材料和试剂

耗材
1. 推针或注射器针
2. 移液器吸头（Neptune Scientific，产品目录号：BT10F，BT100，BT1250）
3. 14ml锥形管（Corning，Falcon ，目录号：352059）
4. 1.6 ml离心管（Neptune Scientific，目录号：4445.S.）
5. 3MM纸（GE Healthcare，目录号：3030-861）
6. 6孔板（Nest Biotechnology，目录号：703001）
7. 细胞过滤器，70微米（Southern Labware，目录号：C4070）
8. PVDF膜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：88518）
9. 蛋白质印迹膜（Next Day Science，目录号：A8803）
10. 硝酸纤维素膜（GE Healthcare，目录号：10600002）
生物试剂
1. 雌性6-8周龄的C57BL / 6小鼠（Taconic Biosciences，目录号：B6NTac）
化学试剂
1. 台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：15250061）
2. 无血清培养基（Corning，Mediatech，目录号：40-101-CV）
3. 甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：32213）
4. 1M HEPES pH7.0（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
5. 1M Tris-HCl pH 7.5（Quality Biological，目录号：351-006-101）
6. 5M NaCl（Quality Biological，目录号：351-036-101）
7. 10％SDS（Quality Biological，目录号：351-032-101）
8. 脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
9. Nonidet P40（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：11754599001）
10. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
11. 氟化钠（NaF）（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）
12. 苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
13. 碘乙酰PEG-生物素（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：21334）
14. 二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）（Sigma-Aldrich，目录号：D6518）
15. 过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C30）
16. 蛋白酶抑制剂片（Roche Diagnostics，目录号：5056489001）
17. 抗氧化的PTP活性位点mAb（R＆amp; D Systems，目录号：MAB2844）
18. 抗SHP-1抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-287）
19. 山羊抗小鼠IgG HRP（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2302）
20. 小鼠抗兔IgG HRP（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2357）
21. GammaBind G Sepharose（GE Healthcare，目录号：17088501）
22. SDS蛋白凝胶上样溶液（Quality Biological，目录号：351-082-661）
23. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
24. Tris-甘氨酸转移缓冲液（25x）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：LC3675）
25. Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液（10x）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：LC2675）
26. Novex TM楔形10％Tris-甘氨酸凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：XP00100）
27. 脱脂奶粉（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2325）
28. 链霉亲和素-HRP（GE Healthcare，目录号：RPN1231-2ML）
29. SuperSignal TM West Pico化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，目录号：34080）
30. 吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P7949）
31. EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：03777）
32. β-甘油磷酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：G6501）
33. N-乙基马来酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：E3876）
34. （2％）（Sigma-Aldrich，目录号：88597）。
35. 原钒酸钠（Na 3 VO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：450243）
36. 碘乙酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：I1149）
37. 氧化裂解缓冲液（见方法1）
38. 氧化清洗缓冲液（见配方2）
39. TBST缓冲液（见方法3）
40. 1 mM pervanadate（见配方4）
41. 裂解缓冲液（见方法5）

设备

VANTAGE斜视剪（Steeles，型号：V95-312）
镊子（Polysciences，型号：5 Dumont INOX）
移液器（Gilson，型号：P10，P100，P1000;目录号：F144802，F123615，F123602）
粘土亚当斯Nutator搅拌机（BD，型号：421105）
微型槽罐转运单元（GE Healthcare，目录号：TE22）
X细胞SureLock TM迷你细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：EI0001）。
血细胞计数器（Daigger Scientific，目录号：EF16034F）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell TM 150）
平台摇床（Heidolph，型号：Unimax 1010，目录号：036130180）
离心机（Eppendorf，型号：5418，目录号：5401000137）
耐化学腐蚀真空泵（Southern Labware，型号：400型）
用于14ml管的台式离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM Legend TM XTR）
胶片开发商（柯达，型号：柯达X-OMAT 2000处理器）

