材料和试剂

物料
1. （Corning，目录号：431306）
2. 薄壁13.2毫升聚丙烯管（Beckman Coulter，目录号：331372）
3. Parafilm（Bemis，产品目录号：701606）
4. 移液器吸头（MμltiGuardTM吸头1-100μl，1-200μl，100-1000μl）（Sorenson BioScience，目录号：36060,14220,14200）
5. 1.5ml Eppendorf管（Sigma-Aldrich，目录号：Z666505）
  制造商：Eppendorf，目录号：022431081。
6. 96孔Millipore Multiscreen HTS PVDF板（Merck，目录号：MSIPS4W10）
7. 纸巾
细胞系（S）
虽然这个程序最初是为HeLa细胞设计的，但它可以很容易地适用于任何其他细胞系。所描述的程序和相关图片（图1）使用HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2.1）。
试剂
1. 胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300054）
2. StartingBlock TM封闭缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：37538）
3. 氯化氢（HCl）1.6％
4. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
5. 氯化钠（NaCl）
6. Na 2 HPO 4•7H 2 O（Life Technologies）
7. Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：41966029）
8. 青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10378016）
9. 胎牛血清（FBS）（Eurobio，目录号：CVFSVF0101）
10. Tris-HCl pH 7.5（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15567027）
11. 氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
12. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
13. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
14. NP-40 10％（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：28324）
15. 完整的无EDTA无蛋白酶抑制剂片剂（Sigma-Aldrich，Roche Dignostics，目录号：11836170001）
16. RNase Out（Life Technologies，目录号：100000840或Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：10777019）
17. DEPC处理的水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：750023）
18. 16％多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
19. 谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
20. 70％乙醇（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R40135）
蛋白质合成抑制剂
1. 环己酰亚胺（CHX）（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
  储备溶液（1,000x）：在50％乙醇中100mg / ml（或355mM）
  在-20°C储存
2. 依地酸二盐酸盐（Emetine）（Sigma-Aldrich，目录号：E2375）
  储备溶液（1,000x）：在50％乙醇中25mg / ml（或45mM）
  在-20°C储存
3. 嘌呤霉素（PMY）（Sigma-Aldrich，目录号：P7255）
  储备液（1,000x）：在50％乙醇中50mg / ml（或91mM）
  在-20°C储存
抗体
1. 一抗
  1. 抗嘌呤霉素小鼠单克隆抗体：杂交瘤克隆2A4可从发育研究杂交瘤银行获得科学界 http ：//dshb.biology.uiowa.edu/PMY-2A4
  2. 抗核糖体P抗体：识别60S核糖体亚基RPLP0，P1和P2（ImmunoVision，目录号：HPO-0300）的三种蛋白质的人多克隆自身免疫抗血清（来自狼疮患者）
2. 二抗
  1. 兔抗小鼠HRP结合物（Cappel）（MP Biomedical，目录号：55564）
  2. 山羊抗人Ig-HRP（Jackson ImmunoResearch，目录号：109-035-003）
解决方案（请参阅食谱）
1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）
2. 生长介质
3. 匀浆缓冲液
4. 多余的缓冲区
5. 15％蔗糖溶液
6. 50％蔗糖溶液
7. 3％PFA

设备

PIPETMAN1-20μl（Sartorius，型号：Proline Plus Plus，目录号：728030）
PIPETMAN20-200μl（Sartorius，型号：Proline Plus Plus，目录号：728060）
PIPETMAN100-1,000μl（Sartorius，型号：Proline Plus，目录号：728070）
水浴（JULABO，型号：TW20）
二级层流罩（FASTER，型号：SafeFAST Elite）
细胞培养箱（Heraeus，型号：HERACell）
离心机（Eppendorf，型号：5415 R）
倒置显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse TS100）
微孔板光度计（TECAN，型号：Infinite M200）
Dounce匀浆器（DWK Life Sciences，Kimble，目录号：885300-0002）
陶瓷珠管Lysing矩阵D（MP生物医学，目录号：116913050）
FastPrep-24 MP设备（MP Biomedicals，目录号：116004500）
超速离心机（Beckman Coulter）
转子（Beckman Coulter，型号：SW 41 Ti）
MultiScreenHTS真空歧管（Merck，目录号：MSVMHTS00）
可选：密度梯度分离器（Teledyne Isco）

软件

GraphPad Prism软件

程序

以下程序描述了用于检测嘌呤霉素与核糖体缔合的Ribo-ELISA（David等人，2012）的第一次应用：当时尚不清楚嘌呤霉素结合是否限于翻译核糖体。
吐根碱或CHX都可以用作延长抑制剂来冻结多核糖体。与CHX不同，依米丁不可逆地抑制翻译，并且在整个过程中不需要维护。
第1天：

