材料和试剂

移液器吸头（Corning，Axygen ，目录号：T-200-Y-STK，T-300-L-R，T-1000-B）
15毫升培养管（博美，目录号：SGJS15ML）
平底96孔微量滴定板（Corning，目录号：3628）
盖帽（CITOTEST LABWARE MANUFACTURING，产品目录编号：80340-1130）
细菌菌株（鉴定和存储在我们的实验室）
1. 诉alginolyticus 178
2. 诉anguillarum
3. 诉灿烂的
4. 诉创伤
5. 铜绿假单胞菌
6. P上。 stutzeri
7. 金黄色葡萄球菌
8. 芽孢杆菌属176
9. B中。 subtilis
甲醇（国药集团化学试剂，目录号：10014108）
乙醇（国药集团化学试剂，产品目录号：10009259）
蛋白胨（Solarbio，目录号：P8450）
胰蛋白胨（OXOID，目录号：LP0042）
酵母提取物（OXOID，目录号：LP0021）
琼脂粉（Solarbio，目录号：A8190）
氯化钠（NaCl）（国药集团化学试剂，目录号：10019318）
结晶紫（国药集团化学试剂，目录号：71012314）
冰醋酸（国药集团化学试剂，目录号：10000218）
明胶（Solarbio，目录号：G8060）
25％戊二醛溶液（国药集团化学试剂，产品目录号：30092436）
二甲基亚砜（DMSO）（MP Biomedicals，目录号：02196055）
盐水LB肉汤（见食谱）
LB肉汤（见食谱）
1％（w / v）结晶紫溶液（见食谱）
30％（v / v）乙酸（见配方）
改良2216E肉汤（见食谱）
1％（w / v）明胶溶液（见食谱）
5％戊二醛溶液（见食谱）
无菌生理盐水（见食谱）
10毫克/毫升CLPs（见食谱）

设备

1-10微升移液器（Gilson，型号：P10N）
20-200μl移液器（Gilson，型号：P200N）
100-1,000μl移液器（Gilson，型号：P1000N）
高压灭菌器（Zealway仪器，型号：GI80TW）
恒温摇床（CRYSTAL，型号：IS-RDS3）
离心机（Eppendorf，型号：5418 R）
SYNERGY-H1酶标仪（BioTek Instruments，型号：Synergy H1）
扫描电子显微镜（SEM）（日立，型号：S-3400N）
透射电子显微镜（TEM）（日立，型号：H-7650）
生物安全柜（Heal Force，型号：HFsafe 900LC）

程序

细菌菌株培养
1. 在这个协议中使用的细菌菌株的单菌落，包括溶藻弧菌（V. alginolyticus）178， anguillarum ， V。灿烂的， V。创伤弧菌，铜绿假单胞菌， p。 stutzeri ， Staphylococcus aureus ， Bacillus sp。 176和。从他们纯粹的培养皿中选择了枯草芽孢杆菌（subtilis）。
2. 诉溶藻弧菌178，鳗弧菌V.vir。，金黄色葡萄球菌（V. vulnificus），铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），金黄色葡萄球菌stutzeri 和 Bacillus sp。 176在含有Luria-Bertani（LB）的5毫升生理盐水（LB）肉汤培养基（见配方）中于28℃培养过夜，摇动速度为170转/分。
3. 金黄色葡萄球菌和 B。枯草芽孢杆菌在5ml LB培养基中于37℃在管中振荡培养过夜，在170rpm下振荡。
溶藻弧菌178在培养管中的聚集测定
1. 过夜培养后，稀释 V的细胞悬液。
  用生理盐水LB肉汤以1：100溶解溶藻弧菌178
2. 准备六个无菌15毫升培养管。
3. 每个管中加入3毫升细菌悬液
4. 用终浓度为300μg/ ml或相同体积DMSO的90μl（10 mg / ml）CLPs分别处理细胞，匀浆后在28℃静置培养24 h（图1A）。
  
  图1. V的实验设计A.溶藻弧菌在培养管和96孔板中的聚集A.在CLPs处理后在培养管中观察到溶藻弧菌178。 B.使用96孔板进行聚集测定的步骤的示意图（1号孔含有未经处理的溶藻弧菌178号; 2号孔含有经溶藻弧菌处理的溶藻弧菌） > 178）。
V的聚集测定。在96孔微量滴定板中溶藻弧菌178
1. 加入200μl稀释的细菌悬液到平底96孔微量滴定板的每个孔中
2. 在实验组中，每孔加入终浓度为300μg/ ml的6μlCLPs（10 mg / ml），并与细菌悬液均质化。
3. 包含 V的井。采用未经处理的溶藻弧菌178细胞悬液或用DMSO处理，作为对照。
4. 每个处理5个重复孔，并在28°C孵育24小时。
5. 孵育后，用移液器小心丢弃浮游细胞，并用无菌生理盐水洗涤每个孔中的聚集细胞三次。
6. 用200μl甲醇（99％纯度）固定聚集的细胞，静置15分钟，用移液器清空培养板，放置干燥。
7. 然后在室温下用200μl1％（w / v）结晶紫（见配方）溶液染色孔内容物10分钟。
8. 用移液器冲洗结晶紫;用无菌去离子水冲洗后，用200μl30％（v / v）醋酸溶液（参见食谱）溶解后将板上的染料再溶解于聚集的细胞中。
9. 用SYNERGY-H1酶标仪（BioTek，USA）在595 nm处使用30％乙酸作为空白（图1B），测量每个孔的吸光度。
CLPs活性的定量测定
1. 加入200μl稀释的细菌悬液到平底96孔微量滴定板的每个孔中
2. 分别加入不同浓度（25,50,100,200,300μg/ ml）的6μlCLPs到不同的孔中。
3. 包含 V的井。使用溶藻弧菌178不经处理的细胞悬浮液或用DMSO处理作为对照。
4. 按照上述步骤C4-C9（图2）所述操作其他程序。
  
