材料和试剂

无菌直颈培养瓶（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：2177124）和铝阳极氧化金属蓝帽（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：2901324）
50毫升无菌猎鹰管（SARSTEDT，目录号：62.657.254）
2毫升无菌Eppendorf管（Greiner Bio One International，目录号：623201）
1.5 ml无菌Eppendorf管（Greiner Bio One International，目录号：616201）
一次性移液吸头200μl（Ultratip，Greiner Bio One International，目录号：739290）
一次性移液吸头1,000μl（Ultratip，Greiner Bio One International，目录号：686290）
洗瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：2401-0500）
玻璃底黑色96孔板（Porvair Sciences，目录号：324002）
黑壁清底96孔塑料板（Greiner Bio One International，目录号：675096）
搅拌石英比色杯（Hellma，目录号：119004F-10-40）
镜头清洁组织（Fischer Scientific，Fisherbrand TM，产品目录号：10605955）
注：此产品已停产。
Filtropur S 0.2μm过滤器（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
乙醇70％在实验室洗瓶（VWR，Technisolv®，目录号：83801.360）
乙醇96％在实验室洗瓶（VWR，Technisolv®，目录号：83804.360）
H 2 O在实验室洗瓶中
1 Mβ-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Duchefa Biochemie，目录号：I1401）
Hellmanex III（Hellma，目录号：9-307-011-4-507）
细菌用胰蛋白胨（Duchefa Biochemie，目录号：T1332）
酵母提取物（Duchefa Biochemie，目录编号：Y1333）
氯化钠（NaCl）（Merck，目录号：106404）
葡萄糖（Duchefa Biochemie，目录号：G0802）
盐酸硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号：T4625-25G）
L-赖氨酸一盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：L8662）
（西格玛奥德里奇，目录号：A9518）在50％乙醇中的氨苄青霉素储备溶液
（50％乙醇）中的氯霉素储备溶液（Duchefa Biochemie，目录号：C0113）
二磷酸氢钾（K <子> 2 HPO <子> 4 •3H <子> 2 O）（VWR，目录号：26932.290）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Merck，目录号：104873）
硫酸铵，（NH 4）2 SO 4（Sigma-Aldrich，目录号：A6387）
注：此产品已停产。
硫酸镁七水合物（MgSO 4•7H 2 O）（Carl Roth，目录号：T888.1）
硫酸铁（II）七水合物（FeSO 4•7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：215422）
硝酸钙四水合物，Ca（NO3）2•4H2O（西格玛奥德里奇，目录号：C1396）
L-精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A8094）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G8540）
胸苷（Sigma-Aldrich，目录号：T1895）
尿嘧啶（Sigma-Aldrich，目录号：U1128）
氯化钾（KCl）（VWR，目录号：71003-522）
二磷酸氢钠二水合物（娜<子> 2 HPO <子> 4 •2H <子> 2 O）（Merck公司，目录号：106580）
戊二醛25％（Merck，目录号：1042390250）
甲醛≥36.0％（Sigma-Aldrich，目录号：47608）
赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L8662）
TY中等（见食谱）
20％的葡萄糖溶液（见食谱）
GB1培养基（见食谱）
1. MM1-10x
2. MM2-10x
3. MM3-100x
4. MM4-100x
5. 维生素B1储备液（4毫克ml-1）
6. 赖氨酸原液（20毫克ml -1）
磷酸盐缓冲液（PBS 1x）（见食谱）
甲醛和戊二醛（FAGA）（见食谱）

