材料和试剂

移液器吸头（Genesee Scientific，Olympus Plastics，目录号：24-412,24-430,24-401）
100毫米的菜肴（康宁，目录号：430167）
60毫米盘子（康宁，目录号：430166）
12孔板（康宁，目录号：3513）
6孔板（康宁，目录号：3516）
1.5ml离心管（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录编号：05-408-129）
Amicon Ultra-0.5离心过滤装置，NMWL 10（Millipore Sigma，目录号：UFC501096）
15 ml锥形管（DOT Scientific，目录号：229411）
50毫升锥形管（DOT Scientific，目录号：229421）
细胞过滤器（70μm，Corning，Falcon ，目录号：352350）
NuPAGENovex3-8％Tris-乙酸盐凝胶，1.0mm，15孔（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：EA03755BOX）
Neuro2A细胞（ATCC，目录号：CCL-131）
Neuro2A-mHtt细胞（稳定表达来自含有72个谷氨酰胺的氨基酸1-571的mHtt片段）（Trajkovic等人，2017）
mHtt-Flag慢病毒（编码来自氨基酸1-571的mHtt片段的慢病毒，含有72个具有C端Flag标签的谷氨酰胺）
Sprague Dawley胚胎E18，两性（Charles River Laboratories）
聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P1149）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B7660）
硼砂（Sigma-Aldrich，目录号：B9876）
氢氧化钠（NaOH）（Avantor Performance Materials，目录号：5000-02）
DMEM（4.5g / L葡萄糖，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠; Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11995073）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：31985088）
来源于美国的胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：16000044）
4×Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610747）
2x Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610737XTU）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
牛奶（雀巢康乃馨即时脱脂奶粉）
TBST（20x，含2％Tween-20，pH7.4）（Boston Bio Products，目录号：IBB-180X）
抗亨廷顿蛋白抗体MAB5490（Millipore Sigma，目录号：MAB5490）
（H + L）（min X Hu，Bov，Hrs，Rb，Sw Sr Prot）（Jackson ImmunoResearch，目录号：115-035-146）
过氧化物酶-AfeiniPure山羊抗小鼠IgG
SuperSignal TM西Femto最大灵敏度底物（Thermo Fisher Scientific，目录号：34096）
10×HBSS（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：14185052）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
100mM丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：11360070）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
10,000U / ml青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15140122）
胰蛋白酶2.5％（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15090046）
神经基础培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：21103049）
B27添加物（50x）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：17504044）
L-谷氨酰胺，200mM（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：25030081）
Ponceau S溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P7170-1L）
HIV-1 p24抗原ELISA（ZeptoMetrix，目录号：0801111）
Pierce TM LDH细胞毒性测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：88953）
0.1 M硼酸缓冲液（见食谱）
DMEM / 10％热灭活FBS（见食谱）
0.3 M HEPES（见食谱）
HBSS（见食谱）
血清培养基（见食谱）
完整的神经元媒体（见食谱）
神经元分泌介质（见食谱）

设备

自动移液器（Gilson，型号：Pipetman®L，产品目录号：F167370）
Forma TM TM Steri-Cycle TM CO 2培养箱，37℃（Thermo Fisher Scientific，型号：Forma TM TM） Steri-Cycle ）
S-500轨道摇床（VWR，型号：S-500，目录号：14005-830）
Eppendorf冷冻离心机（Eppendorf，型号：5417 R）
Allegra X-30离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-30）
Bio-Rad Trans-Blot TM Turbo TM转移系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Trans-Blot TM Turbo TM TM） / sup>传输系统）
ChemiDoc TM XRS +系统（Bio-Rad Laboratories）

