材料和试剂

标准移液器吸头
15毫升和50毫升锥形离心管
尼龙网（孔径80μm，膜解决方案，目录号：MENY090080）
纸巾
Miracloth（Merck，Calbiochem，目录号：475855）
1.5-2.0毫升微量离心管
2ml和1.5ml低保留管（Maxymum回收微管; Corning，Axygen，产品目录号：MCT-200-L-C和MCT-150-L-C）
植物材料：A。表达E的拟南芥植物。在具有与生物素连接酶识别肽（BLRP）融合的感兴趣的基因的强启动子（例如，拟南芥Act8）的控制下的大肠杆菌BirA生物素连接酶（ de Boer等人，2003; Mito et al。，2005）
注：植物可能处于从一周龄幼苗到成年的不同发育阶段，开花前。一般来说，年轻的材料，染色质分离的效率更高。而且，年轻的植物提供用于染色质提取的组织更高的同质性和重复之间的更小的变异。 BirA生物素连接酶可以从不同的启动子表达，但是表达应保持在高水平。其他可能的启动子包括遍在蛋白10启动子（UBQ10）和花椰菜镰孢病毒（CaMV）35S启动子。可诱导的系统，例如地塞米松（DEX） - 可诱导的，也可以使用，然而这在我们的实验室中未被测试。
2M甘氨酸（由甘氨酸制造，Sigma-Aldrich，目录号：33226）
注：此产品已停产。
液氮，冰
1M CaCl 2（由CaCl 2，Sigma-Aldrich制造，目录号：C5670）。
微球菌核酸酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EN0181）
0.5 M EGTA（由EGTA，BioShop制造，目录编号：EGT101）
0.5M EDTA（由EDTA制造，BioShop，目录号：EDT001）
RNase A（Sigma-Aldrich，目录号：R4642）
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EO0491）
3M醋酸钠pH 5.2（由CH 3 COONa，INC Biomedicals Inc.制造）
糖原（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0561）
乙醇（Avantor性能材料，目录号：BA6420113）
琼脂糖（BioShop，目录号：AGA001.1）
基因标记1kb，GR 100bp和GR 100bp加（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号分别为SM0311，SM0241和SM0321）。
Dynabeads M-280抗生蛋白链菌素（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：11206D）
Chelex 100（Bio-Rad Laboratories，目录号：1421253）
Tris（BioShop，目录号：TRS001.5）
1M Tris-HCl pH 8（由Tris制成）
1M Tris-HCl pH 6.8（如上）
乙酸（Avantor高性能材料，目录号：BA8760114）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
苯基甲基磺酰氟（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775-500ML或BioShop，目录号：FOR201）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
Triton X-100（Carl Roth，目录号：3051.3）
β-巯基乙醇（BioShop，目录号：MER002）
精胺（Sigma-Aldrich，目录号：85590-5G）
5M NaCl（由NaCl制成，Avantor Performance Materials，目录号：794121116）
链接是应该被删除
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
苯酚（Sigma-Aldrich，目录号：P4557）
氯仿（Avantor高性能材料，目录号：BA6420113）
异戊醇（Avantor高性能材料，目录号：485560111）
Maxima Sybr Green / ROX qPCR Master Mix（2x）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：K0223）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8465）
1倍的TE缓冲液（见食谱）
1倍TAE缓冲液（见食谱）
交叉缓冲区（见食谱）
本田缓冲区（见食谱）
TNE缓冲液（见食谱）
提取缓冲液（见食谱）
颗粒提取缓冲液（见食谱）
苯酚/氯仿/异戊醇DNA提取（见食谱）
ChIP稀释缓冲液（见食谱）
装订/洗涤缓冲液（见食谱）

