材料和试剂

细菌无细胞提取物制备
1. 1.5 ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690）
2. 电子。（New England Biolabs，目录号：C2527I）
3. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
4. LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3522）
5. 氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
6. 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
7. TYM-5052自动感应介质（Studier，2005）（ForMedium，目录号：AIMLB0205）
8. 无EDTA的玻璃瓶蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：05892953001）
9. 来自鸡蛋白的溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
10. Benzonase核酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：E1014）
11. 氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
12. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
13. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
14. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
15. 磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
16. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：1551139）
17. 盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：435570）
  注：此产品已停产。
18. 磷酸盐缓冲盐水pH 8（PBS pH 8）（见食谱）
免疫共沉淀
1. 1.5 ml微量离心管（SARSTEDT，目录号：72.690）
2. Pierce Anti-HA琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：26181）
3. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
4. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
5. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
6. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
7. 磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
8. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：1551139）
9. Tween 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
10. 十二烷基硫酸钠（SDS）（AppliChem，目录号：A2572）
11. Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
12. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
13. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
14. 溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
15. 盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：435570）
16. 磷酸盐缓冲盐水pH 8（PBS pH 8）（见食谱）
17. 用吐温（PBS-T pH 8）的磷酸盐缓冲盐水pH 8（见食谱）
18. 4x Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液（见食谱）
免疫印迹
1. Immobilon-P膜，PVDF，0.45μm，26.5×3.75m卷（Merck，目录号：IPVH00010）
2. 等级3MM Chr印刷纸张，46 x 57厘米（GE Healthcare，产品目录号：3030-917）
3. X光胶片（VWR，目录号：11299-022）
  制造商：Associated Metals，产品目录号：UPM0810。
4. SeeBlue TM Plus2预染色蛋白标准品（Thermo Fischer Scientific，Invitrogen TM，目录号：LC5925）
5. 考马斯蓝R250（Sigma-Aldrich，目录号：27816）
6. 甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：32213）
7. 在兔子中产生的抗TP血清，山羊抗兔辣根过氧化物酶结合物抗体[GE Healthcare，产品目录号：RPN4301]）。
8. ECL TM印迹试剂（GE Healthcare，目录号：RPN2109）
9. Trizma base（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
10. 用于分子生物学的甘氨酸（AppliChem，目录号：A1067）
11. 十二烷基硫酸钠（SDS）（AppliChem，目录号：A2572）
12. 低脂奶粉（如，雀巢斯维特斯）
13. 丙烯酰胺/ Bis溶液，37.5：1（40％w / v），2.6％C（SERVA电泳，目录号：10681.01）
14. 用于分析的过氧二硫酸铵EMSURE ACS，Reag。 Ph Eur。（APS）（Merck，目录号：1012010500）
15. N，N，N'，N' - 四甲基乙二胺（TEMED）GR用于分析（Merck Millipore，目录号：1107320100）
16. 磷酸盐缓冲盐水pH 7.5（PBS）（见食谱）
17. 用吐温（PBS-T）的磷酸盐缓冲盐水pH7.5（见食谱）
18. 4x Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液（见食谱）
19. 西方电泳缓冲液（见食谱）
20. 阻止解决方案（见食谱）
21. SDS-PAGE运行缓冲液（见食谱）
22. 聚丙烯酰胺凝胶5％浓缩胶和15％运行凝胶（见食谱）
23. 传输缓冲区（请参阅食谱）
  1. 西方传输缓冲区
  2. 标准传输缓冲区
  3. 修改传输缓冲区

设备

50毫升烧瓶（例如VWR，目录号：214-1130）
微量移液器（Gilson，型号：PIPETMAN，产品目录号：F144801，F144600，F144601和F144802）
培养箱用于细菌培养
冷冻离心机（海蒂诗，型号：MIKRO 22R）
紧凑型Thermomixer（Eppendorf，目录号5386000010）
凝胶电泳室（Mini-Protean，Bio-Rad Laboratories，目录号：1658004）
油墨印迹装置（Mini Trans-Blot电泳转移池，Bio-Rad Laboratories，目录号：1703930）
旋转轮
开发者（柯达，型号：X-OMAT 2000处理器）或WB文档系统
放射自显影盒（Amersham Hypercassette）
Sonicator（Sartorius，型号：LABSONIC M）

程序

该方案通过下拉免疫共沉淀分析两种DNA结合蛋白之间的直接相互作用（图1）。在这个协议中，来自噬菌体Bam35的P1蛋白之一在E中过表达。将其作为HA标记的重组蛋白并与HA亲和树脂结合。使用具有HA基序的Nt-或Ct-标记的P1（分别为HA-P1和P1-HA）以及空质粒作为阴性对照进行三种不同的IP。
在洗涤步骤之后，推定的配偶体蛋白B35TP与结合到树脂上的P1一起温育。这也可以使用两种提取物或两种纯化的蛋白来完成。我们建议不要在第二步中使用细胞提取物，以避免第三种蛋白与HA标记的重组蛋白介导的相互作用导致的假阳性。