软件

ImageJ软件
用于ChemiDoc TM XRS +系统（Bio-Rad Laboratories）的Image Lab TM软件

程序

通过免疫印迹从Neuro2A细胞分泌的突变体亨廷顿蛋白的检测（图3）

图3.蛋白质分泌测定的示意图
1. 在室温（RT）下，用1ml聚-D-赖氨酸（在0.1M硼酸盐缓冲液中50μg/ ml [参见配方]）将每孔的12孔板包衣1小时;用1ml高压灭菌的Milli Q水（RT）洗两次孔。
2. 将800,000个Neuro2A-mHtt细胞铺在每个孔上并加入DMEM / 10％热灭活的FBS（37℃;参见食谱）至总体积1ml。
3. 将细胞置于含有5％CO 2的培养箱中37°C孵育5-6小时。
4. 在此期间，使用含有在10ml DMEM / 10％热灭活的FBS中生长的幼稚Neuro2A细胞（Neuro2A不表达mHtt）的100mm培养皿制备条件培养基。用10ml的Opti-MEM取代培养基，并在37℃下在具有5％CO 2的培养箱中孵育细胞4小时。收集得到的条件Opti-MEM并立即在步骤A5使用。
5. 用来自步骤A4的800μl新鲜调理的Opti-MEM替换来自步骤A3的Neuro2A-mHtt细胞的培养基，并再孵育细胞1-4小时。在分析mHtt分泌物之前，将各孔的培养基转移至各1.5ml离心管中并置于冰上。在200μl含有5％2-巯基乙醇的2x Laemmli缓冲液中将细胞溶解在冰上，将裂解物转移到1.5ml离心管中，并在处理培养基时将其储存在冰上。
6. 将培养基以2000×g离心20分钟以除去细胞碎片。将500μl澄清的上清液转移至离心过滤装置，并以14,000×gg离心30分钟。将所得到的浓缩培养基（〜40μl）转移至干净的离心管中，加入其体积为13.3μl的4倍Laemmli缓冲液（含10％2-巯基乙醇）。处理培养基并在4°C下进行所有离心步骤。
7. 煮沸细胞裂解物和上清液5分钟，然后放置在冰上。
8. 在Laemmli缓冲液中加入15μl每孔的浓缩培养基，在3-8％Tris-乙酸盐凝胶上每孔加入8μl细胞裂解物。通过SDS-PAGE分离蛋白质。使用Bio-Rad Trans-Blot TM Turbo Transfer TM系统将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
9. 在溶于TBS-Tween（RT）中的5％牛奶中孵育膜1h，然后在5％BSA / TBS-Tween（4℃）中以1：1,000溶解的抗Htt抗体过夜。在TBS-Tween中洗膜3次，每次5分钟，并在TBS-Tween（RT）中以1:3,000稀释的二次抗体中继续孵育2小时。在TBS-Tween（RT）中洗膜3×5分钟。在2级振荡器上用牛奶和抗体进行所有洗涤和孵育。将膜暴露于West Femto Substrate，并使用ChemiDoc成像系统显示mHtt。
10. 图1说明了使用该协议获得的数据的一个代表性例子。
蛋白质印迹法检测初级皮层神经元分泌的突变亨廷顿蛋白初级皮质神经元的制备
1. 用2ml聚-D-赖氨酸（在0.05M硼酸盐缓冲液中50μg/ ml [参见配方]）将每孔的6孔板过夜（RT）包被。用2ml高压灭菌的Milli Q水1×5分钟，1×1小时，1×过夜，然后在第二天（RT）2×1小时洗涤每个孔。不要让盘子随时干燥。用1ml血清培养基填充每个孔（见食谱）。
2. 在E18处提取大鼠胚胎的大脑并将其解剖在HBSS中（见食谱）。去除脑膜并将皮质放置在冰上60毫米的5毫升HBSS中。
3. 在组织培养罩中将组织切成HBSS中的小块。将切碎的组织与HBSS一起转移到15ml锥形管中。
  除非另有说明，否则以下步骤应在室温下进行
4. 让组织下降到底部，吸出大部分上清液，加入10毫升HBSS，重复这一步3-4次。最后一次，离开4.5毫升的上清，加入0.5毫升2.5％胰蛋白酶和翻转管混合。
  在37°C孵育15分钟
5. 加入5毫升HBSS轻轻混合，翻转管。
  用移液管除去2毫升上清液
6. 使用P1000移液器上下移液10次以分离组织。使用细胞过滤器过滤获得的细胞悬液并将滤液收集到50ml锥形管中。用4毫升HBSS冲洗细胞过滤器，并将滤液收集到相同的管中。
7. 将滤液转移到15ml锥形管中，并在室温下500×g旋转5分钟。吸出上清液。
8. 颗粒大部分是白色的，底部有一些红色的细胞。为了确保培养物的纯度，通过轻敲管子（红细胞更紧凑并且将保持连接到管的底部）仅移出颗粒的白色部分，并将细胞重悬于4ml /血清培养基的脑中相同的管（见食谱）。将细胞悬液转移到新的锥形管中。
9. 在含有总共2ml血清培养基的聚-D-赖氨酸包被的6孔板中每孔铺板700,000个细胞。
10. 2小时后，用2ml完全神经元培养基替换血清培养基（见食谱）。
Western blotting检测突变亨廷顿蛋白
1. 在DIV（天体外实验）3中，以5MOI（病毒当量为700ng p24; 1ng p24含有5000个感染性颗粒）转导具有mHtt-Flag慢病毒的原代皮层神经元。
2. 24小时后，用全神经元培养基更换培养基。
3. 在DIV10，用1ml神经元分泌介质替换培养基（见食谱）。
4. 过夜培养后收集培养基;集中和分析程序A中的媒体。
5. 将细胞直接溶解在500μl2x Laemmli缓冲液中。
6. 对于使用此协议获得的结果的代表性实例，请参阅2017年的Trajkovic 等。。

