材料和试剂

单刃剃须刀刀片（，VWR，目录号：55411-050）
双刃剃刀刀片（例如，安全剃刀公司，目录号：74-0002）
一次性培养皿（如，Corning，Falcon ，产品目录号：351007）
双面半英寸“Scotch”胶带
美纹纸或类似物（例如，，VWR，目录号：89097-920）
25×75mm，1.0mm厚的显微镜载玻片（例如，VWR，目录号：48300-025）
22×22-1.5显微镜覆盖玻璃（例如，Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：12-541-B）
白洋葱（洋葱cepa L.）灯泡;我们使用Cometa品种
蒸馏去离子水（ddH2O）
醋酸钠三水合物（例如，VWR，目录号：BDH9278-500G）
HEPES（，VWR，目录号：97061-826）
盐酸（例如，Merck，目录号：HX0603-75）
醋酸（如emck，Merck，目录号：AX0073-6）
HEPES缓冲液（20 mM，pH 4.5）（见食谱）
醋酸钠缓冲液（20毫米，pH值6.8）（见食谱）

设备

微波炉，电热板或本生燃烧器
pH计（例如，Corning，型号：Model 430）
分析天平（例如，梅特勒 - 托利多，型号：XPE105）
细钳（，Dumont 5号）
扁尖钳（，例如，Rose Scientific，目录号：FF-001）
自定义3毫米切片夹具（见注释部分）
微型计算机
数据采集硬件（例如，数据翻译，型号：DT9801）
恒力引伸计（图1）（Durachko和Cosgrove，2009; Cosgrove，2011; Cosgrove等，2017）
应力/应变分析仪（图2）（Cosgrove，2011; Cosgrove et al。，2017）

图1.恒力引伸计垂直可调的敞开式夹紧室固定壁样品的底部，并能够容纳大约150微升容量的液体。第二个夹具被应用到壁样品的上部并连接到平衡杆。使用线性可变位移传感器（LVDT）（例如Schaevitz 050HR）监测杠杆和连杆的位移。重量被应用到杠杆来调节样品上的张力。自定义软件显示并记录位移和计算的延伸率。我们通过数据采集模块（Data Translation DT9801）将一组八个这些单元并联连接到一台微型计算机上。

图2.用于应力/应变测定的装置A.垂直平台由PC串行端口步进驱动器（例如，AutomationDirect STP-DRV-4850 ），步进电机（例如Lin Engineering 4218L-01D-02），齿轮传动带和导螺杆组件。使用LVDT监视舞台位置。用s型称重传感器（例如Futek LSB200 100克）监测张力。定制软件控制应变率和张力。两个夹子夹住正在测量的样品。上夹具固定在可移动台上。下夹具固定在称重传感器上。 B.粘贴在夹子之间的果皮的特写（剥去蓝色以帮助可视化该图像）。 C.备用视图的设备注意特定的部分。

软件

使用Microsoft Visual Basic编写的自定义软件用于获取数据和一些数据分析。 Microsoft Visual Basic可以在 http://www.microsoft.com 上免费下载。另外，许多商业软件包可以免费和购买，以便进行数据采集和分析

程序

洋葱皮的准备
这里我们描述从洋葱上制备细胞壁条的方案。这是从洋葱鳞片的外表面（从鳞片的外表面或凸面）获得的。下表皮紧紧地粘附在下面的细胞上，因此当一个脱落时，外（表皮）表皮壁与细胞的其余部分分离，导致仅由外壁组成的条带。这与近轴表皮（从洋葱鳞片的内表面或凹表面）的剥离行为形成对比，所述表皮仅与基础细胞弱附着，因此分离为具有活细胞和完整细胞的全细胞层，例如Hepworth和Bruce，2004; Vanstreels et al。，2005; Suslov 等。，2009; Beauzamy 等。，2015.
1. 购买新鲜的白洋葱，大概是棒球的大小（直径在6到10厘米之间）。
2. 删除并丢弃最外层的干燥棕色层（图3A）。
3. 其余的将很容易分成称为尺度的层。我们指的是从最外层（最老的）到最内层的这些尺度（从外到内，1,2，...，n）（图3B）。
4. 使用一个单一的边缘刀片垂直切洋葱，以获得最大尺寸大约3至4厘米的锥形部分（图3B）。
5. 去掉秤1到4，在洋葱上留下刻度5，从中获得我们的果皮。也可以从其他尺度制作果皮。
6. 使用3毫米的切片夹具沿洋葱垂直轴在刻度＃5的外部（远轴）表面上制作浅的（〜0.5毫米深，3毫米宽）切口。这些削减应该是大约3厘米长，并在洋葱垂直轴的中间（图3C）。
7. 使用一个单刃剃刀刀片，使三个相似的切口垂直于现有的。这三个切口应该大致相距1厘米，并以洋葱垂直轴为中心。这允许每组切口四个皮（图3D，线表示切口，每个矩形一个皮）。
  
