材料和试剂

75％酒精棉球（Bettering，目录号：BY ACB）
22毫米（3/8圈）带缝线的手术针（Foosin Medical Supplies，Weigao，型号：300系列）（图1B）
1 ml麻醉注射器（西安圣坦医疗投资管理公司，产品目录编号：STS-SY003-＃0037）（图1H）
3-0丝线（金环，型号：3-0）（图1A）
医用脱脂棉（竹石药业集团，型号：ZS-HM019）
动物
哈尔滨医科大学附属第二医院动物中心，哈尔滨黑龙江省，雄性Sprague-Dawley大鼠（体重280-300g，通常为4-5个月龄）分别饲养于23±1℃， 55±5％的湿度，并保持12小时黑暗/光线人工周期（早上7点开灯），随意提供食物和水。所有有关动物实验的程序均经哈尔滨医科大学动物保护与利用委员会（HMUIRB-2008-06）和中国实验动物科学研究院（A5655-01）的批准。
0.9％氯化钠（青岛福斯肯国际贸易公司，型号：优质0.9％复方氯化钠注射液）
水合氯醛（阿拉丁，目录号：C104202）
硫酸庆大霉素，50mg / ml溶液，无菌（Sangon Biotech，目录号：B540724）
10％水合氯醛溶液（见食谱）
20 mg / ml硫酸庆大霉素溶液（见食谱）

设备

玻璃盘（Canfort实验室和教育用品，目录号：LG075）（图1C）
持针器（Sklar手术器械，型号：5-1 / 4“，目录号：21-8001）（图1D）
镊子（精细科学工具，目录号：11009-13）（图1E）
动脉剪辑（螺母国际，模型：Approximator夹）（图1F）
剪刀（精细科学工具，目录号：14068-12）（图1G）
玻璃挂钩（图1I）
电动剃须刀（义乌科美电器，型号：KM-970）（图1J）
光纤照明器（Mineralogical Research，目录号：MA312101）（图1K）
宠物用电热垫（东西易，产品编号：wi95919）（图1L）

图1.材料和设备A. 3-0丝线缝合; B.缝合的手术针; C.用无菌0.9％氯化钠的玻璃皿; D.持针器; E.钳子; F.动脉夹; G.剪刀; H. 1毫升麻醉注射器; I.玻璃钩; J.电动剃须刀; K.光纤照明器; L.电热垫。
注意：在手术之前，所有的金属器械应该在200°C的高温下进行消毒。

程序

麻醉
禁食12小时后，用10％水合氯醛（300mg / kg，参见食谱）通过腹膜内注射麻醉大鼠，大鼠在5-10分钟内达到手术麻醉。
注：麻醉深度由角膜眨眼和尾部反射评估。在大鼠达到完全麻醉之前，手术不应该进行。麻醉应至少维持1小时，以完成所有手术过程。
暴露大鼠颈总动脉（视频1）。

视频1
注意：为保持体温，建议在操作过程中将老鼠放在加热垫（37°C）上。
1. 将鼠放在电热垫上，用电动剃须刀清洁颈部周围的毛皮。（图2A）
2. 用75％的酒精棉球消毒颈部皮肤，然后沿着颈部前中线在柄上方切一个2厘米的切口。（图2B）
3. 仔细钝化解剖皮下组织并暴露胸骨舌骨肌。（图2C）
4. 仔细解剖筋膜，以暴露由二腹肌后腹，躯干肌和胸锁乳突肌组成的颈总动脉三角肌结构，然后垂直分离肌腱膜，最后暴露关键血管鞘神经。（图2D）
  注意：在暴露的三角区内，可以识别出两个重要血管和神经干，包括内部静脉和颈总动脉及其支流，迷走神经和主动脉抑制神经（年龄和性别各不相同）通常位于颈动脉和迷走神经之间。主要由胸锁乳突肌覆盖的深红色无脉内静脉位于红色脉动颈总动脉外。所以他们可以很容易地通过颜色和脉冲来区分。重要的是，在平滑的解剖过程中，为了成功的手术，小心的注意是必要的，以避免损伤两个神经。
将颈总动脉与迷走神经和主动脉抑制神经分开。（视频2）