数据分析

使用ImageJ软件的“分析凝胶”模块确定条带的强度。测定细胞外和细胞内蛋白质的比例。所有实验重复至少三次。意义是使用不成对的 t - 测试确定的。

笔记

由于存在于细胞培养基中的蛋白质可能是真正分泌的蛋白质以及由于自发性细胞溶解和用于治疗细胞的一些试剂的毒性作用释放的蛋白质，建议进行LDH对从对照和处理的细胞收集的培养基进行细胞毒性测定。为此，根据生产商的说明使用LDH细胞毒性分析试剂盒。只有不引起显着毒性的治疗才应被考虑进一步分析。

食谱

注意：所有的解决方案应该保存在4°C。

0.05 M硼酸盐缓冲液
1.24克硼酸
1.90克硼砂
溶于总共500ml Milli Q H 2 O
用1N NaOH调节pH至8.5;过滤消毒
DMEM / 10％HI FBS
添加50毫升热灭活FBS到450毫升DMEM
0.3 M HEPES
7.15克HEPES
〜90ml H 2 O 使用10 N和1 N NaOH将pH调节至7.3 加Milli Q H 2 O至100ml最终体积
HBSS
50毫升10倍HBSS

16.5 ml 0.3 M HEPES（见上文） 5毫升100毫克丙酮酸钠
3克D-葡萄糖（西格玛奥德里奇）
5毫升青霉素/链霉素库存
加入Milli Q水至最终体积500 ml;过滤消毒
血清培养基
44毫升Neurobasal媒体
5毫升HI FBS
0.5毫升青霉素/链霉素库存
0.5毫升谷氨酰胺股票
完整的神经元媒体
10毫升B27补充
5毫升青霉素/链霉素库存
5毫升谷氨酰胺库存
添加到480毫升Neurobasal培养基
神经元分泌介质
1毫升B27补充
5毫升青霉素/链霉素库存
5毫升谷氨酰胺库存
添加到489毫升Neurobasal培养基

致谢

这项工作得到了R01NS080331（D.K.）的支持。该协议最初发表于“神经科学杂志”（Journal of Neuroscience）（Trajkovic等人，2017）。作者宣称没有利益冲突。

参考

Chevallet，M.，Diemer，H.，Van Dorssealer，A.，Villiers，C。和Rabilloud，T。（2007）。更好地分析分泌的蛋白质：髓细胞分泌组的例子 < em> Proteomics 7（11）：1757-1770。
Lee，M.C.，Miller，E.A.，Goldberg，J.，Orci，L。和Schekman，R。（2004）。雌激素与高尔基体之间的双向蛋白转运 Annu Rev Cell Dev Biol 20：87-123。
Momen-Heravi，F.，Balaj，L.，Alian，S.，Mantel，PY，Halleck，AE，Trachtenberg，AJ，Soria，CE，Oquin，S.，Bonebreak，CM，Saracoglu，E.，Skog，J 。和Kuo，WP（2013）。目前分离细胞外囊泡的方法 Biol Chem > 394（10）：1253-1262。
Trajkovic，K.，Jeong，H.和Krainc，D。（2017）。突变型亨廷顿蛋白是通过晚期内体/溶酶体非常规分泌途径分泌的。 J Neurosci 37（37）：9000-9012。
张，M.和Schekman，河（2013）。细胞生物学。非传统的分泌，非传统的解决方案。科学 340（6132）：559-561。