设备

P20，P200＆amp; P1000 Pipetman移液器（Gilson，目录号：F167300）
旋转式水浴摇床G76型（Eppendorf，New Brunswick Scientific，型号：G76或GFL-GesellschaftfürLabortechnik，目录编号：1092），带有培养瓶的支架
Photospectrometer（Biochrom，型号：天秤座S22）
压缩空气源
水净化系统（来自ELGA LabWater，Laner End，HP14 3BY，UK的ELGA LC197-Biofilter的Purelab flex）
注意：协议中的所有H 2
离心50毫升Falcon管（Eppendorf，型号：5804 R）
用1.5和2.0ml Eppendorf离心管（Eppendorf，型号：5424R）离心
荧光分光光度计Quantamaster 2000-4（美国新泽西州Photon Technology International公司）采用红色优化设置：R928P PMT管（185-900 nm），500 nm闪光（1200线/ mm）激发和发射光栅。
注意：能够可靠地检测直到700nm的荧光光谱的PMT将适用于所述的方案。
光学滤波器：
1. 500 / 10nm BrightLine®单波段带通滤光片（Semrock，目录号：FF01-500 / 10）
2. ET510LP（色度技术，目录号：ET510lp）
3. 514/3 nm BrightLine®单波段带通滤光片（Semrock，目录号：FF01-514 / 3）
4. 515纳米阻塞边BrightLine®长通滤波器（Semrock，产品目录号：FF01-515 / LP）
5. HQ541 / 12（Chroma Technology，目录号：HQ541 / 12）
  注：本产品已停产。可以使用具有类似传输特性的滤波器。
6. E550LP（Chroma Technology，目录号：E550lp）
7. 587/11 nm BrightLine®单频带通滤波器（Semrock，产品目录号：FF01-587 / 11）
8. HQ600LP（Chroma Technology，目录号：HQ600LP）
  注：此产品已停产。
荧光扫描板阅读器（BioTek Instruments，型号：Synergy TM Mx，目录号：SMATBC）
高压灭菌器（SANYO，目录号：MLS-3780）

软件

荧光分光光度计软件（PTI采集软件FeliX32版本1.2 Build 56）
酶标仪软件Gen5版本2.00（Biotek）
Excel（微软）

程序

FRET方法从头到尾包含几个步骤，每个主题进行讨论。程序和部分在图1中概述。

图1.基于细菌谱的FRET方法的工作流程面板的标签对应于描述特定协议的部分。 A.选择合适的FRET对并创建表达质粒。 B.测试构建的功能性质粒。 C.培养稳定的培养物，诱导FRET构建体和收获细胞的表达。 D.样品制备和数据采集。 E.数据分析。

为您的实验选择合适的FRET对并创建FP融合
1. 为您的实验选择合适的FRET对
  在开始FRET实验之前，应该选择最合适的FRET对，这取决于计划的实验类型。例如，所测定的蛋白质 - 蛋白质相互作用的间隔或进行体内测量的要求影响这种选择（表1）。在这个生物协议中，mCherry（Shaner等人，2004）被用作mNeonGreen（Shaner等人，2013）（mNG），super （SYFP2）或单体Kusabira-Orange（Karasawa等人，2004）（mKO）供体FPs。所有的组合都有其特定的优点和缺点。已经将这些蛋白质描述为单体，并且通常不具有强烈的聚集倾向（Cranfill等人，2016）。理论上，具有最大福斯特半径（R 0）的FRET对将导致最高的FRET值。 R 0值是从供体到受体荧光团发生50％能量转移的距离的量度（图2）。这由供体发射光谱和受体激发光谱之间的重叠，它们各自的量子产率，消光系数和取向来确定。
  
  图2.描述的FRET对的Forster半径。使用表1中的光谱性质绘制mNG-mCh，SYFP2-mCh和mKO-mCh FRET对的作为发色团距离的函数的理论FRET效率。在右侧，放大的图显示R <或者荧光团之间的距离将会产生50％的能量转移。
  
  在这里描述的FRET对中，mKO-mCh具有5.9nm的最高R 0值。然而，mKO具有较长的成熟时间，即虽然它是由细胞产生并且其三级结构已折叠，但形成发色团的氨基酸需要时间来重排它们的共价键以发荧光，这被称为成熟。没有完全成熟的FP的FRET实验因此可能导致不平衡的信号采集和错误的后续计算。如果考虑到成熟时间是没有问题的，那么mKO-mCh对优选用于细胞质FRET实验，因为其具有良好的动态范围和最少的耗时测量时间（Alexeeva等人，2010; Fraipont 等人，2011; van der Ploeg等人，2013）。 SYFP2-mCh FRET对具有略低的R0值（5.7nm），但会发射强的SYFP2荧光，这将提供足够的信号用于在每个细胞的相对较低拷贝数的蛋白质之间发生的相互作用van der Ploeg et al。，2015）。鉴于SYFP2具有良好的折叠和成熟性能，使用SYFP2-mCh对可以进行FRET，尽管只有固定细胞的实验尚未完成。如果使用SYFP2-mCh FRET配对并且细胞固定，则SYFP2信号需要恢复其荧光，并且不可能直接测量样品。无论如何，在我们手中，SYFP2-mCherry FRET对提供了最广泛的FRET检测范围。这是令人惊讶的，因为mKO-mCh对具有更高的R 0 0，但是由于其高荧光强度，可能SYFP 2表现出稍好的性能。因此，如果需要测量较少丰度蛋白质的FRET值的较小差异，则SYFP2-mCh对可能比mKO-mCh对更合适。在所描述的三个FRET对中，mNG-mCh具有最低的R 0值（5.5nm），因此具有适度的检测范围，但是其也具有优势。目前mNG是mCherry在周质中折叠成熟的唯一有用的捐献者。 mNG-mCh FRET对可以在细胞质和周质中的活细胞FRET实验中实时使用（Meiresonne等人，2017）。此外，通过光谱解混获得的mNG-mCh FRET对结果可以通过基于荧光寿命的检测方法来确认（Meiresonne等人，2017）。
  