设备

移液器（Gilson，型号：Pipetman Neo或PZ HTL，型号：Discovery Comfort）
通风柜
干燥器连接到泵
迫击炮和杵
小漏斗
规模（KERN＆amp; SOHN，目录号：EG 220-3NM）
旋转器（Cole-Parmer，Stuart，型号：SB3）
离心机：
赛默飞世尔科技Thermo Scientific TM型号：Heraeus TM Multifuge TM X1R，产品目录号：75004250
Thermo Fisher Scientific Thermo Scientific TM型号：Heraeus TM Biofuge TM Stratos TM离心机，目录号：75005282
Beckman Coulter型号：Allegra X-30R离心机，目录号：A99471
Eppendorf，型号：MiniSpin ®，产品目录号：0040262
Gilson，模型：CMC实验室CAPSULEFUGE PMC-880
Thermomixer（Eppendorf，型号：Thermomixer comfort，目录编号：5355）
磁性分离器（Thermo Fisher Scientific，型号：DynaMag TM -2，目录号：12321D）
见锯机（Cole-Parmer，Stuart，型号：SSL4）
Thermoblock（Grant Instruments，型号：QBA2）
涡流（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，产品目录号：SI-0256）
用于DNA电泳的系统（Mini-Sub Cell和Wide Mini-Sub Cell GT Complete Systems，Bio-Rad Laboratories，产品目录号分别为1640300和1640301）
实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：7900HT Fast Real-Time PCR System，目录号：4329001）

软件

7900HT快速实时PCR系统软件：SDSv2.4（可在Thermo Scientific网站上获得）

程序

交叉链接
交联共价保留DNA-蛋白质相互作用以用于进一步的制备步骤。然而，过度的固定可能会阻碍后来的蛋白质标签/表位的染色质剪切和识别。使用新鲜的甲醛，因为它的有效浓度会随着时间的推移而下降，特别是暴露在空气和光线下真空用于增加组织穿透。在猝灭步骤中，甘氨酸成为过量甲醛的底物。
1. 收集4克拟南芥叶莲花叶片到50毫升锥形管中。如果植物在干旱处理物质的情况下脱水，则2g的叶子可以获得类似的染色质提取效率。用一小片尼龙网盖住盖子，用螺丝帽盖住管子。
2. 加入37 ml交联缓冲液（见配方）（在通风橱下），室温下真空10 min交联以达到50 mBar的压力。
  交联后，植物组织应该是半透明的
3. 停止交联加入2.5毫升2 M甘氨酸（最终浓度为100毫米），并应用真空渗透额外5分钟。
染色质分离和MNase消化
1. 用无菌去离子水清洗植物组织5次。通过吸干纸巾之间的组织，尽可能地去除水分。这一点很重要，因为冰晶可能会破坏会降低染色质分离效率的细胞核。
  在液氮中迅速冻结组织
2. 使用预先冷却的研钵和研杵将组织彻底研磨成细粉，确保样品在研磨过程中不会解冻。
3. 将植物粉末转移到用液氮预冷却的50ml锥形管中。此时，您可以将材料（限定时间）储存在-80°C。
4. 将每个样品重新悬浮在20毫升冰冷的本田缓冲液中（见食谱）。
5. 短暂涡旋（避免浮动）混合并在冰上孵育30分钟，同时在旋转器上混合以均化样品。
6. 通过两层Miracloth过滤匀浆，挤压Miracloth。
7. 将滤液转移到新的50ml锥形管中，并在摆动转子（Heraeus）中在2000℃，4℃旋转15分钟。
8. 在20毫升本田缓冲液中移液，非常轻柔地重悬沉淀
9. 在4℃下将悬浮液在2000×g下旋转15分钟
10. 重复如上重悬和离心。在管的底部应该形成核白色的软白色颗粒。如果颗粒仍然是绿色，可能需要额外的清洗。
11. 在20毫升不含精胺的本田缓冲液中重悬沉淀
12. 在4℃下将悬浮液旋转2,000 x g。8分钟
13. 在1毫升冰冷的TNE缓冲液中重悬细胞核（参见食谱），并将其分成两个1.5毫升微量离心管。
14. 在4mM CaCl 2（向每个管中加入2μl1M CaCl 2）存在下加入适量的MNase单位（这需要通过实验建立，我们通常在每个试管中加入8-20U）并立即将试管置于预热至37℃的热混合器中。
  在剧烈振荡（1400转/分钟）的条件下孵育20分钟以释放核小体
15. 将试管置于冰上并加入25μl0.5M EGTA（终浓度为25mM），停止反应。
16. 在微量离心机中于14℃旋转14,000×g 5分钟。
17. 保存上清液进一步的步骤，并储存在-178°C（液氮）。您也可以保存颗粒来检查染色质分离和MNase消化（可选步骤[步骤C3]）的效率。
通过DNA分离检测MNase消化效率（尤其在优化MNase浓度时有用）
1. 反向交联和蛋白质消化
  在DNA分离之前，DNA和蛋白质之间的交联需要颠倒。
  1. 取70μl染色质分离物并加入400μl提取缓冲液（见食谱）。
  2. 加入20μL5MNaCl，并在65°C孵育至少4小时至过夜以逆转交联。
  3. 加入10μl的0.5M EDTA，20μl1M Tris-HCl pH6.8,1.7μlRNA酶A（30mg / ml）并在37℃孵育30分钟。
  4. 加入1微升蛋白酶K（20毫克/毫升）孵育1.5小时，在45°C消化蛋白质。
2. DNA沉淀
  1. 加入等体积的（500μl）苯酚/氯仿/异戊醇并短暂涡旋。
  2. 在室温下14,000×g离心5分钟并将上清液转移到2ml Eppendorf管中。
  3. 加入1/10体积的pH5.2的3M乙酸钠，4μl糖原（20mg / ml）和2.5体积的100％EtOH，通过颠倒管混合几次并在-80℃下孵育至少40分钟至沉淀DNA。
  4. 在14,000×g的条件下离心15分钟
  5. 弃去上清，用500μl冷的70％乙醇洗涤沉淀，在4℃下再次离心5分钟。
  6. 弃去上清液并在室温下干燥沉淀。将沉淀溶解在20μl中，并在1.5％琼脂糖凝胶上检查（图1）。您应该主要观察单核细胞DNA片段（大小约150 bp）。您可以将其与从MNase核处理后的沉淀中分离出的DNA进行比较（参见下面的可选步骤[步骤C3]）。
    
