材料和试剂

注意：这里描述的方案是基于三种阴性坏死病毒的成功RCA（Bömer等，2016）。

耗材

用于取样和研磨（10 x 15厘米）（Polybags，目录号：46500）的量规袋
1.5ml微量离心管（Alpha Laboratories，目录号：LW2375）
200μlPCR管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：AB0266）
移液器提示
培养皿，圆形，9×1.6厘米（Alpha Laboratories，目录号：RC2260）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（MW 40kDa）（Sigma-Aldrich，目录号：PVP40T）
QIAGEN Genomic-tip 20 G或100 G柱（QIAGEN，目录号：10223或10243）

植物材料
国际热带农业研究所（IITA），伊巴丹，印度尼西亚，印度尼西亚和新西兰的薯类植物（例如，盾叶薯<（Dioscorea rotundata）和艾拉塔（D. alata）尼日利亚）。在图4和图5的图例中提供了登录号
感受态细胞和质粒
1. 胜任的细胞
  1. NEB 5 5-α主管 E。（高效率）（New England Biolabs，目录号：C2987）
  2. JM109感受态细胞（Promega，目录号：L1001）
2. 质粒
  1. pUC19（New England Biolabs，目录号：N3041）
  2. pGEM 3Zf（+）（Promega，目录号：P2271）
试剂
1. 去离子水（无菌）
2. 无核酸酶的无菌去离子蒸馏水，例如HyClone TM水，分子生物学级（GE Healthcare，HyClone TM，产品目录号：SH30538 .02）
3. 克隆
  1. 可选：pGEM ® -T Easy Vector Systems（Promega，产品目录号：A1360）
  2. 可选：碱性磷酸酶（例如，TSAP热敏碱性磷酸酶，Promega，目录号：M9910）
4. 寡核苷酸（5'-3'），10μM
  1. Badna-FP_ATGCCITTYGGIITIAARAAYGCICC
  2. Badna-RP_CCAYTTRCAIACISCICCCCAICC
  3. M13F_TGTAAAACGACGGCCAGT
  4. M13R_CAGGAAACAGCTATGACC
  5. SP6_ATTTAGGTGACACTATAG
  6. T7F_TAATACGACTCACTATAGGG
  注意：Badna-FP / RP引物是退化的。 I = nosine，Y = p Y （C或T），R =尿液（A或G），S = S / strong>交互（C或G）。
5. 酶和缓冲液
  Badna-PCR和菌落PCR
  1. DreamTaq绿色DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EP0713）
  2. 10x DreamTaq绿色缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，随酶提供）
  3. dNTP组（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0182）
  4. 琼脂糖（Bioline，目录号：BIO-41025）
  5. SYBR TM TM Safe TM DNA凝胶染色剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：S33102）。
  6. DNA载入染料，例如6×凝胶加载染料，紫色（New England Biolabs，目录号：B7024）
  7. DNA大小的标准品，例如GeneRuler TM 1kb Plus DNA梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：SM1331） br />
  8. Tris-Borate-EDTA（TBE）缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：T4415）
  RCA
  Illustra TM TempliPhi 100扩增试剂盒（Amersham Biosciences，目录号：25640010）
  
  限制酶消化
  1. HindIII（New England Biolabs，目录号：R0104S）
  2. NEBuffer TM 2.1（新英格兰生物实验室，目录号：B7202S，提供有HindIII酶）。
  3. （新英格兰生物实验室，目录号：R0140S）
  4. NEBuffer TM 3.1（New England Biolabs，目录号：B7203S，与PstI酶一起提供）
  的结扎
  1. T4 DNA连接酶（Promega，目录号：M1801）
  2. T4 DNA连接酶10x缓冲液（Promega，目录号：C126B，与酶一起提供）
6. 抗生素和蓝色：转化体的白色选择
  1. 氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9518，在去离子水中储备50mg / ml，过滤灭菌）
  2. 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I6758，在去离子水中0.1M储备，过滤灭菌）
  3. X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷）（Sigma-Aldrich，目录号：B9146，在二甲基甲酰胺中储备50mg / ml）
7. DNA纯化
  1. PCR纯化，例如GeneJET PCR纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：K0701）。
  2. 凝胶纯化，例如，源TM凝胶纯化试剂盒（Source BioScience，目录号：SBS28706）
  3. 质粒分离，例如GeneJET质粒小量制备试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：K0502）
8. 苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），用10mM Tris，pH8.0,1mM EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：P3803）饱和。
9. 氯仿：异戊醇（24：1）（Sigma-Aldrich，目录号：C0549）
10. 异丙醇（Molecular Biology Grade，Fisher BioReagents）（Fisher Scientific，目录号：BP2618212）
11. 来自牛胰腺的核糖核酸酶A（RNase A）（Sigma-Aldrich，目录号：R4642）
12. 液氮
13. 用于CTAB核酸提取的化学品（参见食谱）
  1. CTAB解决方案
    十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（Sigma-Aldrich，目录号：H6269）
  2. Tris-HCl溶液，pH 8
    Tris碱（Trizma base，Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
    37％HCl（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
  3. EDTA溶液，pH 8
    乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
    氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：1064621000）
  4. NaCl溶液
    氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
    亚硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：71988）
14. 用于E的LB培养基。大肠杆菌（见食谱）
  1. 带有琼脂（Lennox）的LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L2897）
  2. LB肉汤（Miller）（Sigma-Aldrich，目录号：L3522）

