材料和试剂

物料
1. 6孔和24孔板（Corning，Costar ，目录号：3506,3524）
2. 高品质的玻璃盖玻片，直径12mm，＃1厚度（Glaswarenfabrik Karl Hecht，Assistent，目录编号：1001/12）
  注意：使用前先用70％乙醇高压灭菌或灭菌。
3. 显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：J1800AMNZ）
4. Whatman纸（GE Healthcare，目录号：3030-917）
5. Parafilm（Bemis，产品目录号：701606）
6. 培养皿（康宁，目录号：430591）
7. 铝箔（Sigma-Aldrich，目录号：Z691569）
  制造商：希思罗科学公司，产品目录号：HD23534A。
8. 塑料技巧
细胞系（S）
所描述的程序和相关图（图2）使用HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2.1）。
注意：虽然这个程序最初是为HeLa细胞设计的，但它可以很容易地适用于其他贴壁细胞系（Graber et al。，2013）。然而，需要控制来验证任何类型的调整（例如，对于非贴壁细胞，我们描述了一个替代方案（程序D）。
试剂
1. 阿尔新蓝（Sigma-Aldrich，目录号：A5268）
2. 70％乙醇（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R40135）
3. Hoechst 33258（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：H1398）
4. Fluoromount-G（SouthernBiotech，目录号：0100-01）
5. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
6. 氯化钠（NaCl）
7. Na 2 HPO 4•7H 2 O
8. Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：41966029）
9. 谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
10. 青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10378016）
11. 胎牛血清（FBS）（Eurobio，目录号：CVFSVF0101）
12. Digitonin（Wako Pure Chemical Industries，目录号：043-21376）
13. Tris-HCl pH 7.5（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15567027）
14. 氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M0250）
15. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
16. 完整的无EDTA无蛋白酶抑制剂片剂（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：11836170001）
17. RNase Out（Life Technologies，目录号：100000840;或Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10777019）。
18. DEPC处理的水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：750023）
19. 16％多聚甲醛（PFA）（电子显微镜科学，目录号：15710）
20. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
21. 皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：84510）
22. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126）
蛋白质合成抑制剂（见表1）
1. 茴香霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9789）
2. 环己酰亚胺（CHX）（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
3. 依地酸二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：E2375）
4. 三尖杉酯碱（Santa Cruz Biotechnology，产品目录号：sc-204771）
5. 嘌呤霉素（PMY）（Sigma-Aldrich，目录号：P7255）
6. 亚砷酸钠（NaAsO 2）（Sigma-Aldrich，目录号：S7400）
抗体
1. 一抗
2. 二抗
解决方案（请参阅食谱）
1. 茴香霉素储备液（1,000x）
2. Cycloheximide（CHX）储备溶液（1,000x）
3. 依米丁二盐酸盐储备液（1,000x）
4. 三尖杉酯原液（1,000x）
5. PMY库存解决方案（1,000x）
6. 亚砷酸钠储备液（1000x）
7. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）
8. 生长介质
9. 标签介质
10. 标签控制介质
11. 提取缓冲区
12. 清洗缓冲液
13. 3％PFA
14. 共同提取/固定缓冲液
15. 染色缓冲液（SB）

设备

冰桶
37°C水浴（JULABO，型号：TW20）
二级层流罩（FASTER，型号：SafeFAST Elite）
显微镜超细镊子（电子显微镜科学，目录号：78522-7）
PIPETMAN1-20μl（Sartorius，型号：Proline Plus Plus，目录号：728030）
PIPETMAN20-200μl（Sartorius，型号：Proline Plus Plus，目录号：728060）
PIPETMAN100-1,000μl（Sartorius，型号：Proline Plus，目录号：728070）
滑动托盘（Glaswarenfabrik Karl Hecht，Assistent，目录编号：2700/10）
细胞培养箱（Heraeus，型号：HERACell）
离心机（Eppendorf，型号：5415 R）
微波炉
显微镜
激光扫描共聚焦显微镜：具有HCX PL APOλ兰色63.0×1.40油紫外物镜的Leica TCS SP5（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP5）。我们使用FF型浸渍液（Cargille-Sacher Laboratories，目录号：16212）
注：可以使用其他类似的系统。

软件

LAS AF V2.3.1软件（徕卡）
Imaris（Bitplane）和惠更斯（Huygens）使用经典最大似然估计算法（V3.6，Scientific Volume Imaging BV，荷兰Hilversum）进行图像去卷积的基本软件
ImageJ（NIH） https://imagej.net/Downloads