  图3.准备一个洋葱获得剥离带A.去除干燥的层; B.消费量表＃5; C.做垂直切口; D.做横向切口。
8. 使用平头镊子，在深度约0.5mm的四个切开的矩形的一端下面轻轻地进入皮下组织。捏住这个组织，用它轻轻剥离表皮层，沿着四个切开的矩形之一的长轴的大约一半。然后，从矩形的另一端开始工作，将剩下的部分剥去，得到一个完整的表皮组织矩形，两侧粘附着皮下组织块。在培养皿中的HEPES缓冲液上漂浮（图4）。
  
  图4.从洋葱（A）剥离条带，并将其漂浮在HEPES缓冲液（20mM，pH 6.8）（B）上
9. 〜1厘米长，3毫米宽的条纹现在可以用于生物力学分析。对于本文中描述的测定，我们将两端夹在两个装置中的一个中，夹具之间的初始长度为3或5mm。
恒力引伸计（蠕变）分析
这是测量细胞壁蠕变的过程，例如由催化剂介导的细胞壁松动（Cosgrove，2016a）。
1. 确保引伸计的所有单位都干净，准备好进行新的实验。
2. 我们通常使用15到17克的张力（0.15-0.17 N），用于5号刻度的3毫米宽的洋葱表皮。年轻和年龄较大的标尺带有不同的属性，因此您可能需要通过反复试验来调整引伸计张紧系统（足够的张力以获得良好的蠕变速率，而不是墙壁破损成为问题）。
3. 准备适当数量的果皮，然后按照您对特定实验的要求装入尽可能多的单位。我们发现8到16次重复通常足以解释样本的变化。
4. 热灭活
  注意：步骤B4a-B4g仅在想要使内源性壁酶失活时才使用，并且在引伸计上装载剥离之前发生它们。
  1. 放置在显微镜幻灯片之间的果皮，并用橡皮筋固定（图5）。
    
    图5.用橡皮筋固定的幻灯片之间的三个剥离
  2. 将切片中的果皮放入装有100毫升蒸馏水的热保险容器中，使其可以平放并完全浸没。
  3. 放入微波炉的最高位置，启动烤箱。
  4. 仔细观察，一旦滚动沸腾建立允许样品加热12秒。
  5. 立即取出，并将带有剥离片的载玻片放入另一个含有室温水的容器中淬火。
  6. 可以使用本生灯或电热板，但是可以按照以下步骤改变步骤：让水沸腾，然后将滑板中的果皮浸入已经沸腾的水中。
    12秒钟后，如同微波协议
  7. 一旦显微镜载玻片凉快，根据实验要求的规定将果皮放入缓冲液。
5. 从培养皿中取出一片果皮，放在盖玻片上，作为果皮的载体（图6A）。
6. 将果皮放在盖玻璃的顶部中央（图6B）。
7. 打开上方的夹子
8. 将果皮的一端插入引伸计的上夹钳并夹紧（图6C）
9. 将盖玻片向下滑动，使其远离果皮的上端，以便将其挂在下夹具内。定位样品，以夹紧夹子之间5mm长度的组织（图6D）。
10. 将下夹钳夹在皮上。
11. 按照实验要求（图6E）的规定，将缓冲液添加到新悬挂的样品中。
  
  图6.单轴延伸（蠕变）测定的程序A.转移溶液中的剥离物以覆盖玻璃; B.在玻璃盖顶部中心位置剥离; C.将剥离物插入上夹钳并取下盖玻片; D.将果皮插入下夹具; E.添加缓冲去皮。
12. 调整下夹具组件，以便将位移传感器“归零”到其范围的下部。
13. 继续使用剩余的空单元。
14. 开始获取长度数据。
15. 在记录稳定的基线速率之后，覆盖样品的溶液根据实验需要进行交换，例如不同的pH或添加酶如膨胀蛋白（Cosgrove，2015和2016a）或内切葡聚糖酶（Park和Cosgrove ，2012）（图7）。
  
  图7.由酸性缓冲液诱导的天然洋葱表皮细胞壁的单轴细胞蠕变延伸在10g张力下夹住的天然条带（即未被热灭活）表现出酸诱导的蠕变，中性缓冲液（20mM HEPES，pH6.8）在箭头所示的位置交换20mM乙酸钠，pH4.5。
应力/应变分析
在这里，我们描述了基于应力/应变曲线量化细胞壁力学性质的方案（Cosgrove等人，2017）。墙被拉伸直到达到规定的力，然后恢复到原来的长度，第二次拉伸到相同的力量。第二次拉伸是可逆的，因此提供了一种测量壁弹性的方法。第一次拉伸部分是不可逆的（塑料），所以可以结合第二次拉伸计算可塑性。