软件

MultiGauge（富士软件）
GraphPad Prism（GraphPad软件）

程序

胸腺细胞的分离
1. 根据批准的IACUC协议安乐死鼠标。
2. 用剪刀和镊子从小鼠中分离胸腺（见图1）
  
  图1.去除安乐死小鼠的胸腺。用推针或注射器针将鼠标四肢固定在切割板上。用剪刀从颈部到骨盆中线小心切开皮肤。在中线的顶部和底部做皮肤短侧切，并将皮瓣固定在砧板上。 A.用钳子抓住xyphoid（黄色箭头）并轻轻抬起，然后用剪刀剪下胸骨中线，折回胸廓以暴露胸腺（B，蓝色箭头）。一方面用镊子轻轻地提起胸腺，另一方面用镊子轻轻地取笑，从周围组织中取出胸腺。 C.从胸腔中摘除胸腺（注2）。
3. 将胸腺转移到装有1ml脱气的无血清培养基的6孔板的一个孔中（见注1），然后用剪刀将胸腺切成几个小部分。
4. 。用镊子轻轻压缩细胞过滤器中的胸腺碎片，从基质释放胸腺细胞。
5. 加入9毫升脱气的无血清培养基
6. 过滤胸腔细胞悬液（1000微升移液器）通过细胞过滤器到14毫升管。
7. 在1000×g，4℃下离心1分钟
8. 取出上清液并用10ml脱气的无血清培养基在冰上重悬沉淀。
还原（催化活性）SHP-1的检测
1. 使用血细胞计数器和台盼蓝溶液来枚举胸腺细胞。每个胸腺细胞的预期数目是0.5-1×10 8。
2. 将1×10 7个细胞放入14ml锥形管中并在1000℃，4℃下离心1分钟。
3. 弃去上清，并在冰上重新悬浮在0.5ml脱气氧化裂解缓冲液（配方1，注1）中。转移到1.6毫升的微量离心管中。
  使用不含IAP-生物素的脱气氧化裂解缓冲液作为对照
4. 涡旋15秒。
5. 在冰上孵育裂解液20分钟
6. 在12,000×g，4℃下离心10分钟
7. 将上清液转移到1.6 ml微量离心管中，并加入0.5 ml脱气氧化裂解液。
8. 添加5微升（1微克）抗SHP-1 Ab，并在4°C的nutator孵育过夜。
9. 加入20μl脱气氧化洗涤缓冲液（配方2）平衡的GammaBind G-琼脂糖，并在4°C在nutator孵育1小时。
10. 加入1ml脱气的氧化缓冲液，吸取分散琼脂糖凝胶，然后在1000gxg下离心1分钟。通过抽吸去除缓冲液。重复三次。
11. 加入30μl含有5％2-巯基乙醇的SDS蛋白凝胶上样溶液
12. 将样品煮沸5分钟并加载到10％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶的一条泳道上。
13. 在100 V下运行凝胶3 h，然后通过电印迹转移到PVDF膜上注意：PVDF膜在10ml甲醇中浸泡5分钟，然后在15ml转移缓冲液中浸泡5分钟，然后进行电转印。
14. 在平台振荡器上，在室温下用TBST缓冲液（配方3）中的5％脱脂奶粉封闭PVDF膜1小时。
15. 在室温下，在5 ml TBST缓冲液中以1:5,000稀释度加入链霉抗生物素蛋白-HRP 4小时
16. 在15毫升的TBST缓冲液中室温下3×10分钟
17. 加入2ml SuperSignal West Pico化学发光显影液并孵育5分钟。
18. 倒掉开发中的解决方案。
19. 在暗室中，将X光胶片放在包裹的膜上。