    图1.从MNase处理的染色质中分离的DNA。泳道1到4对应不同的样本。不同长度的DNA片段代表单，二和三核苷酸DNA（分别为〜150，〜300和〜450bp）。所需的片段是单核细胞，尽管也应避免过度消化。
3. 可选：在MNase处理后从沉淀中分离DNA
  注意：这个协议可以用来估计沉淀中剩余多少基因组DNA。
  1. 加入400μlPellet提取缓冲液（见配方）
  2. 。在65°C用力混合器搅拌15分钟
  3. 使用200μl的全部提取物（无离心）在65℃孵育过夜，以逆转交联。
  4. 用1μlRNase A（30 mg / ml）37°C孵育30分钟。
  5. 加入1微升蛋白酶K，并在45°C孵育1.5小时。
  6. 向每个样品中加入200μl苯酚/氯仿/异戊醇（在通风橱中）并混合。
  7. 16,000×g离心5分钟。小心转移水层到新鲜的1.5毫升管。
  8. 加入20μL3M NaOAc到每个管，混合。加入550μl无水乙醇，混合并在-80℃下孵育至少40分钟。
  9. 在4℃下以16,000×gg离心15分钟以收集DNA。
  10. 用70％乙醇洗沉淀。
  11. 干燥DNA沉淀并重悬于50μlTE缓冲液中（参见食谱）。在1.5％凝胶上检测10μl以及DNA梯度以估计片段大小（图2）。你应该观察到，大部分单核，双核和三核DNA都存在于上清液中。
    
    图2.染色质MNase消化的验证。泳道1和3含有从上清液中分离的DNA（分别为对照和胁迫植物），泳道2和4含有来自沉淀物的DNA（分别为对照和胁迫植物）。
染色质亲和纯化（链霉亲和素与生物素）
1. 每个样品取25μl的Dynabeads M-280 Streptavidin浆液，放入冰上的Maxymum Recovery（低保留）管中。
2. 每次用1ml冰冷的Binding / Washing Buffer洗涤三次（见食谱）。将磁珠收集在磁选机的管壁上（图3）。
  