  图2.不同浓度CLPs的定量细胞聚集分析
扫描电镜观察
1. 稀释过夜的培养细胞的V。溶于1ml / ml的溶藻弧菌178溶于5ml新鲜的改良的2216E培养基中（参见食谱），并以170rpm振荡培养另外3小时至OD 600-6.2-0.3。
2. 添加50μl50或100μg/ ml CLPs或DMSO的细胞悬液3小时。
3. 在室温下将细胞在1,400×g下离心4分钟，并用无菌盐水溶液重悬细胞。
4. 将重新悬浮的细菌细胞分别放在灭菌的盖玻片上（用1％凝胶溶液包封，参见食谱）。
5. 在室温下干燥盖玻片。
6. 用5％戊二醛溶液固定样品（见食谱）1小时。
7. 用无菌生理盐水冲洗（见食谱）。
8. 在连续分级乙醇系列（50％，60％，70％，80％，90％和100％乙醇）中脱水样品。在每个等级的乙醇溶液中孵育样品10分钟。最后在100％乙醇中孵育后，样品准备在扫描电子显微镜下观察。
  注意：当样品放入80％乙醇中时，您可以停止。
9. 在扫描电子显微镜下观察样品（图3）。
  
  图3. V的SEM图像。用CLPs处理后的溶藻弧菌178细胞。（A），用DMSO处理（B），用50μg/ ml CLPs（C）和用100μg/ ml CLP处理（D）处理溶藻弧菌178细胞形态。
透射电镜观察
1. 执行上述步骤E1-E3中的步骤。
2. 用5％戊二醛溶液固定样品1小时。
3. 将样品放在铜网上，并在室温下干燥。
4. 透射电镜下观察样品（图4）。
  
  图4. V的TEM图像。用CLPs处理后的溶藻弧菌178细胞。诉（A），用DMSO处理（B），用50μg/ ml CLPs（C）和用100μg/ ml CLP处理（D）处理溶藻弧菌178细胞形态。比例尺是2微米。
CLP的行动范围
1. 过夜培养后，稀释 V的细胞悬液。 anguillarum ， V。灿烂的， V。创伤弧菌，铜绿假单胞菌， p。 Stutzeri ， Staphylococcus aureus ， 176和。用1％盐水LB肉汤或LB肉汤分别加入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
2. 按照上述步骤C2-C9（图5）操作其他程序。
  
  图5. CLPs的作用谱分析。空白：未处理的菌株; CLPs：CLPs治疗的菌株。

数据分析

所有数据均由社会科学统计软件包（SPSS）18.0软件进行分析。使用单因素方差分析（one-way ANOVA），然后进行事后多重比较（Tukey's）检验，计算组间统计学显着性差异。

笔记

为避免其他细菌污染，微生物操作必须在无菌条件下进行。
所有的细菌培养基和试剂溶液都必须新鲜制备，并通过高压灭菌来灭菌。
在孵化之前，需要用CLPs匀浆细胞悬液
请注意，丢弃浮游细胞和用移液器清洗聚集细胞的操作必须小心谨慎。

食谱

盐水LB肉汤（1升）
10克蛋白胨
5克酵母提取物
1升过滤海水
pH 7.4-7.6

在121°C高压灭菌20分钟，然后储存在4°C
LB肉汤（1升）
10克蛋白胨
10克NaCl
5克酵母提取物
1升去离子水
pH 7.4-7.6

在121°C高压灭菌20分钟，然后储存在4°C
1％（w / v）结晶紫溶液（100 ml）
1克结晶紫
100毫升无菌水
30％（v / v）乙酸（100ml）
30毫升冰醋酸
70毫升无菌水
改性2216E肉汤（1升）
5克胰蛋白胨
1克酵母提取物
1升过滤海水
pH 7.4-7.6

在121°C高压灭菌20分钟，然后储存在4°C
1％（w / v）明胶溶液（10毫升）
0.1克明胶
10毫升去离子水

在121°C高压灭菌20分钟，然后储存在4°C
5％戊二醛溶液（10毫升）
2毫升25％戊二醛溶液
8毫升无菌水
无菌生理盐水（100毫升）
0.85克NaCl 100毫升去离子水

在121°C高压灭菌20分钟，然后储存在4°C
10毫克/毫升CLPs（1毫升）
10毫克CLPs
1毫升DMSO

致谢

这项工作得到了山东省自然科学优秀青年基金（JQ201607），山东省泰山学者基金，青岛海洋科学与技术国家实验室（2015ASAS）支持的“奥山人才计划”，“百人计划”中国科学院向孙敬民和中国科学院战略重点研究项目（XDA11030201）致张德超。我们也非常感谢来自德黑兰医科大学的Nasrin Samadi教授和Dina Dalili教授的研究方法“Isolation and structural characterization of Coryxin，a novel cyclic lipopeptide from from Corynebacterium xerosis NS5 having emulsification and anti生物膜活性“。作者声明他们没有竞争利益。

参考

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