图1.共免疫沉淀过程的流程图

细菌无细胞提取物制备（图1A）
1. 接种 E的初学者文化。从具有150μg/ ml氨苄青霉素和40mM葡萄糖的10ml LB中的-80℃甘油储液中获得含有相应表达载体或空质粒（作为减少假阳性的对照）的大肠杆菌BL21（DE3）在50毫升烧瓶中。在37℃，200rpm下过夜生长。不同的表达载体可能需要不同的抗生素。
2. 在10毫升添加有150微克/毫升氨苄青霉素的新鲜TYM-5052培养基中稀释饱和的培养物1：100，并在30毫升的50毫升烧瓶中孵育16小时。这个步骤可能需要优化每个特定的重组蛋白。
3. 通过在4℃下20,000xg离心1分钟来收获细菌细胞。如果需要，粒状细胞可以储存在-80°C。
4. 重悬沉淀在450μL的无菌PBS pH值8（见食谱）补充蛋白酶抑制剂。
  注意：
  1. 由于许多DNA结合蛋白的等电点很高，所以使用pH值为8的PBS，在B35TP的情况下，其强烈影响其体外的稳定性和功能（Berjón-Otero等，2016）。这可能需要针对每种蛋白质进行优化。
  2. 蛋白酶抑制剂片剂可根据制造商的说明书直接添加到缓冲液中。然而，由于我们倾向于准备少量的每种缓冲液，所以我们在PBS缓冲液（保持在-80℃）下制备了5×储备液，并在使用前稀释至1倍。
5. 加入50微升溶菌酶10毫克/毫升，在冰上孵育20分钟。
6. 通过超声破碎细胞。
  1. 设置超声波振幅为18μ。
  2. 超声波在冰上的细菌悬液2-5秒。
  3. 保持在冰上15-30秒，以避免过热的样本。
  4. 重复6-8次步骤A6b和A6c
7. 加入1.5μl的benzonase和2.5μl的500mM MgCl 2并在室温下孵育30分钟。加入1.5μl500 mM EDTA终止反应。
  注意：这一步对于排除DNA结合蛋白之间的DNA介导的间接相互作用至关重要。
8. 20000×g离心10分钟，4°C沉淀细胞碎片。
9. 将含有无细胞蛋白提取物的上清液转移到新的1.5ml微量离心管中。我们建议在同一天进行免疫沉淀。
免疫共沉淀
1. 在细菌中表达的诱饵蛋白的免疫沉淀
  准备所需的管，加入50微升的抗HA琼脂糖1.5毫升微量离心管。在这种情况下，我们使用三个管来表达HA-P1和P1-HA的细菌提取物和阴性对照。
  1. 在4℃以12,000×gg离心10-20秒，弃去上清液。
  2. 用一种树脂体积的pH8的PBS清洗树脂两次，并补充完整的蛋白酶抑制剂。
  3. 在4℃以12,000×gg离心10-20秒，弃去上清液。
  4. 将来自程序A的无菌细胞提取物添加到树脂中。
    在4°C下将混合物在转轮上孵育18小时
  5. 在4℃短暂旋转（10-20秒，12,000×g克）并保持上清液用于结合效率的分析。用于分析的样品可以储存在冰上或-20°C较长时间。
  6. 用旋转的转轮在4℃下用10倍体积的PBS-T pH8（见配方）清洗树脂5分钟。在4℃短暂旋转（10-20秒，12,000×g克）并重复三次。保留三个清洗步骤的上清液进行分析。
2. 推定共免疫沉淀推定相互作用的蛋白质
  1. 在500μlPBS-T中加入2μg纯化的推定的配偶体蛋白质和30μg牛血清白蛋白的混合物到树脂中，并在旋转的轮上在4℃孵育2小时。我们使用纯化的B35TP作为合作伙伴蛋白，按照Berjón-Otero等人2016年的描述进行纯化和定量。
  2. 像以前一样清洗树脂（步骤B1f-B1g）。
    注意：建议在最后一次清洗步骤之前将树脂转移到新的管中，以丢弃可能保留在塑料上的蛋白质。
  3. 用50μl1x Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液洗脱结合的蛋白质（见食谱）。
    注意：根据生产商的说明，免疫沉淀蛋白通常可以用0.1M甘氨酸pH 2.0-2.8的洗脱液进行下游操作。
Western blotting
1. 加入4微升4×Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液到10微升的结合和洗涤样品。
2. 将所有样品（包括洗脱样品）加热至95-100℃3分钟，并短暂旋转（10万秒×10000）。
3. 将样品加载到SDS-PAGE凝胶（5μl洗脱样品和全部结合和洗涤样品）上并加载6μleBlue TM Plus2预染色的蛋白质标准物以测定分子量。 br />
4. 恒定电压150伏电泳1小时注意：凝胶可以在考马斯亮蓝溶液中孵育1小时，在脱色溶液中孵育1小时而不是/除了蛋白质印迹之外，染色。对于染色方案，见He（2011）。
5. 使用转移缓冲液（参见配方）和3MM Chr等级印刷纸（在4°C恒定100V 90分钟）转移到PVDF膜上。
  注意：
  1. 在这种情况下，由于蛋白质的等电点很高，使用了含有0.025％SDS和不含甲醇的修饰转移缓冲液（参见食谱和图2）。
  2. 为了改善转印结果，强烈建议在相应的转印缓冲液（室温下5分钟）中平衡凝胶和膜。
    