调整引伸计软件的应变速率为每分钟3毫米，直到达到98毫牛的张力。这种张力可能需要更小或更大，这取决于细胞壁条的处理和历史。它应该设置得足够低，以避免撕裂墙壁条或在夹具中滑动，但是足够大以产生塑性延伸。
我们配置我们的设备使用夹子之间3或5毫米的起始距离。这个长度的样本是方便的，并提供足够的材料，从中我们可以获得这些程序所需的可测量的生物力学响应的量级。
根据您的特定实验需要准备适量的果皮。我们通常发现12到15次重复是足以解释样本变异的。
步骤C4a-C4g仅在想要灭活内源性壁酶时使用。
1. 将显微镜载玻片之间的皮肤和橡皮筋固定。
2. 将切片中的果皮放入装有100毫升蒸馏水的耐热容器中，使其可以平放并完全浸没。
3. 放入微波炉的最高位置，启动烤箱。
4. 仔细观察，一旦滚动沸腾建立允许样品加热12秒。
5. 立即取出，并将带有剥离片的载玻片放入另一个含有室温水的容器中淬火。
6. 可以使用本生灯或电热板，但是可以按照以下步骤改变步骤：让水沸腾，然后将滑板中的果皮浸入已经沸腾的水中。
  12秒钟后，如同微波协议
7. 一旦显微镜载玻片凉快，根据实验要求，将皮放回缓冲液。
从培养皿中取出一片果皮，放在盖玻片上，作为果皮的载体（图6A）。
将果皮放在盖玻璃的顶部中央（图6B）。
打开上方的夹子
下面的步骤14至16参考图6的面板C和D.设备夹是相似的。
将果皮的一端插入设备的上部夹子并夹紧
。将玻璃盖从玻璃杯的上端向下滑动，以便将其挂在下夹具上。
将下夹钳夹在皮上。
调整设备从样品中取出任何松弛。
连续拉伸样品两次，直到每次达到98 mN的应力（参见图8和视频1-3，了解拉伸的例子）。

图8.典型的应力 - 应变（力 - 拉伸）测量将洋葱表皮细胞壁条带以两个周期拉伸至98mN载荷两次，应变速率为3mm min- 1 。

这里有三个电影说明了洋葱表皮壁带的压力/应变测定的两个连续的延伸周期。

视频1

视频2

视频3

数据分析

引伸计数据收集如下：对于每个位移传感器，每30秒捕获一个位置样本。然后将这30个样本平均并作为单个平均位置数据点保存到数据文件中。每个扩展速率数据点都是从3个连续的位置点计算出来的，并保存到同一个数据文件中。
对于应力/应变分析，每个应力/应变线的斜率通过拟合最后10％的数据来计算，直到使用线性最小二乘拟合达到目标应力。线的斜率（伸长％对力）被称为顺应性（刚度或模量的倒数）。
第二次拉伸的斜率表示弹性顺应性（拉伸力的％伸长/变化）。第一次拉伸的斜率表示总（弹性+塑性）顺应性。

塑性顺应性可以通过从总顺应性减去弹性顺应性来获得

笔记

果皮的孵化时间应该总是最小化，以减弱可能由内生生物活动引起的变化，除非这是实验的目的。
在使用之前，我们也会将样品保存在冰上
制作定制的3毫米切片夹具（图9）：该夹具制作3毫米宽的果皮。您将需要三个双刃刀片，双面“Scotch”胶带，遮蔽胶带（或类似物）和8个标准显微镜载玻片（25 x 75 mm，1.0 mm厚）。在一个干净，平坦的表面上放置幻灯片和剃刀刀片。将两块双面胶带并排放在每个滑板的上表面上，几乎完全覆盖滑板表面。将一个刀片放置在滑块末端附近，使切削刃平行于滑块，并从滑块边缘突出5 mm。在第一个刀片上放置三张幻灯片。跟着另一个刀片，3个更多的幻灯片，最后的刀片，然后是最后一张幻灯片。小心以正交方式组装零件。您可能希望用另外的胶带包裹夹具的两端。

图9.自定义3毫米切片夹具
进行应力/应变分析时，应该保持一定的速度，以免组织样本脱水。
少量缓冲液可以使用棉签或吸管，如果需要夹紧组织，然后收集数据。

食谱

HEPES缓冲液（20 mM，pH 4.5）
将4.77g（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸）溶于0.95L ddH 2 O中，用1N HCl调pH至6.8，加入ddH 2 / sub> O来做1 L的最终音量
醋酸钠缓冲液（20 mM，pH 6.8）
将1.64g三水合乙酸钠溶于0.95μLddH 2 O中，用1M乙酸调节至pH 4.5，加入ddH 2 O使终体积为1 L

致谢

我们感谢Ed Wagner，Sarah Kiemle博士和Xuan Wang的技术支持。这项工作得到了由美国能源部科学基础能源科学局资助的能源前沿研究中心木质纤维素结构和形成中心（批准号：DE-SC0001090）的支持。这个协议是从Zhang et al 改编的。（2017年）。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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Cosgrove，D.J。（2011）。测量生长的植物细胞壁的体外延伸性方法Mol Biol 715：291-303。
Cosgrove，D.J。（2015）。植物扩张蛋白：与植物细胞壁的多样性和相互作用 Curr Opin Plant生物学25：162-172。
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Cosgrove，D. J.（2016b）。植物细胞壁延伸性：连接植物细胞生长与细胞壁结构，力学和墙的作用 - 修饰酶。 J Exp Bot 67（2）：463-476。
Cosgrove，D.J.，Hepler，N.K。，Wagner，E.R。和Durachko，D.M。（2017）。测量细菌扩展蛋白在纸张和植物细胞壁上的生物力学松动作用 Methods Mol Biol 1588：157-165。
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