程序

在下面的协议中，我们已经包括确保标记和染色步骤的特异性所需的对照：3'翻译抑制剂对照'和1'不含PMY'对照。此外，我们描述了一个四重染色协议，允许同时可视化的核翻译网站（PMY），大型亚基核糖体蛋白（RPLP0，RPLP1，RPLP2），多合成酶复合物（赖氨酰tRNA合成酶，KRS）的一个组成部分和DNA （Hoechst 33258）。
正如“材料和试剂＃3解决方案”中所强调的，依米丁或CHX可以用作延长抑制剂来“转移”核糖体中的PMY。然而，依米丁已被证明比CHX更有效地用于PMY标记（David等人，2012a）。此外，与CHX不同，不可逆转，依米丁不必在整个手术过程中保持所有的解决方案。
已经开发了两种RPM方法：原始程序（程序A）和共固定/提取程序（程序B），更容易且更适合于非贴壁和原代细胞培养。此外，标记非贴壁细胞需要额外的步骤（程序C）。

程序A（原始RPM协议）
第1天
1. 预温的生长培养基（见食谱）在37℃水浴中。在细胞培养罩中，在6孔板的5个孔中每孔分配4ml温生长培养基。在每个孔中，使用无菌镊子仔细放置五个不重叠的盖玻片。
  注意：
  1. 备份计划封面容易被破坏，经常发生“意外”。而且，用多个Abs执行RPM总是很有趣的。由于这些原因，我们通常每口盖4个盖玻片。
  2. 建议使用尖端非常尖锐的高质量钳子，以便从盖玻片上轻松移除盖玻片。开发从24孔板中取出而不破坏它们的技巧是必需的。
  3. 避免盖玻片重叠。为了确保盖玻片不会在井中移动并相互重叠：（1）始终添加介质; （2）轻轻向下按下盖玻片以消除盖玻片和孔底部之间的气泡，轻轻地滑动盖玻片以产生粘合力。
2. 在每个孔中转移1ml含有0.5×10 6 HeLa细胞/ ml的生长培养基。轻轻摇动平板，使细胞均匀分布在孔中。孵育24小时，让HeLa细胞紧紧地连接到盖玻片和传播。当可视化扩散细胞时，免疫荧光分辨率达到最大。
第2天
1. 使用倒置显微镜检查细胞，以确保它们达到70-90％汇合。必须在不同的温度下准备几种解决方案。
  暖至37°C：
  1. 10毫升的生长介质。
  2. 4毫升新鲜制备的标记介质（临时制备，见食谱）。
  3. 1ml标记对照介质（临时制备，参见食谱）。
  冰冷：
  1. 40毫升的PBS缓冲液（见食谱）。
  2. 5毫升提取缓冲液（新鲜制作，请参阅食谱）。
  3. 5ml洗涤缓冲液（新鲜制备，参见食谱）。
  准备5毫升的3％PFA（见食谱），并保持在RT。
2. 可选步骤：确保PMY标记的特异性需要与几种翻译抑制剂预先孵育（见表1）。使用新的细胞系时，这一步是强制性的。所述的方案被设计为容纳3'翻译抑制剂对照，以不同方式防止PMY标记。将每种抑制剂稀释于2ml预热的生长培养基中。为每个分配一个孔：吸取介质并用含有相应抑制剂的介质替换。孵化时间根据抗生素的性质而有所不同，如表1所示。
  必要的控制第一次执行RPM程序时（或使用新的单元格行），建议使用at至少3个控制条件：
  1. 没有“活性核糖体”，使用翻译起始抑制剂（如Harringtonine），导致核糖体流失mRNA，最大程度地释放新生链。
  2. 没有“核糖体催化的PMY掺入”，即没有PMY。
  3. 使用诸如茴香霉素的PMY竞争剂，并且在“不存在抗原”的情况下，即没有PMY标记。
    