    图2.WB转移缓冲液对B35TP检测的影响通过15％SDS-PAGE分离增加量的B35TP，并且在标准转移缓冲液（参见配方）中或在修饰中湿转移40分钟转移缓冲区（参见食谱）。可检测的蛋白质量的范围可能需要优化。 WB如文中所述进行，检测后（下图）PVDF膜用考马斯蓝溶液染色（上图）。
6. 用PBS洗膜20秒。
7. 将膜在100％甲醇中孵育20秒，并在室温下干燥。
8. 在20ml封闭液中孵育膜（见食谱）在室温下30分钟或在4℃下过夜。
9. 用10 ml抗体稀释缓冲液孵育膜的一抗（浓度取决于抗体），在室温下温和搅拌1小时。
10. 每次用20毫升的PBS-T洗涤三次，每次10分钟。
11. 用10 ml抗体稀释缓冲液孵育二抗（浓度取决于抗体），在室温下温和搅拌1小时。
12. 用20毫升PBS-T洗5次，每次5分钟
13. 用2ml ECL TM印迹试剂在RT孵育膜1分钟。
14. 排出过量显影液的膜，包上保鲜膜并暴露在X光胶片上。

数据分析

来自每个步骤的样品应该通过SDS-PAGE，然后考马斯染色和/或WB进行分析。

食谱

注：除非另有说明，否则所有溶液均可在室温下保存数月。

磷酸盐缓冲盐水，pH 7.5 / 8（PBS pH 7.5 / 8）

在800ml dH 2 O中混合，用HCl调节pH至7.5（或pH 8），然后调节体积至1L。
用吐温（PBS-T pH 7.5 / 8）pH7.5 / 8的磷酸盐缓冲盐水

在800ml dH 2 O中混合，用HCl调节pH至7.5（或pH 8），然后调节体积至1L。
4倍Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液

在4ml dH 2 O中混合，然后调节体积到5ml
Western印迹电泳缓冲液
阻塞解决方案（使用新鲜的）
1克低脂奶粉
在80毫升PBS-T中混合，调整体积至100毫升
SDS-PAGE运行缓冲液

在800毫升dH 2 O 0中混合，将体积调节至1升
聚丙烯酰胺凝胶含5％浓缩凝胶和15％运行凝胶
转移缓冲液（1升量）

在800毫升dH 2 O 0中混合，将体积调节至1升

致谢

该协议描述了原始论文中使用的方法（Berjón-Otero等人，2017）。这项工作是由西班牙经济和竞争力部[BFU2014-52656P至M.S.]和ComFuturo格兰特基金会总会CSIC [NewPols4Biotech至M.R-R]支持的。 M.B-O。和A.L.分别持有西班牙经济和竞争力与教育部门的FPD奖学金（BES-2012-052228）和FPU（15/05797）。拉蒙生物资源中心分子生物学研究中心的机构资助也得到了承认。作者没有任何利益冲突或竞争利益的申报

参考

Berjón-Otero，M.，Lechuga，A.，Mehla，J.，Uetz，P.，Salas，M.和Redrejo-Rodriguez，M.（2017）。 Bam35病毒内病毒相互作用图揭示了噬菌体ORFan蛋白的新功能和定位。 > J Virol 。
Berjón-Otero，M.，Villar，L.，Salas，M.和Redrejo-Rodriguez，M.（2016）。披露革兰氏阳性病毒Bam35蛋白质引发的基因组复制的早期步骤。
核酸研究44（20）：9733-9744
他，楼（2011年）。考马斯亮蓝染色 Bio Protoc e78。
Studier，F. W.（2005）。高密度摇瓶培养中的自动诱导蛋白质生产 Protein Expr Purif 41（1）：207-234。