设备

注意：不需要特定的设备。任何适当的设备都可以使用。

平衡
移液器
匀浆器手模型（Bioreba，目录号：400010）
水浴
通风柜
SpeedVac浓缩器（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM TM，型号：Savant TM DNA 120 SpeedVac TM浓缩器）
热循环仪（例如，Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：Veriti 96-Well热循环仪）。
Thermoblock（例如，Eppendorf，型号：ThermoMixer®C）
平板培养箱（37°C）
摇床（37°C）
水平凝胶电泳系统（例如，Fisher Scientific，型号：Fisherbrand TM sub-gel midi-plus）
UV透照器（例如，Syngene，型号：G：BOX Chemi HR16）

软件

NEBcutter V2.0（ http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ ）
MEGA版本7.0（ http://www.megasoftware.net/ ）
SnapGene ® Viewer版本4.0.4（来自GSL Biotech;可从 snapgene.com 获取）

程序

从Lodhi et al。（1994）修改的山药叶的总核酸提取物。
注意：在大多数步骤的通风橱中工作（至少步骤1j-1l）。
1. 准备CTAB提取缓冲液（配方5）并在水浴中将缓冲液预热至60°C。
2. 选择单独的叶子样品，并收集新鲜的叶子在小号袋（10×15厘米）。过程立即离开（图2A和2B）。
3. 称量约300毫克叶样品，并放入一个新的小号袋（图2C）。
4. 通过将计量袋浸入液氮中简单地将叶片冻结。
  没有液氮应该进入袋子（图2D）
5. 使用匀浆器立即将冷冻的叶子组织手动研磨成细粉末（图2E）。
6. 研磨直到解冻开始，组织形成“光滑的糊状物”。加入1毫升预热的CTAB提取缓冲液，并使用匀浆器再次短暂研磨（图2F和2G）。
  
  图2.山药叶取样和研磨总核酸提取物A.山药叶显示病毒症状; B.用小号袋收集山药叶; C.称量〜300毫克新鲜山药叶材料; D.在液氮中快速冷冻叶片材料; E.使用均化器将冷冻的叶组织研磨成细粉; F.研磨直到融化开始，组织形成“光滑的糊状物”; G.加入CTAB萃取缓冲液后进一步研磨。
7. 再加入2ml CTAB提取缓冲液（最终体积为1ml / 100mg鲜叶材料）并使用匀浆器充分混合。
8. 使用宽孔或切割1毫升移液枪头将700微升的液汁分别放入三个新鲜的1.5毫升微量离心管中（图3A和3B）。保持冰上，直到所有的样品处理。
9. 简单地涡旋样品并在60℃在水浴中孵育30分钟。偶尔将微量离心管翻转20次（大约每10分钟一次）（图3C）。
10. 使样品达到室温并加入等体积（700μl）苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（图3D）。（可选：可使用氯仿：异戊醇（24：1））。将管倒置50次，以15,000×g离心10分钟（图3E），混合成乳液。 >
11. 小心地将上层水相（约600μl）（图3F）转移到新的1.5ml微量离心管中而不干扰相，并加入等量的氯仿：异戊醇（24:1），如前所述混合并旋转。 />
  