    表1.蛋白质合成抑制剂
3. 在每孔中吸取培养基，并用900μl预热的标记培养基（测试孔+ 3'抑制剂对照孔）或标记对照（在最后一个孔中）。
  在37°C孵育5分钟与PMY和延长抑制剂共同孵育由于emetine立即冻结翻译，它可以与PMY同时添加。
  Anisomycin是PMY的可逆竞争者，我们建议在PMY标记孵育期间在相应的孔中加入茴香霉素（以维持恒定的茴香霉素浓度）。
4. 将6孔板置于冰上，吸出培养基，并用5ml冰冷的PBS洗涤。
5. 吸取PBS，并在每个孔中加入1ml冰冷的提取缓冲液。
  在冰上孵育2分钟这一步至关重要，细胞。
6. 抽取提取缓冲液，并轻轻地加入900μl冰冷的洗涤缓冲液。
7. 轻轻地在一边吸取，并非常轻柔地添加900μL新鲜制成的3％PFA。在室温孵育15分钟。然后，用2毫升冰冷PBS替换定影液。用倒置显微镜检查孔，确保细胞仍然附着。
  注意：在染色之前存放。在PFA固定之后，细胞可以在4℃下（在PBS中）保持至少7天而不显着影响RPM染色的质量。同样，染色的盖玻片可以在-20°C长时间（几年，甚至几十年）储存和检索。
8. 继续进行“免疫染色程序”（程序D）。
程序B（共同提取/固定程序）
1. 遵循“原始RPM程序”（程序A）的步骤1-6。
2. 吸出PBS并加入1毫升冰冷的共同提取/固定缓冲液（见食谱）。
  在冰上孵育20分钟
3. 吸取共萃取/固定缓冲液。
4. 加入900μl新鲜制成的3％PFA。在室温孵育10分钟。然后，用2毫升PBS代替定影液。
5. 继续进行“免疫染色程序”（程序D）。
在非贴壁细胞上的PMY标记程序
该程序应该用于非贴壁细胞如人外周血单核细胞（David等人，2012b）。它可以在几分钟内将细胞高效附着到盖玻片上。
1. 必须事先准备“阿尔辛蓝处理过的盖玻片”
  1. 准备1％（W / V）阿尔新蓝（西格玛奥德里奇）蒸馏水的解决方案。
    这个解决方案在RT持续数月。
  2. 在微波安全的容器中，用几毫升的这种溶液完全覆盖100-200个盖玻片。
  3. 手动搅拌，确保所有的盖玻片都涂有阿尔新蓝（盖玻片往往粘在一起）。
  4. 在微波炉中加热30秒到1分钟（最大功率密度，溶液应煮沸几秒钟）。
  5. 手动摇动容器再次混合
  6. 再次加热直到沸腾。
  7. 放弃阿尔辛蓝解决方案。
  8. 用蒸馏水洗手，用戴手套的手将聚集的盖玻片分开。
  9. 用70％的乙醇清洗，直到盖玻片上只剩下很浅的蓝色。
  10. 彻底用清水洗净。
  11. 在一张大块的Whatman纸上用手分开盖玻片，让它们干燥。
  12. 阿尔辛蓝涂层的盖玻片可以保存几个月
2. 每个孔放置一个阿尔辛蓝处理过的盖玻片
3. 在室温下400×g离心细胞5分钟，通过用5ml温热的DMEM重悬细胞两次来洗涤细胞以除去任何微量的FBS。
  注意：不要与阿尔辛蓝盖玻片一起使用FBS。蓝色结合带负电荷的大分子，如糖胺聚糖。培养基中FBS的存在会抑制阿尔新蓝与膜糖蛋白的结合并阻止细胞在盖玻片上的粘附。
4. 重悬细胞在一个小体积的DMEM（至少10 6细胞/毫升）。每盖玻片一滴细胞（约50μl）。
5. 在37°C孵育5至15分钟（等待越多，伸展越好）
6. 吸出培养基，并用1毫升冰冷的PBS代替。
7. 从步骤B7开始，进行“共同提取/固定程序”（程序B）。
免疫染色程序
1. 将每种条件的盖玻片转移到24孔板（4℃保存）。然后将细胞与500μl的染色缓冲液（SB）（参见配方）在室温孵育15分钟。同时，将稀释的第一抗体稀释于强染色缓冲液中：抗PMY单克隆抗体（取决于克隆，终浓度在1-4μg/ ml之间变化），抗KRS抗体（1/200）核糖体P抗体（1 / 5,000）。为了使二抗的非特异性结合最小化，我们通常用来自用于产生二抗（通常来自Jackson ImmunoResearch的驴抗体）的物种的5％血清补充一抗。