视频2
1. 小心剥离颈总动脉周围的鞘。（图2E）
2. 用一只镊子稍微抬起颈总动脉，用玻璃钩轻轻地将颈总动脉中的迷走神经分开。（图2F）
  注意：注意避免迷走神经和主动脉压迫者的损伤，因为这种损伤可能会引起植物神经功能紊乱，增加死亡率。
  
  图2. 2VO大鼠模型的程序2-6。：一种。将老鼠装到加热垫上; B.剪下一个2.0厘米的切口， C.暴露胸骨舌骨肌; D，揭示由二腹肌后腹，嗅鞘细胞和胸锁乳突肌组成的颈总动脉三角肌结构; E.小心剥离颈动脉鞘; F.将迷走神经与颈总动脉分开; G.永久性结扎双侧颈总动脉; H.双侧颈总动脉永久性结扎示意图; I.切断两结扎丝线缝合线之间的颈总动脉; J.切断两结扎丝线之间的颈总动脉的示意图; K.使用20 mg / ml硫酸庆大霉素溶液避免潜在的术后感染; L.关闭伤口。
永久结扎或切断颈总动脉。（视频3）

视频3
1. 使用两个动脉夹夹住颈总动脉夹在心脏和头侧每个避免流血。（图2G）
2. 将两根3-0丝线（浸入0.9％无菌氯化钠中）置于颈总动脉的下面，用钳子夹住右侧（图2G和2H）。为了颈总动脉的永久性结扎，收紧丝线，然后在两根结扎的丝线之间切断颈总动脉（图2I和2J）。
3. 轻轻地取下动脉夹子。
4. 在手术过程中，医用脱脂棉将有必要去除任何潜在的出血和渗出物，以最大限度地减少术后感染的机会。
在对侧颈总动脉上进行同样的手术。（视频4）

视频4
术后护理
1. 手术后，所有的颈前肌都应该回到原来的位置。
2. 为避免潜在的术后感染，伤口应在关闭前用20 mg / ml硫酸庆大霉素溶液清洗，多余的溶液必须彻底清除。（图2K）（视频5）
  
  视频5
3. 关闭伤口。（图2L）
4. 将老鼠放回笼子，并使用温暖的光源保持稳定的温度，直到大鼠从麻醉中恢复，手术后可能需要至少1-2小时。

笔记

所有的手术过程都需要在大鼠完全放松后5分钟内完成，这将大大减少感染的机会。
动物的选择：大鼠被认为是适合2VO操作的啮齿动物物种，因为大鼠能够通过其完整的Willis环而从严重局部缺血存活，其在2VO之后不断减少血流。换句话说，Willis在沙鼠或大多数小鼠品系中的圈子正在开发中。值得一提的是，在我们的研究组中，选择SD而不是Wistar大鼠建立2VO动物模型仅仅是因为使用Wistar的死亡率高于具有相对大的Willis环的SD大鼠。另外，大鼠的体重是重要的因素。根据我们的经验，理想的体重在280-300克之间，如果体重低于280克或高于300克，肯定会增加手术过程中和手术后的死亡风险。
丝线缝合尺寸的选择：缝合线的最佳尺寸为3-0至5-0，因为丝线缝合线的直径小于3-0可能会损伤动脉，而结扎会导致出血。直径大于5-0的丝线可能导致不完全的结扎或再灌注，主要是由于结扎缝线的松动，最终导致不能诱导CBH状态。
迷走神经和主动脉抑制神经的保护：迷走神经和主动脉压迫神经在手术过程中的损伤会引起大鼠的植物神经功能紊乱，增加死亡的可能性。
温柔的表演：温柔而快速的表演在这里是必不可少的。粗略的手术很容易导致严重的出血，导致大鼠死亡。

食谱

10％水合氯醛溶液
1. 5克水合氯醛溶于50毫升生理盐水中
2. 在37°C储存
20mg / ml硫酸庆大霉素溶液
1. 4毫升硫酸庆大霉素（50毫克/毫升）用无菌氯化钠（0.9％）稀释至10毫升。
2. 在-20°C储存

致谢

感谢中国自然科学基金的支持（81271207,81070882,81471115,81671052）。该协议基于并修改了以前发表的文章：Kumaran等人（2008，Neuroscience，155：626-639）。我们要感谢帅帅拍摄的视频和Biddyut达斯的文字编辑。

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