  图3.取样和研磨山药叶的总核酸提取。 A-B。使用大孔径或切割1毫升移液枪头，将700μl液体分别装入3个新鲜的1.5 ml微量离心管中。 C.在水浴中将样品在60℃孵育30分钟，并通过颠倒微量离心管混合样品。 D.使样品达到室温并加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）。 E.通过翻转管混合成乳液。 F.离心后，小心转移上层水相而不会干扰相间。
12. 小心地将上层水相（约400μl）转移到新鲜的1.5ml微量离心管中，小心不要干扰相间。
13. 加入75μl5M NaCl（配方4）和450μl冰冷的异丙醇沉淀DNA。充分混合样品，在-20°C孵育1小时。
  从这里开始工作
14. 在15,000×g和4℃下离心样品10分钟并丢弃上清液。
15. 在500μl70％乙醇中用15,000×gg和4℃离心5分钟将沉淀洗涤两次。
16. 通过倾析除去70％的乙醇，并使用真空浓缩器风干颗粒。由于颗粒难以重新悬浮，因此不要完全干燥。
17. 将沉淀物重悬于100μl无核酸，无菌蒸馏去离子水（SDW）中4°C过夜。
  可选：为了获得最佳的RCA检测效果，DNA沉淀可以重新悬浮于2 ml重悬缓冲液（配方6）中，并合并（从开始时起三个等分试样），然后通过QIAGEN Genomic-tip 20 G或100 G柱纯化根据制造商的说明。包括这个柱纯化步骤被发现提高了RCA的效率。将最终的沉淀物在4℃下重悬于200μl无核酸酶的SDW中过夜。
使用通用坏病毒引物对Badna-FP / -RP（Yang等人，2003），通过PCR筛选山药DNA样品的坏死病毒序列。
1. 如下提取每个提取的DNA样品20μlPCR反应物。最后的浓度在括号内显示：
  2μl10x DreamTaq绿色缓冲液（1x）
  0.5μldNTPs（0.25mM）
  1μlBadna-FP（0.5μM）
  1μlBadna-RP（0.5μM）
  0.2μlDreamTaq DNA聚合酶（0.05U /μl）
  1μl模板DNA（1ng /μl）
  
  14.3μl去离子水
2. PCR扩增的循环条件为95℃5分钟（初始变性），然后94℃20秒（变性），56℃30秒（退火），72℃30秒（伸长），最后72℃延伸7分钟。
3. 在1.5％（w / v）琼脂糖凝胶上加载5-20μlPCR反应物，包括在0.5x TBE缓冲液中的1x SYBR Safe DNA凝胶染色。预期的扩增子是579bp（图4）。
  可选：为了确认DNA用于PCR扩增的适合性，如Silva等人所述，首先使用靶向yam肌动蛋白基因的引物筛选所有的DNA样品。（2015）。
  
  图4.通过PCR筛选坏疽病毒序列的山药DNA样品典型的琼脂糖凝胶显示来自山药的Badna-PCR阳性DNA样品预期的扩增子大小为579bp。泳道1 = TDr 89/02475-A，泳道2 = TDr 89/02475-B，泳道3 = TDr 89/02677，泳道4 = TDr 95/18544，泳道5 = TDr 96/00629，泳道6 = TDr 1892- A泳道7 = TDr1892-B，泳道8 =泳道，泳道9 = TDr00 / 00362-B，泳道10 = TDr94 / 01108-B，泳道11 = Adaka-B，泳道12 = TDr03 / 00196- A泳道13 = TDr 00/00403泳道14 = Adaka-B泳道15 = TDr 00/00362-B泳道16 = TDr 00/00362-C泳道17 = TDr 94/01108-B泳道18 = TDr 03/00196-B。 Adaka和Pona是山药品种和山药品种号码，其次是A-C描绘了同样山药品系的克隆。 -ve =包含在另一个凝胶中的PCR阴性对照。
使用Illustra TM TempliPhi 100扩增试剂盒通过RCA筛选Badna-PCR阳性的山药DNA样品。
1. 如下在PCR反应管中建立RCA反应（终体积10μl）。最后的浓度在括号内显示：
  3.5μl试剂盒样品缓冲液
  0.25μlBadna-FP（0.5μM）
  0.25μlBadna-RP（0.5μM）
  1微升未稀释的DNA
2. 在95℃变性样品3分钟（例如，在热循环仪中），立即在冰上冷却。
3. 准备一个主混合如下：
  5μlKit反应缓冲液（每次反应）
  包含Phi29聚合酶的0.2μlKit酶混合物（每个反应）
4. 使用热循环仪在30°C孵育RCA反应18小时
5. 在65°C灭活RCA反应10分钟注意：在使用RCA反应模板之前不要冷冻DNA样品，而应保持在4°C。这提高了RCA反应效率。
基于病毒基因组（例如使用软件NEBcutter V2.0 [Vincze et al。，2003]），用限定性内切酶（理想的是单个切割器）鉴定消化的RCA产物预期序列，或者当病毒基因组序列未知时使用例如HindⅢ或PvstⅠ产生有用的限制性概况。
1. 根据制造商的说明消化2μl的RCA产品。
2. 将消化物与DNA负载染料混合，并将其装载在0.6％（w / v）琼脂糖凝胶上。
  通过凝胶电泳分离消化的RCA限制性片段（图5）
3. 从凝胶切割和纯化感兴趣的RCA限制性片段。切割感兴趣的条带时使用最小的紫外线照射。这将改善下游的克隆效率。
  注意：一个切割器将产生约7.5kbp的RCA限制性片段，这是一种坏死病毒基因组的典型大小。用HindIII和PstI消化未知的坏死病毒的混合感染可能会产生非常复杂的限制模式。见Bömer等人的图1。（2016年）为例。
  