预温的生长培养基（见食谱），PBS和37℃的水浴中的胰蛋白酶-EDTA。在70％-80％汇合处将两个175cm 2的细胞的胰蛋白酶消化。取出培养基，用10ml温热的PBS洗涤，加入5ml胰蛋白酶-EDTA并在37℃下保持5分钟。用5毫升生长培养基重悬细胞。
接种两个175cm2烧瓶，每烧瓶含有1×10 7个HeLa细胞（Corning），每个烧瓶含有15ml温生长培养基。孵育30小时，让HeLa细胞附着和增殖。
蔗糖梯度（见视频1）。准备15％和50％的蔗糖溶液（见食谱）。在13.2ml聚丙烯离心管（Beckman Coulter）中加入5ml 50％蔗糖溶液。倾斜管（几乎90°），并小心地添加5毫升的15％蔗糖溶液的顶部（慢慢地加入沿管壁流动的溶液，并慢慢地放回管垂直）。用Parafilm密封试管，轻轻将试管水平放置在试验台上。等待1-2小时，然后放回垂直位置。准备好15-50％的蔗糖梯度。存放在冰箱O.N.
注意：其他方法可用于准备渐变。方便的选择是冻融方法，该方法需要从最高蔗糖浓度（50％，40％，30％，20％，10％w / v蔗糖）开始连续冷冻（-80℃）2ml层状蔗糖溶液解决方案）（Bastide等，2017）。

视频1

第2天：

在倒置显微镜下检查HeLa细胞以确保正确汇合（在60-70％之间）。
用10ml补充有100μg/ ml CHX（或20μg/ ml依米丁）的温热生长培养基直接加入到培养基中孵育细胞5分钟。
取出培养基，用10毫升温热的PBS洗两次。加入5ml胰蛋白酶-EDTA并将细胞放回培养箱中5分钟，然后用5ml生长培养基重悬细胞，在400×g离心5分钟并用10μl洗涤沉淀两次毫升冰冷的PBS（400xg / 5分钟/ 4℃）（两种溶液都补充有100μg/ ml的CHX，参见食谱）。
注意：从这一步应该使用RNase免费提示。
通过离心（400×g / 5分钟/ 4℃）沉淀细胞。重悬细胞1毫升冰冷的匀浆缓冲（见食谱）。
将细胞悬液转移到冰上的陶瓷珠管（Lysing matrix D）。
注意：重要的是，当使用陶瓷珠裂解细胞时，NP-40在匀浆缓冲液中不是必需的：以相似的效率回收核糖体。因此，核糖体ELISA可以在没有洗涤剂的情况下进行。
在室温下涡旋20秒（使用FastPrep-24 MP装置）。
注意：代替陶瓷珠，细胞可以在冰冷的匀浆缓冲液中使用嵌入在冰中的Dounce匀浆器抚摸10次。
将上清液转移至1.5ml Eppendorf管中。
在13,000×g×4℃下旋转10分钟
仔细收集上清。
注意：如果上清液不完全清除，请重新离心。
在冷的15-50％蔗糖梯度的顶部，沿着管壁缓慢地铺上1ml澄清裂解物。用另一个样品或充满水的管子平衡转子。在4℃下以151,263×g（35,000rpm）（Beckman Coulter，转子SW41.Ti）旋转2.5小时。
分级分离（1ml级分）并使用梯度系统自动化（Teledyne Isco）在254nm处连续测量吸光度。你会得到11分数。
注意：如果您无法访问自动渐变收集器，则可以以传统的方式收集分数;从顶部手动。使用一个100毫升PIPETMAN 1毫升提示。将活塞推至最大1毫升，并将尖端与弯液面接触。小心地通过缓慢释放吸管活塞来收集1ml蔗糖。始终保持尖端与弯月面接触。把每个部分放在一个干净的1.5毫升试管中（11个部分）。
向96孔Millipore Multiscreen HTS PVDF板（11孔，泳道1）的孔中加入100μl的各部分。在以下泳道中重复该操作五次以获得两个实验条件（抗嘌呤霉素染色和抗-P蛋白染色）的技术重复（每个部分3个孔）。加载相同的板作为对照（'无嘌呤霉素标记'）。在冰上孵育板10分钟，然后使用MultiScreenHTS真空歧管对液体进行抽真空。
加200微升/孔的多聚核糖缓冲液（见食谱），再次抽真空。
嘌呤霉素标记。向实验板中加入100μl含有多聚核糖体缓冲液的PMY（91μM）和100μl浓度为100μM的多聚核糖体缓冲液（对照板）。在冰上孵育10分钟。同时，跳过这一步为了生成'没有嘌呤霉素标签'控制板。
轻轻地冲洗水槽，简单地倒在纸巾上。加入200微升多聚核糖体缓冲液，再次弹出平板。重复此操作两次。
的固定。在引擎盖内加入100μl3％多聚甲醛（PFA）（见食谱）。室温（RT）孵育10分钟。
正确处理PFA废物注意：我们在原始协议中使用了这种固定步骤来模仿细胞上的RPM程序。然而，这一步并不需要检测嘌呤化新生链。
用200μlPBS洗3次。
阻断膜。用100μl的StartingBlock TM阻断缓冲液孵育30分钟。真空。
注意：在原始程序中，StartingBlock TM提供了非常低的背景Ab绑定。使用不同的Abs，其他阻塞缓冲区可能会更好。
1抗体用50μl2.5μg/ ml抗PMy单克隆抗体（在StartingBlock TM中）在室温孵育1小时或抗核糖体抗体（1 / 5,000，在StartingBlock TM ）
用200μlPBS洗3次。
二抗。与50μl二抗HRP缀合物，用于PMY染色的兔抗小鼠和用于核糖体P染色的山羊抗人（在StartingBlock TM中为1/100）孵育1小时。
用200μlPBS洗3次。
信号产生。向每个孔中加入100μlTMB底物（KPL）。当一些蓝色变成可见的时候，用50μl的1.6％HCl停止反应。将每个孔中的液体转移到透明底部的塑料板上。然后，测量在450纳米的吸光度。
定量通过使用来自对照板的未标记孔的平均值并从测试值中减去它来确定背景染色的水平。在图示的例子中，使用GraphPad Prism软件绘制数据（图1）。