  注意：染色缓冲液组分甘氨酸会淬火PFA的固定特性。皂苷将促进抗体对一些表位的可及性。 FBS可以减少一级抗体的非特异性结合。
2. 放下一小块Parafilm。如果需要的话，把它放在工作台上。在Parafilm上找到30μl稀释的一级抗体。这一步用于减少染色所需的主要抗体的数量。在24孔板中，需要200μl来完全覆盖盖玻片。在24孔板中染色将减少所需的工作量并最小化误差。虽然抗体可以重复使用，但是如果您有杂交瘤，单克隆抗体通常可以获得基本上无限的数量。
3. 使用镊子，小心删除盖玻片，轻轻吸去盖玻片边缘上的Kimwipe，并将细胞面朝下的一级抗体滴在石蜡膜上，去除多余的染色缓冲液。盖上培养皿，用湿纸巾贴在内顶，在室温下孵育60分钟。
  注意：
  1. 使用“珍贵的”抗体进行染色。为了限制使用贵重抗体，您只能检测到10μl。在这种情况下，您肯定需要在“潮湿的房间”孵化，以防止盖玻片干燥。
  2. 当你不小心掉下盖玻片时。不可避免地，您将放弃盖玻片，并需要确定“细胞侧”。如果细胞足够密集，可以通过举起光线并用白色薄膜寻找一边进行。如果不确定，可以抓取疑似的一侧，看看细胞的损失，或将盖玻片放在倒置的显微镜上。
4. 同时，稀释的第二抗体在强染色缓冲液中：羊抗鼠A488的1/500，驴抗兔Alexa Fluor 594的1/500，驴抗人Cy5的1/500。 />
5. 用镊子，从主要抗体斑点去除盖玻片，并放置在24孔板。用1ml 1x PBS洗三次。
6. 放下一小块Parafilm。如果需要的话，把它放在工作台上。在封口膜上找到30μl稀释的二抗。
7. 使用镊子，小心地从平板上取下盖玻片，轻轻吸去盖玻片边缘上的Kimwipe，并将细胞侧面向下放在封口膜上的二次抗体滴，多余的清洗缓冲液，盖铝箔陪替氏培养皿（保护荧光），孵化在室温下45分钟。
8. 用镊子，从二抗斑点拿起盖玻片，并放置在24孔板。用1毫升1x PBS洗两次。然后再用1毫升蒸馏水清洗。稀释Hoechst 33258蒸馏水（1微克/毫升）。
  PBS不溶解Hoechst 33285。由于这个原因，我们推荐在这一步之后使用蒸馏水洗涤。 em>
9. 吸取蒸馏水，并添加200μL稀释Hoechst解决方案。在室温孵育5分钟。
10. 用蒸馏水洗两次。
11. 在玻片上放一滴Fluoromount-G（5μl）。
  注意：
  1. Fluoromount-G 这种安装解决方案在冷时非常粘稠。为了促进小体积（5μl）的移液，我们通常在使用前将溶液在RT温热15分钟。另一个有用的技巧：用剃刀或剪刀切割塑料尖端的帮助。
  2. 每张幻灯片的盖玻片数量练习时，每张幻灯片最多可放置8片盖玻片。最大限度地减少在显微镜过程中必须操作的载玻片的数量，这些载玻片应在黑暗中进行以适应眼睛并最大化视敏度。一般来说，每张幻灯片只需要建立一次焦平面，可以在同一张幻灯片上快速查看盖玻片。仔细考虑幻灯片上盖玻片的顺序。把最重要的盖玻片，尽可能在幻灯片上进行比较。最重要的抗体应该用肉眼可见的颜色进行可视化。形成尽可能多的细胞染色的总体印象是非常重要的，这是迄今为止最容易通过眼睛完成的。同样重要的是在观看幻灯片期间或之后立即写下染色的结论。
12. 使用镊子小心地撬起一个边缘，并取出盖玻片，轻轻地放置在一个Kimwipe单元格面朝下去除水，然后将细胞面朝下安装溶液滴。
13. 将玻片置于托盘中，在室温下置于抽屉中干燥过夜以保护荧光团。
  快速干燥如果需要，可以通过在37℃孵育载玻片2-3小时来加速干燥。在安装剂干燥之前不要检查载玻片，因为这会损坏极其昂贵的油浸物镜。
14. 将纸盘保存在4°C直到分析。染色在黑暗中4°C至少稳定2周。对于更长的存储空间，我们建议使用滑动盒并存放在-20°C。
15. 用共焦显微镜分析（图2）。
  