  图5.通过凝胶电泳分离来自六个Dioscorea物种的经EcoRI消化的RCA限制性片段限制性消化模式表明存在不同的游离体（Dioscorea alata）（TDa）和盾叶薯<（Dioscorea rotundata）（TDr）材料（Bömer等人，2016）中的坏死病毒序列以及混合感染。一些RCA产品似乎只是部分消化。 M = 1kb DNA 1a
（可选）使用通用坏病毒引物对Badna-FP / -RP（Yang等人，2003）通过PCR筛选纯化的RCA限制性片段。序列阳性Badna-PCRs评估坏死病毒的多样性。这样，重点就可以引导到新的坏病毒。
1. 使用纯化的RCA限制片段作为模板，按照步骤2所述进行Badna-PCR反应
2. 纯化阳性Badna-PCR并使用Badna-FP / -RP引物对通过Sanger测序在两个方向上分析部分RT-RNaseH序列。预期的序列长度为579 bp。
  可选：在使用pGEM ® -T Easy克隆试剂盒进行测序之前，可以根据制造商的说明或同等方法克隆PCRs。然后插入物可以在一个方向上用SP6或T7F底漆进行测序。
按照制造商的说明用适当的克隆载体（例如，pUC19或pGEM-3Zf（+））与步骤4中选择的相同限制性内切酶一起消化以使载体线性化。
1. 将消化物与载有DNA的染料混合并装载到1％（w / v）琼脂糖凝胶上。通过凝胶电泳分离消化未消化的条带。
  可选：用碱性磷酸酶按照生产商的说明处理线性化载体，以防止自我连接。
2. 从凝胶中纯化线性化的载体主链（pUC19为2.7kbp; pGEM3-3Zf（+）为3.2kbp）。
提取消化的RCA片段和线性化的载体。
1. 如下在1.5ml微量离心管中设置10μl连接反应物。括号内显示最终浓度： 1μlT4 DNA连接酶10x缓冲液（1x）
  1μlT4 DNA连接酶（3U）
  线性化载体（10 ng至50 ng）
  RCA限制性片段（取决于插入片段和插入片段的大小：10ng至25ng：载体比率，例如1:1或3:1）。
  无核酸酶，无菌蒸馏去离子水10微升
2. 混合反应，并在室温下孵育1小时或在4°C过夜。
使用2-4μl的连接反应转化化学感受态NEB 5-α大肠杆菌（对于pUC19）或JM109大肠杆菌
做殖民地PCR基因型转化。通常测试5至10个菌落足以获得阳性转化体。
1. 如下设置每个菌落20μlPCR反应物。最后的浓度在括号内显示：
  2μl10x DreamTaq绿色缓冲液（1x）
  0.5μldNTPs（0.25mM）
  1μlM13F（对于pUC19;使用SP6代替pGEM -3Zf（+））（0.5μM）
  1μlM13R（用于pUC19;用T7F用于pGEM <-3Sf（+）代替）（0.5μM）
  0.2μlDreamTaq DNA聚合酶（1U）
  15.3μl去离子水
2. 使用移液器吸头挑取白色菌落，并在LB-amp，IPTG，X-Gal平板上重新划线。之后，直接将尖端浸入PCR反应中以转移少量细胞。在37°C孵育大约5小时（或过夜），并在热循环仪中运行PCR。
  可选：可以将细胞浸入20μl无菌去离子水中而不是PCR反应。然后将菌落 - 水在95℃孵育5分钟，并用作菌落PCR的模板（1μl）。这种方法允许在发生故障时重复PCR。
3. PCR扩增的循环条件为95℃5分钟（初始变性），然后是94℃30秒（变性），52℃30秒（退火），72℃1分钟/ kbp插入大小（伸长率），最后72℃延伸7分钟。
4. 在1.5％（w / v）琼脂糖凝胶上加载5-20μlPCR反应物，包括在0.5x TBE缓冲液中的1x SYBR Safe DNA凝胶染色。预期的扩增产物取决于克隆的RCA限制性片段大小。
5. 准备5毫升的LB放大器，并从restreak板挑取PCR阳性克隆。
  在37°C，200转/分的条件下孵育过夜
6. 从阳性克隆中分离质粒，使用M13F / R或SP6 / T7F引物进行Sanger测序分析插入片段，以及设计用于散装坏病毒基因组的特定引物。注意：由于插入片段的大小，如果已经克隆了大约7.5kbp的完整的坏病毒基因组，则菌落PCR将是低效的。检查插入的存在和大小也可以通过质粒限制性消化来实现。