图1.应用于检测PMY与翻译核糖体结合的核糖体ELISA的示意图（来自David等人，2012）。将用吐根碱孵育15分钟的HeLa细胞或HeLa细胞裂解并在15-50％蔗糖梯度上分级分离。将部分结合到PVDF 96-孔板上，并与PMY一起孵育，这导致核糖体催化的puromycylation。通过A 260级分或通过ELISA检测核糖体蛋白质（通过人类自身免疫Ab检测到的核糖体P蛋白（这里分解成3种已知物种）），其确定60S亚单位和单体（80S）为绑定到PVDF（部分4和5）。使用12-D10通过ELISA对PMY进行纯化，并清楚地表明单体和游离60S亚单位不与PMY稳定缔合，这需要新生链。

数据分析

对于数据分析，我们以前使用GraphPad Prism软件。以下文章介绍了一个例子： David 等。，2012 。

笔记

Polysome配置文件可能会有很大的变化，取决于细胞系和翻译率。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
210.0mg / L KH 2 PO 4 4 9,000毫克/升NaCl
726.0 mg / L Na 2 HPO 4•7H 2 O（Life Technologies）
生长介质
Dulbecco改良Eagle谷氨酰胺培养基（赛默飞世尔科技）
1％青霉素/链霉素
7.5％胎牛血清（FBS）
匀浆缓冲液
50mM Tris-HCl pH7.5
5mM MgCl 2 2/2 25 mM KCl
0.2M蔗糖（Sigma-Aldrich）
0.5％NP-40（赛默飞世尔科技）
100μg/ ml CHX（Sigma-Aldrich）
无EDTA蛋白酶抑制剂（罗氏）
10 U / ml RNase Out（生命技术）
DEPC水（赛默飞世尔科技）
多余的缓冲区
50mM Tris-HCl pH 7.5
5mM MgCl 2 2/2 25 mM KCl
0.2M蔗糖（Sigma-Aldrich）
100μg/ ml CHX（Sigma-Aldrich）
无EDTA蛋白酶抑制剂（罗氏）
10 U / ml RNase Out（生命技术）
DEPC水（赛默飞世尔科技）
15％蔗糖溶液
15％蔗糖（m / v）
50mM Tris-HCl pH 7.5
5mM MgCl 2 2/2 25 mM KCl
100μg/ ml CHX（Sigma-Aldrich）
无EDTA蛋白酶抑制剂（罗氏）
10 U / ml RNase Out（生命技术）
DEPC水（赛默飞世尔科技）
50％蔗糖溶液
50％蔗糖（m / v）
50mM Tris-HCl pH 7.5
5mM MgCl 2 2/2 25 mM KCl
100μg/ ml CHX（Sigma-Aldrich）
无EDTA蛋白酶抑制剂（罗氏）
10 U / ml RNase Out（生命技术）
DEPC水（赛默飞世尔科技）
3％PFA
在PBS 1x
中稀释原液（16％）

致谢

JWY得到国立过敏和传染病研究所校内研究室的支持。 AD得益于Fondation pour la RechercheMédicale，Ligue contre le Cancer和CancéropôleGSO的慷慨资助。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Bastide，A.，Peretti，D.，Knight，JR，Grosso，S.，Spriggs，RV，Pichon，X. Sbarrato，T.，Roobol，A.，Roobol，J.，Vito，D.，Bushell，M von der Haar，T.，Smales，CM，Mallucci，GR和Willis，AE（2017）。 RTN3是一种新型的冷诱导蛋白，能够介导RBM3的神经保护作用。 > Curr Biol CB 27：638-650。
David，A.，Dolan，B.P.，Hickman，H.D.，Knowlton，J.J.，Clavarino，G.，Pierre，P.，Bennink，J.R。和Yewdell，J.W。（2012）。通过核糖体结合的新生链嘌呤化进行可视化的核翻译