材料和试剂

1.5 ml和2.0 ml微量离心管（Tarson，目录号：500010和500020）
移液器吸头（10μl）（Tarson，目录号：521000）
移液器吸头（200μl）（Tarson，目录号：521010）
移液器吸头（1,000μl）（Tarson，目录号：521020）
15毫升培养管（里维埃拉，目录号：71200155）
30毫升培养管（里维埃拉，目录号：71200305）
显微镜载玻片（GEM，目录号：051）
牙签
培养皿（90毫米）（Tarson，目录号：460090）
立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG1-IA株（Lab collection）
剑杆菌（Burkholderia gladioli）菌株NGJ1（Lab collection）
Milli-Q水
乙醇（Merck）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（HiMedia实验室，目录号：GM096-500G）
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（HiMedia Laboratories，目录号：GM403-500G）
硝酸钠（NaNO 3）（Fisher Scientific）
磷酸二钾（HiMedia Laboratories，目录号：MB044-500G）
硫酸镁七水合物（MgSO 4•7H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：GRM684）
氯化钾（KCl）（HiMedia Laboratories，目录号：MB043）
硫酸亚铁七水合物（FeSO 4•7H 2 O）（HiMedia Laboratories，目录号：GRM1377）
二甲基亚砜（MP Biomedicals，目录号：02196055）
Czapek dox肉汤（CDB）（HiMedia Laboratories，目录号：M076-500G）
Czapek dox琼脂（CDA）（HiMedia实验室）
（可选）KBA（HiMedia实验室，目录号：M1544-500G）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（见食谱）
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（见食谱）
Czapek dox琼脂（CDA）（见食谱）
Czapek dox肉汤（CDB）（见食谱）

设备

镊子
不锈钢钳（HiMedia实验室，目录号：LA710）
移液器（Eppendorf-可以容纳10μl，200μl，1000μl移液器吸头）
Milli-Q水纯化系统（Merck，型号：Milli-Q Advantage A10，目录号：Z00Q0V0WW）
高压灭菌器（INDFOS-110-PB）
培养箱和摇床（28°C）（mrc，目录号：LOM-65）
微量离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX-301）
层流空气流动（Azbil Telstar，型号：Telstar Bio II Advance，目录号：EN 12469）
光学显微镜（尼康，型号：Eclipse E100）

程序

固体培养基上的细菌 - 真菌对抗试验
注意：所有步骤应在无菌条件下进行。
1. 从大约一个挑选一个立枯丝核菌AG1-IA株BRS1菌核。 2周龄的PDA平板，使用无菌牙签/镊子，将其置于新鲜PDA平板的中心（参见食谱），并在28℃下孵育一周。 R。因此，菌核会萌发形成菌丝体，经过孵化后产生大量黑色的继发性菌核，孢子状的休息结构。
2. 选择一个B的单个殖民地。来自PDA平板的唐菖蒲菌株GNJ1接种于10ml PDB肉汤中（见配方）并在28℃以200rpm将其温育48小时。使用系列稀释平板和菌落计数对细菌数量进行定量。
3. 使用无菌牙签/镊子，将R.solani菌核置于PDA或CDA平板的中心（参见食谱），并将B.randoli菌株NGJ1培养物（20μl的10 9细胞/ ml），在距离中心等距离的四个角落处。
4. 进一步，在28°C孵育板和常规监测细菌蔓延真菌菌丝体（图1;请注意NGJ1蔓延真菌菌丝体，诱导细胞死亡反应和饲料）。
  