20. 暴露1分钟（见注2）。开发电影。
用过钒酸盐或H 2 O 2 O 2刺激后SHP-1氧化的分析。
1. 如上所述枚举胸腺细胞。
2. 将1×10 7个细胞放入14ml锥形管中并在1000℃，4℃下离心1分钟。
3. 弃去上清，加入0.1ml脱气的无血清培养基，反复吹打轻轻悬浮细胞。
4. 在室温下加入0.1ml 2x过钒酸盐（方案4）10分钟或0.1ml 2x H 2 O 2（2-20mM）5分钟。 /> 注：3％（w / v）H 2 0 2 > 是880mM。 H的最佳终浓度 2 2 2 并且需要为每种细胞类型建立过钒酸盐，并将取决于所需的PTP氧化程度。最初的实验应该测试一系列的浓度。建议的范围：10-200μM的Pervanadate（终浓度）; H 2 0 2 ：0.1-10 mM（终浓度）。细胞也用相同数量的载体溶液处理而不用H 2 / em> 2 2 2 > 或者pervanadate作为阴性对照。
5. 在室温下1000×g离心1分钟停止。
6. 弃去上清，用脱气的1x PBS洗一次沉淀。
7. 用0.5ml脱气的裂解缓冲液重悬（方案5）。
8. 在冰上孵育裂解物20分钟
9. 在12,000×g，4℃下离心10分钟
10. 取上清液，转移到1.6 ml微量离心管中，加入0.5 ml脱气裂解液。
11. 加入5微升（1微克）的抗SHP-1抗体，并在4摄氏度的nutator孵育过夜。
12. 加入20μl脱气的裂解缓冲液平衡的GammaBind G-琼脂糖，并在4摄氏度在nutator中孵育1小时。
13. 通过造粒洗涤（1000×g离心1分钟），抽吸，并用1ml脱气的裂解缓冲液重新悬浮三次。
14. 加入30μl含有5％2-巯基乙醇的SDS蛋白凝胶上样溶液
15. 将样品煮沸5分钟，并将每个样品加样到10％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶中。
16. 在100 V下运行凝胶3 h，然后通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上
17. 在平台振荡器上，用硝酸纤维素膜和10毫升含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液在室温下封闭1小时。
18. 在室温下用5 ml TBST缓冲液与抗氧化PTP活性位点Ab孵育4 h。
  倒掉抗体溶液。
  注意：抗氧化的PTP活性位点抗体检测到保守的PTP活性位点，其催化的半胱氨酸残基被氧化成磺酸形式（Persson et al。，2004）。
19. 在室温下用10毫升TBST洗两次
20. 在室温下，在5ml TBST缓冲液中以1：2,000稀释度添加山羊抗小鼠IgG HRP 1小时。
21. 倒掉二抗溶液。
22. 在室温下用15毫升TBST缓冲液洗3次10分钟。
23. 加入2 ml SuperSignal West Pico化学发光显影液，孵育5分钟。
24. 倒掉开发中的解决方案。
25. 在暗室里，把X光胶片放在包裹膜上。
26. 暴露1分钟（见注2）。开发电影。
27. 见图2和图3
  
