的他们感兴趣的ArgNP / E标记蛋白质的摩尔比以找出最佳递送。根据我们的经验，对于大多数电子标记的蛋白质，以下摩尔比之一给出最高的递送效率：[ArgNP] / [E标记的蛋白质] = 1：0.5; 1：1; 1：2; 1：3。不过，建议用户测试任何其他比例，因为他们认为是适当的。
在下面的协议（图1）中，我们使用GFP-E10来演示组件的形成和交付过程。然而，如上所述，要求用户使用与GFP-E10所述相同的程序来鉴定其感兴趣的蛋白质的最佳E-标签长度和“工作摩尔比”。此外，如果蛋白质是非荧光蛋白，则应用荧光标记的电子标记的蛋白质以通过共焦显微成像评估递送效率。 [对于Alexa Fluor 488 NHS酯，标签协议可以在制造商的网站上找到。]
最终工作纳米组装浓度是250nM的ArgNP和750nM的GFP-E10，其与ArgNPs / GFP-E10的摩尔比为1：3。交付所需的纳米组装样品的总体积取决于所使用的细胞培养板的种类。我们通常使用1毫升圆底35毫米共聚焦盘，每孔500微升的24孔板。因此，应该根据用户需要准备和扩大纳米装配。以下计算是针对24孔板中的一个样品（即，总体积为500μl）。此外，以下协议仅适用于HeLa细胞。尽管如此，我们已经使用了各种细胞系来展示我们的交付平台。我们成功测试的一些细胞系是：人胚胎肾细胞（HEK），乳腺上皮细胞（MCF-7），小鼠巨噬细胞（RAW 264.7），人卵巢癌细胞（SKOV-3）和T淋巴细胞（Jurkat ）。

步骤1：形成ArgNPs / E标记的蛋白质纳米组装体（需要10分钟），和步骤2：电子标记的蛋白质递送（需要3小时）。图1：方案的示意性概述。

第1天
在24孔板上的种子细胞，细胞密度为0.8-1×10 5个细胞/孔（对于共聚焦培养皿，种子每个培养皿2.4×10 5个细胞）。让细胞在5％CO 2和37℃的细胞培养箱中生长24小时。

第2天

步骤1：ArgNPs / E标记蛋白质纳米装配制备
1. 这个步骤（步骤1）应该在交付实验（步骤2）之前10分钟进行。
2. 添加100微升的1x PBS到无菌1.5毫升管。
3. 添加2.5μL的ArgNPs（50μM库存）。
  注意：ArgNPs的最终工作浓度是250 nM，总的工作样品体积是500μl。如果ArgNPs的库存浓度不同，请调整要添加的纳米粒子的量（体积）。另外，根据装配样品的总工作量进行放大或缩小。
4. 然后添加7.5μLGFP-E10（50μM储备）到ArgNPs溶液中并充分混合。此处，[ArgNPs] / [GFP-E10]摩尔比= 1：3（250：750nM）时，GFP-E10的最终工作浓度为750nM。再次，根据原液浓度和所需的摩尔比调整感兴趣的GFP-E10或E标签蛋白的体积。
  注意：在这一步，用户可以选择不同的E标签长度和几个[ArgNPs] / [E标签蛋白]摩尔比的感兴趣的蛋白质，以找出最大的胞质输送。 />
5. 在室温下孵育复合物10分钟
6. 纳米装配已准备好进行下一步，即交付。
第2步：交付
1. 当纳米组装被孵化10分钟，用户应准备细胞交付在此期间。
  注意：不要孵育超过10分钟，因为这可能会导致聚集体形成，而不是定义明确的组装。
2. 用1x PBS清洗细胞两次。
3. 加入〜400μL的DMEM普通培养基（或任何感兴趣的媒体）到管中的纳米组装溶液中。轻轻地上下吹打混匀。
  注意：这一步应严格避免血清培养基;血清培养基可能需要进一步优化，如E标签的长度，纳米颗粒与E标记蛋白质的比例以及孵育时间。
4. 将全部（500μl）样品加入洗涤的细胞中。
5. 孵育细胞在适当的条件下（通常5％CO 2和37℃）3小时。温育3小时后应完成蛋白质递送。
6. 3小时后将培养基冲洗干净，更换为新鲜的所需培养基（含10％血清和1％抗生素的DMEM，以及任何补充剂，如果需要的话）。

数据分析

进行两类数据评估以评估有效的胞质蛋白递送。首先，蛋白质在细胞质中的彻底分布（使用共聚焦显微镜成像）将指示有效递送，而点状分布将意味着蛋白质的内体截留（图2A和2B）。其次，转导细胞的百分比可以通过使用共聚焦显微镜成像或流式细胞仪分析来评估（图2C）（关于共聚焦显微术和流式细胞术的详细程序，请参见Mout等人，2017年）。请注意，感兴趣的蛋白质必须荧光标记，或融合荧光蛋白用于上述成像和质量评估目的。
以下是一些有代表性的结果，显示GFP-E10有效的胞质输送。为了比较我们的策略与遭受递送蛋白的内体截留的其他方法的有效性，我们还提供了显示（+36）-GFP递送的图像，其主要被捕获在内体中（Cronican等人，2010）。同样地，使用流式细胞术分析比较GFP-E0，GFP-E5和GFP-E10之间的GFP递送百分比。结果显示GFP-E10的最高输送效率。请参阅Mout et al 。，2017了解更多详情。

图2.显示有效蛋白质递送与无效递送的代表性数据共聚焦显微镜图像显示GFP-E10的有效胞质递送（A）的实例，与HeLa中（+36）-GFP的内体内递送细胞（B）。注意，使用上述方案以[ArgNPs] / [GFP-E10] = 1：3（250：750nM）的摩尔比递送GFP-E10。为了比较，我们按照报道的方法（Cronican等人，2010）递送（+36）GFP。 C.流式细胞仪测定具有不同标签长度的E标签GFP的递送效率。如图所示，GFP-E10显示出最高的传送效率。

笔记

每一批ArgNPs在表面配体覆盖率方面可能略有不同，因此建议用户测试不同摩尔比的ArgNPs / E标签蛋白，以找出最佳递送比例。

致谢

这项研究得到了NIH（GM077173）和NSF（CHE-1307021）的支持。该协议是从Mout et al。，2017年改编的。
作者声明以下竞争性财务利益：V.M.R和R.M.向USPTO（申请号PCT / US2016 / 015711）提交了非临时专利。

参考

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