数据分析

从质粒克隆和PCR产物产生的核苷酸序列可以使用序列分析工具，例如MEGA 7.0版（“目标” = “_blank”> http://www.megasoftware.net/ ）。在所有情况下，至少三个独立的克隆应在两个方向上进行测序，以确定推定的全长坏病毒基因组的准确序列。载体序列可以使用National Center for Biotechnology Information（NCBI）VecScreen（ http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/ ）和NCBI基本局部比对搜索工具（BLAST）。基因组图谱可以使用SnapGene > Viewer 4.0.4（来自GSL Biotech;可在 snapgene .COM ）。编辑的序列可用于NCBI GenBank数据库中的相似性BLAST搜索（ http：//www.ncbi .nlm.nih.gov / GenBank登录/ ）。可以使用MEGA版本7中的CLUSTALW默认设置进行部分RT-RNase H序列的多重比对，其中还可以分析系统发育关系。这已经在我们以前的研究中成功地完成了（Bömer等人，2016年）。

笔记

RCA广泛用于扩增病毒基因组，我们建议由Johne等人撰写（2009）。使用RCA在山药中进行可再生的DBV扩增需要进一步改进，并可能受到这些坏病毒的低病毒滴度以及通常存在于山药DNA提取物中的抑制物质（例如酚类化合物和多糖）的相对高含量的不利影响。通过RCA立即分析提取的DNA样品似乎使DBV扩增更有效，并且强烈推荐。因此，避免不必要的提取DNA的冷冻循环，并将DNA提取物储存在4°C。

食谱

CTAB解决方案
在去离子水中10％（w / v）CTAB
高压灭菌CTAB解决方案在121°C和2巴15分钟
Tris-HCl溶液，pH 8（1 L）
1 M Tris基地

加入浓盐酸（〜42毫升）调节pH值至8 在121℃和2巴的高压釜Tris-HCl溶液中15分钟
EDTA溶液，pH 8（1 L）
0.5M EDTA
用NaOH（〜20克氢氧化钠颗粒）调节至pH 8。
在121℃和2巴的高压灭菌器EDTA溶液中保持15分钟
NaCl溶液
5 M NaCl去离子水
在121℃和2巴的高压灭菌器NaCl溶液中15分钟
CTAB提取缓冲液（10毫升）
2％（w / v）CTAB
0.1M Tris-HCl，pH8
0.02 M EDTA，pH 8
1.4 M NaCl
1％（w / v）亚硫酸钠
2％PVP（MW 40 kDa）
添加去离子水10毫升
可选：每1 ml CTAB提取缓冲液中加入1μlRNase A（20-40 mg / ml）以去除RNA。
注意：使用前立即从储备溶液中准备CTAB提取缓冲液;新鲜制备的缓冲液才是好的。
重悬缓冲液（pH 7）
50mM Tris-HCl
0.7 M NaCl
10 mM EDTA
用于E的LB培养基。大肠杆菌（1L）
25克液体LB LB培养基（Miller）或35克LB琼脂培养基（Lennox）LB培养基
1升去离子水
高压灭菌LB培养基在121°C和2巴15分钟
注意：在添加抗生素之前，应稍微冷却。

致谢

这个协议是基于我们以前在病毒（Bömer et al。，2016年）上发表的工作。 8：188; doi：10.3390 / v8070188 ）。作者衷心感谢Bill＆amp;美林达•盖茨基金会（BMGF）在“开发农场强健诊断工具包（为山药病毒）”资助下向自然资源研究所（NRI）提供资助。 Ajith Rathnayake得到格林威治大学授予的副校长博士学位的支持。在IITA的山药研究由BMGF支持的“西非收入和粮食安全的改良YIIFSWA”项目和CGIAR根，块茎和香蕉研究计划资助。作者声明他们没有竞争利益。

参考

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