  图3.使用磁力分离器分离链霉抗生物素蛋白珠（Dynabeads M-280）。珠附着在Maxymum Recovery管壁的一侧，因此上清液可以很容易地被去除，珠子可以被清洗。
3. 在100μl冷结合/洗涤缓冲液中重悬珠。
4. 将染色质上清液（步骤B17获得）分成140μl（ChAP）和20μl（用于输入）。
5. 用冰冷的ChIP稀释缓冲液（加入1260μlChIP稀释缓冲液）（加入蛋白酶抑制剂，参见食谱）稀释140μl染色质上清液10次。一旦获得更大量的染色质上清液。在微型离心机中以最大速度旋转10分钟，然后转移到具有珠子的管（步骤D3）。
6. 温和旋转（〜15 rpm），在斯图尔特SB3旋转器等旋转器上于4°C孵育过夜。
7. 第二天早上，在跷跷板摇摆器上用冰块清洗珠子。
  5 x 5分钟结合/清洗缓冲液
  2×5分钟TE
8. 在TE中进行最后的清洗之后，在收集珠之前，将样品转移到新鲜的Maxymum回收管中以避免释放结合到管壁的DNA。
9. 将100μl彻底混合的10％Chelex（w / w）加入每个管中的珠子中。加入200μl10％Chelex至20μl输入部分。 Chelex是用于在高温下保护DNA免受降解的螯合树脂（Singer-Sam等人，1989），其在ChIP方法的洗脱步骤中具有证实的功效（Nelson等人， 2005年）。在计算“输入百分比”时，需要用于ChAP或输入的精确体积的染色质和其洗脱液的体积。
10. 将样品在99℃的加热块中煮沸10分钟。
11. 加入1μl蛋白酶K（20 mg / ml）到每个管中，并在43°C孵育1小时。
12. 通过在99℃温育10分钟灭活蛋白酶K.
13. 将样品以最大速度旋转1分钟，并将上清液转移到新的低保留管中。
14. 使用2μl的ChAP，并在qPCR反应中输入洗脱液。

数据分析

在ChAP-qPCR中，每个实验至少应使用三个生物学重复（三个ChAP重复和三个相应的重复输入）。每个生物学重复应在qPCR中重复至少三次技术重复，平均Ct应用于进一步计算。
由于MNase消化产生约150bp长度的DNA片段，所以应设计引物以产生短的扩增子（完全约80bp）。引物的质量对于计算的准确性是绝对关键的。它们应该导致DNA的接近完美的扩增（每个循环中DNA的量应该增加> 1.9倍）。这应该通过使用已知浓度的模板DNA的连续稀释进行qPCR反应来验证。基于这种扩增，应计算标准曲线（图4）。标准曲线的斜率应该不偏离-3.33（完全放大），并且标准曲线的R2应当> 0.985（1.000是一个完美的放大）。为了验证扩增的DNA是否确实是预期的产物（例如，而不是引物二聚体），推荐分析解离曲线。
与ChAP样本一起，需要分析相应的输入样本。在这种情况下，应将稀释度调整到ChAP和输入样品的Ct值相差不超过3个循环的水平。
在成功验证了qPCR运行的原始结果之后，输入百分比（输入百分比）可以如下计算（Lin等人，2012）：

输入的百分比= 100 x 2 <ΔCt

哪里，

ΔCt= Ct <输入> -log <2>（输入稀释因子） - Ct
为了容易地比较来自差异处理植物或甚至不同实验的结果，通常使用归一化到参考区域。原则上，它是一个基因组中的一个区域，其中感兴趣的蛋白质的占用和分布模式不会改变，而不考虑所使用的条件/处理。
注意：这种计算的例子在 excel文件。

图4. SDSv2.4窗口printscreen 在上方面板中，为引物对计算的标准曲线图。斜率和R2参数提示PCR效率（理想扩增的斜率接近于-3.33，R2接近于1.在不同DNA浓度的底部扩增曲线图中，软件自动设置阈值并计算Ct值。