  图2.用RPM标记的HeLa细胞的解卷图像（来自David et al。，2011年）。 HeLa细胞用PMY + CHX脉冲标记翻译核糖体并用Dig提取以除去游离的PMY和胞质成分。然后固定细胞，透化并染色KRS，PMY或核糖体P蛋白。使用ImageJ（NIH）和JACoP插件来估计共定位，所述插件编辑诸如Pearson系数（Manders等人，1992）和Van Steensel的CCF（Van Steensel等人，1996）。 KRS和RPM显示了Van Steensel的CCF大于0.75和Pearson系数（R）大于0.5的量化的广泛共定位。 Z1为10μm，5μm的棒状刻度。在出版商和Yewdell博士的许可下，从David et al。转载2011年。

数据分析

可以使用LAS AF软件（Leica），Imaris（位平面），Huygens Essentials软件（版本3.6，科学卷影像BV），Photoshop CS2（Adobe）和/或ImageJ处理图像。出于显而易见的道德原因，不得操纵将像素的数值与其实际亮度相关联的伽马函数。给定实验的每组图像必须进行相同处理以保持图像强度比。在之前的出版物（David等人，2011; 2012a和2012b; Macari等人，2015）中，使用ImageJ和Prism软件进行定量和统计分析。比较来自不同条件的翻译活动需要获取多个字段（每个条件至少6个字段以获得统计显着性）。为了使每个领域正常化，必须使用ImageJ定量PMY / ribo P染色的平均荧光比率。然后，可以绘制数值（平均值±SEM）。对于统计分析，我们以前使用双尾不成对t检验。以下文章介绍了一个例子： David 等。，2012 。

笔记

如上所述（方法＃4），第一次应用RPM或使用新的细胞系时，需要多重控制。

食谱

Anisomycin（Calbiochem）储备液（1,000x）
在100％乙醇溶液中10mg / ml（或37mM）
在-20°C储存
Cycloheximide（CHX）储备溶液（1,000x）
在50％乙醇中100mg / ml（或355mM）
在-20°C储存
依米丁二盐酸盐储备液（1,000x）
在50％乙醇中的25mg / ml（或45mM）
在-20°C储存
三尖杉酯原液（1,000x）
在100％乙醇中2mg / ml（或3.7mM）
在-20°C储存
PMY库存解决方案（1,000x）

50毫克/毫升（或91毫米）的50％乙醇在-20°C储存
亚砷酸钠储备液（1000x）
65毫克/毫升（或500毫米）的蒸馏水
在4°C储存
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
210.0mg / L KH 2 PO 4 4 9,000毫克/升NaCl
726.0 mg / L Na 2 HPO 4•7H 2 O
生长介质
达尔伯克的改良鹰的媒介与：
谷氨酰胺2毫米最终
1％青霉素/链霉素
7.5％胎牛血清（FBS）
标签介质
向5ml生长培养基中加入5μlPMY储备溶液（最终91μM）和5μl吐根碱储备溶液（终浓度45μM）或5μlCHX储备溶液（终浓度355μM） br />
标签控制介质

添加5μl依米丁储备液（终浓度45μM）或5μlCHX储备液（终浓度355μM）至1ml生长培养基
提取缓冲区
0.015％（m / v）毛地黄皂苷
50mM Tris-HCl pH 7.5
5mM MgCl 2 2/2 25 mM KCl
355μMCHX
1×EDTA无蛋白酶抑制剂（每10毫升1片）
10 U / ml RNase Out
DEPC处理过的水
清洗缓冲液
50mM Tris-HCl pH 7.5
5mM MgCl 2 2/2 25 mM KCl
355μMCHX
1×EDTA无蛋白酶抑制剂（每10毫升1片）
10 U / ml RNase Out
DEPC处理过的水
3％PFA
在1x PBS中稀释原液（16％）
共同提取/固定缓冲液
0.015％（m / v）毛地黄皂苷
50mM Tris-HCl pH 7.5
5mM MgCl 2 2/2 25 mM KCl
0.2 M蔗糖
355μMCHX
1个不含EDTA的蛋白酶抑制剂（1片/ 10毫升）
10 U / ml RNase Out
3％PFA
DEPC处理过的水
染色缓冲液（SB）
0.05％皂素
10 mM甘氨酸
5％FBS
1x PBS

致谢

JWY得到国立过敏和传染病研究所校内研究室的大力支持。 AD得益于Fondation pour la RechercheMédicale，Ligue contre le Cancer和CancéropôleGSO的慷慨资助。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

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