  图1. B。剑兰菌株NGJ1在 R上展示mycophagy。菌。：一种。 R的增长模式solani在PDA平板上的菌核。在3和5dpi生长期间，真菌菌丝体在培养皿上扩散，并且通过7dpi，产生大量的继发性菌核。 B. B的增长模式剑杆菌菌株NGJ1在PDA平板上。即使在7dpi的生长期间，细菌也不能覆盖整个平板（C）NGJ1与R的对抗。 solani 在PDA平板上。最初由3dpi，细菌显示有限的抗真菌活性，但在5dpi，细菌开始蔓延真菌生物量和7dpi，细菌蔓延到整个真菌生物量。
液体培养基中的细菌 - 真菌对抗试验
1. 从一周龄的板块R收集新鲜的菌核。 solani AG1-IA菌株BRS1使用无菌牙签/镊子。在10ml PDB / CDB培养液中接种5-10个菌核（参见食谱），让它们在28℃下持续摇动（200rpm）培养48小时以获得菌丝体。
2. 选择一个B的单个殖民地。唐菖蒲菌株NGJ1并在28℃以200rpm接种于10ml PDB / CDB肉汤中48小时。
3. 100μl的10 9细胞/ ml的B培养物。唐菖蒲菌株NGJ1接种到含有48小时预生长的真菌菌丝体的10ml PDB / CDB培养基中。
4. 在三个不同时间点（24小时，48小时和72小时）收集100μL的细菌溶液与预先生长的R株共培养。（10 5，10 6，10 7）平板稀释后，将100μl细菌溶液在PDB / CDB板。在没有R的情况下使用NGJ1。以PDB / CDB培养液中的solani菌丝体作为对照。
5. 在28°C孵育板24小时，并计数出现在板上的细菌菌落。
菌核生长预防试验
1. 选择一个B的单个殖民地。唐菖蒲菌株NGJ1并接种于10ml PDB肉汤中，并在28℃以200rpm孵育48小时。
2. 准备10ml的10 9，10 7，10 5，和10 3细胞/ ml的细菌稀释液使用无菌PDB培养。
3. 添加5-10 R。每个稀释的细菌培养物中都含有solani菌核。
4. 在28°C恒温振荡培养4小时
5. 4小时后，取出处理后的菌核，并将每个菌核分别放在新鲜的PDA平板上。
6. 为了控制，将菌核在PDB肉汤（不含NGJ1）中孵育4小时。
7. 此外，培养板在28°C和常规监测菌丝生长。
琼脂片对抗试验
1. 用乙醇清洁显微镜载玻片，高压灭菌
2. 准备1％的琼脂溶液（高压灭菌），并轻轻倒在无菌载玻片4毫升，以获得薄琼脂分层的幻灯片。让琼脂在层流空气中固化30分钟。
3. 将2个新收集的菌核在薄琼脂层状载玻片的两端放置，在具有湿纸巾的封闭的无菌培养皿（保持潮湿的条件）中孵育载玻片，并使菌核在28℃发芽24小时。 br />
4. 使用移液管，将20μl预先生长的培养物（10 9细胞/ ml）的斑点B.在含有预先生长的R.solani菌丝体的琼脂载玻片中心的唐菖蒲菌株NGJ1。
5. 在无菌条件下于28°C孵育，并使用光学显微镜观察对抗24小时，48小时和72小时后的载玻片（细菌传播和菌丝体损伤）。

数据分析

所有关于数据处理，统计检验，重复的细节和独立实验的信息都已经包含在原始的研究论文中（Swain等人，[2017]。 Nature Communications 404（8）。doi：10.1038 / s41467-017-00529-0）。

笔记

R. solani菌核的发芽率不是100％，在设计实验时应该牢记这一点。
除了PDA和CDA;细菌 - 真菌对抗也可以在King's B的基础上进行研究（KBA，HiMedia）。

食谱

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）400毫升
40克土豆注入形式
4克葡萄糖
6克琼脂
加入Milli-Q水至400毫升，并高压灭菌媒介
倒入无菌培养皿中，让培养皿完全固化，并将其储存在4°C
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）400毫升
40克土豆注入形式
4克葡萄糖
加Milli-Q水至400毫升，高压灭菌介质
Czapek doxagar（CDA）400毫升
12克蔗糖
1.2克硝酸钠
0.4克磷酸二钾
0.2克硫酸镁
0.2克氯化钾
0.004克硫酸亚铁
6克琼脂
加入Milli-Q水至400毫升，并高压灭菌媒介
倒入无菌培养皿中，让培养皿完全固化，并将其储存在4°C
Czapek dox肉汤（CDB）400毫升
12克蔗糖
1.2克硝酸钠
0.4克磷酸二钾
0.2克硫酸镁
0.2克氯化钾
0.004克硫酸亚铁
加入Milli-Q水至400毫升，并高压灭菌媒介

致谢

感谢来自印度政府DBT，印度国家植物基因组研究所核心研究基金的支持GJ实验室的研究经费。 RK和SG承认CSIR和IT，SKY，JD的奖学金，并承认DBT，Govt的奖学金。的印度。作者宣称没有利益冲突。

参考

Fisher，M.C.，Henk，D.A.，Briggs，C.J.，Brownstein，J.S.，Madoff，L.C.，McCraw，S.L。和Gurr，S.J。（2012）。新出现的对动植物和生态系统健康的真菌威胁 484（7393）：186-194。
Ghosh，S.，Gupta，S.K。和Jha，G。（2014）。 Rhizoctonia solani的AG1-IA特异性基因的鉴定和功能分析。 Curr Genet 60（4）：327-341。
Ghosh，S.，Kanwar，P.和Jha，G。（2017）。与Rhizoctoniasolani发病相关的水稻叶绿体完整性，光合作用和代谢组的变化。 Sci Rep 7：41610.
Jha，G.，Tyagi，I.，Kumar，R.和Ghosh，S。（2015）。
Swain，D.M.，Yadav，S.K。，Tyagi，I.，Kumar，R.，Kumar，R.，Ghosh，S.，Das，J。和Jha，G。（2017）。噬菌体类似于尾巴的蛋白质被布鲁克菌（Burkholderia）细菌所部署真菌。 Nat Commun 8（1）：404.