  图2.胸腺细胞中还原（活性）SHP-1的分析。来自野生型（Themis + / + WT;或Themis（ - / - ）（KO）小鼠的总胸腺细胞的抗SHP-1免疫沉淀物的免疫印迹分析用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素标记减少的活性PTP活性位点半胱氨酸后。用链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶（SA-HRP）探测印迹以检测生物素化蛋白质。通过密度测定法定量减少的SHP-1。
  在每个实验中，将数值标准化为总SHP-1条带密度
  
  图3.用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理刺激后的SHP-1氧化 SHP-1的活性位点氧化的免疫印迹分析在用不同浓度的过钒酸盐（PV）（A）或H 2 O 2（B）处理的总胸腺细胞中。分析用抗SHP1免疫沉淀的蛋白质，并用对PTP的保守活性位点半胱氨酸的磺酸（SO 3 H）形式特异性的抗体探测印迹，以检测SHP1的不可逆氧化。

数据分析

为了定量带的密度，我们使用了MultiGauge（Fujifilm软件）。进行至少三次，优选4-6次独立实验用于统计分析。为了统计分析，我们使用了GraphPad Prism（GraphPad软件）。通常情况下，我们提供了一个代表性的印迹，用于在论文的主体统计分析和补充部分提供所有额外的印迹用于统计分析。由于条带密度被归一化为控制条带（例如总共SHP-1印迹），所有的数据应该是可用的并且包括在内，除非存在特定凝胶或印迹的技术问题。控制总蛋白质条带的标准化被认为是必要的，尤其是如果统计分析中包括单独的印迹。我们也发现凝胶（第一个和最后一个）上的边缘泳道可能是有问题的，所以我们尽量避免使用这两条泳道作为关键样本。参见Choi et al。（2017）对这些实验公布的数据的一个例子。

笔记

所有的溶液和培养基都应该用膜真空泵（37 L / min）脱气1小时，然后储存在冰上。
每种抗体的曝光时间会有所不同

食谱

氧化裂解缓冲液
50 mM Tris（pH 7.5）
100 mM NaCl
0.1％SDS
0.5％脱氧胆酸钠
0.5％Nonidet P-40
0.5％Triton X-100
50 mM NaF
1毫米PMSF
0.4 mM碘乙酰PEG-生物素
100μMDTPA
200 U / ml过氧化氢酶
每50毫升1片蛋白酶抑制剂
氧化清洗缓冲液
50 mM Tris（pH 7.5）
100 mM NaCl
0.5％Nonidet P-40
0.5％Triton X-100
50 mM NaF
TBST缓冲区
20 mM Tris（pH 7.5）
135 mM NaCl
0.05％吐温20
1 mM pervanadate
1mM Na 3 VO 4 4 5mM H 2 O 2：2 注意：使用前在室温下保温5分钟。
裂解缓冲液
1％Nonidet P-40
10 mM Tris（pH 7.5）
150 mM NaCl
2 mM EGTA
50毫克β-甘油磷酸酯
2 mM Na 3 VO 4 4 10 mM NaF
10 mM碘乙酰胺
10毫米NEM
每50毫升1片蛋白酶抑制剂

致谢

国立儿童健康与人类发展研究所（EIA）的Eunice Kennedy Shriver室内研究计划（1ZIAHD001803至P.E.L.）支持这项工作。该方案已经改编自Choi em等人（2017）Nature Immunology 18,433-441。作者与本出版物没有利益冲突或利益冲突。

参考

Choi，S.，Warzecha，C.，Zvezdova，E.，Lee，J.，Argenty，J.，Lesourne，R.，Aravind，L.和Love，P.E。（2017）。 THEMIS增强TCR信号传导，并通过选择性抑制磷酸酶SHP-1实现阳性选择。 Nat Immunol 18（4）：433-441。
Huyer，G.，Liu，S.，Kelly，J.，Moffat，J.，Payette，P.，Kennedy，B.，Tsaprailis，G.，Gresser，M.J。和Ramachandran，C。（1997）。钒酸盐和过钒酸盐抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的机制 J Biol Chem 272：843-51。
Karisch，R.和Neel，B. G.（2013）。监测经典蛋白酪氨酸磷酸酶氧化的方法 FEBS J 280（2）：459-475。
Persson，C.，Sjoblom，T.，Groen，A.，Kappert，K.，Engstrom，U.，Hellman，U.，Heldin，C.H.，den Hertog，J.and Ostman，A。（2004）。氧化蛋白抗体所揭示的受体样PTP-α的第二磷酸酶结构域的优先氧化酪氨酸磷酸酶

美国国家科学院院刊 101（7）：1886-1891。
Rudyk，O.和Eaton，P。（2014）。在生物系统中监测蛋白质巯基氧化还原状态的生化方法 Redox Biol 2：803-813。
Weibrecht，I.，Bohmer，S.A。，Dagnell，M.，Kappert，K.，Ostman，A。和Bohmer，F.D。（2007）。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2催化半胱氨酸的氧化敏感性 Free Radic Biol Med 43（1）：100-110。