食谱

1x TE缓冲液
10 mM Tris-HCl（pH 8）
1 mM EDTA
1X TAE缓冲区
40 mM Tris
20毫摩尔醋酸
1 mM EDTA
交叉缓冲
0.4 M蔗糖
10 mM Tris-HCl（pH 8）
1 mM EDTA
1毫米PMSF
1％甲醛
注意：在每个实验之前制作新鲜的缓冲液。蔗糖在交联缓冲液中的存在提高了DNA-蛋白质交联的效率。应该在使用缓冲液之前直接加入蛋白酶抑制剂（PMSF）。
本田缓冲区
25 mM Tris-HCl（pH 7.5）
0.44 M蔗糖
10mM MgCl 2 / sup>
0.5％Triton X-100
10 mMβ-巯基乙醇
2毫米精胺
注意：
1. 通过过滤消毒（并在8°C储存）或使用前新鲜。
2. 在使用前加入精胺和β-巯基乙醇（每100毫升70微升）。
3. 最后一次清洗是在没有精胺的情况下进行的。
TNE缓冲区
10 mM Tris-HCl（pH 8.0）
100 mM NaCl
1 mM EDTA
提取缓冲区
0.625％SDS
0.125M NaHCO 3 3
颗粒提取缓冲液
1x TE pH 8.0
100 mM NaCl
2％Triton X-100
1％SDS
苯酚/氯仿/异戊醇DNA提取
25份苯酚（pH 8）
24份氯仿
1份异戊醇
注意：使用前要准备新鲜的，在每次移液之前充分混合。
芯片稀释缓冲液
16.7mM Tris-HCl（pH8）
167 mM NaCl
1.2 mM EDTA
1.1％Triton X-100
1 mM PMSF *
蛋白酶抑制剂鸡尾酒*
装订/清洗缓冲液
20mM Tris-HCl pH8
150 mM NaCl
2 mM EDTA
1％Triton X-100
0.1％SDS
1 mM PMSF *

注意：直接在使用之前添加

致谢

该协议是从先前发表的论文（Sura等人，2017年）开发的，部分基于在别处公布的协议（Saleh等人，2008; Wierzbicki，等人，2008; Zilberman等人，2008）。这项工作得到了国家科学中心赠款（2016/21 / B / NZ2 / 01757到PAZ和2015/17 / N / NZ1 / 00028到WS）和波兰科学和高等教育部拨款（N / N303 / 313437至PAZ，DI / 2011/028641至WS）。作者没有利益冲突或竞争利益申报。

参考

de Boer，E.，Rodriguez，P.，Bonte，E.，Krijgsveld，J.，Katsantoni，E.，Heck，A.，Grosveld，F.and Strouboulis，J.（2003）。哺乳动物细胞和转基因小鼠中标记的转录因子的高效生物素化和单步纯化
Green，M.N。（1975）。抗生物素蛋白。 Protein Protein Chem 29：85-133 。
Lin，X.，Tirichine，L.和Bowler，C。（2012）。
Mito，Y.，Henikoff，J.G。和Henikoff，S。（2005）。组蛋白H3.3替换模式的基因组规模分析 Nat Genet 37（10）：1090-1097。
Nelson，J. D.，Denisenko，O.，Sova，P.和Bomsztyk，K.（2006）。快速染色质免疫沉淀实验 Nucleic Acid Res 34： 1-7。
Saleh，A.，Alvarez-Venegas，R.和Avramova，Z。（2008）。用于研究拟南芥中组蛋白修饰的高效染色质免疫沉淀（ChIP）方案植物。

Nat Protoc 3（6）：1018-1025。
Singer-Sam，J.，Tanguay，R.L。和Rjggs，A.O。（1989）。使用Chelex来改善来自少量细胞的PCR信号。扩增：PCR用户论坛：11.
Sura，W.，Kabza，M.，Karlowski，W. M.，Bieluszewski，T.，Kus-Slowinska，M.，Paweloszek，L.，Sadowski，J。和Ziolkowski，P.A。（2017）。组蛋白变体H2A.Z在应激反应基因转录调控中的双重作用 Plant Cell 29（4）：791-807。
Wierzbicki，A.T.，Haag，J.R。和Pikaard，C.S。（2008）。 RNA聚合酶Pol IVb / Pol V的非编码转录介导重叠和相邻基因的转录沉默。 a> Cell 135（4）：635-648。
Zentner，G.E。和Henikoff，S.（2014）。表观基因组的高分辨率数字分析 Nat Rev Genet
15（12）：814-827。
Zilberman，D.，Coleman-Derr，D.，Ballinger，T.and Henikoff，S。（2008）。组蛋白H2A.Z和DNA甲基化是相互拮抗的染色质标记。 Nature 456（7218）：125-129。