  表1.本生物协议中描述的FRET对的信息
  
  *如原始文件（Alexeeva等人，2010; van der Ploeg等人，2013和2015; Meiresonne等人 >，2017）。
  注意：
  1. 对于表1中给出的R值，最初公布的消光系数为72,000M （Shaner -1 -1 等人，2004年）。基于检测精度和样品条件，在FP消光系数的描述中发生变化。不断改进的FP研究领域表明，mCh的消光系数更多地在85000M -1cm cm （Cranfill等，2016; Bindels等，2017）。同样，mKO的量子产率据报道高于最初的想象（0.77）（Cranfill等，2016）。这将导致每个描述的FRET对的更高的R值和不同的计算。
  2. 不同的FP对，尤其是CFP-YFP已经用于细菌FRET。欲了解更多信息，请参阅参考文献（Sourjik和Berg，2002; Detert Oude Weme等，2015; Sieger和Bramkamp，2015）。
2. 创建FP融合
  编码感兴趣蛋白的细菌基因与编码所述荧光蛋白之一的基因融合，并由诱导型表达载体表达。可以使用任何质粒表达系统，条件是质粒是相容的（不同的复制起点和不同的抗生素抗性标记），并且表达水平低（通常为2,000个拷贝的蛋白质）以避免非特异性相互作用。为了使FP和感兴趣的蛋白质有一定的运动自由度并减少空间位阻，可以在FP和蛋白质之间加入接头。经常使用GGS重复序列，但是我们对ARNNNN和其他氨基酸序列也有很好的结果。另一个考虑是N-或C-末端融合的选择。例如，应避免或规避编码用于下游运输或加工的信号序列的蛋白质的N端融合物。另外，蛋白质的N-或C-末端对于其正常定位或功能可能是必需的。程序B讨论测试创建的融合。质粒的序列应在进一步实验前确认。用质粒克隆和转化大肠杆菌的描述超出了本方案的范围，但是其他生物学方案如“[BIO101]标准克隆”和“[BIO101] Inoue方法的制备和转化“大肠杆菌”：“超级感染细胞”（He，2011; Im，2011）可能是有用的。
测试FP融合
理想情况下，FP融合蛋白应该是完全有功能的，并且表达水平接近其原生水平，同时仍然导致可测量的荧光强度。一旦在质粒上产生融合体，应该测试表达的产物对表型，荧光和正确的细胞定位的影响。如果没有观察到荧光，则可以通过Western印迹分析评估FP的降解。也许融合破坏了感兴趣的蛋白的正常定位，功能和相互作用。这可以通过修改链接器的长度或切换FP的位置来修改。一些蛋白质既不能作为N的功能也不能作为C端融合物，而是作为夹心融合物起作用（van der Ploeg等人，2015）。 FP-融合应补充相同蛋白质的缺失或缺失菌株的功能丧失。互补测试将取决于基因的丢失是否导致表型。如果不能进行互补实验，FRET实验可以在野生型或缺失背景下进行，但是应该记住融合蛋白可能不起作用，结果可能会被误解。
注意：基于质粒的FP融合是快速测试定位或感兴趣的蛋白质相互作用的好方法。然而，由于化学计量不平衡，基于质粒的互补并不总是可行的。在这种情况下，可将FP融合体插入染色体的原始位置。实际上，已知的FRET配偶体的染色体插入对于简单的测定来说将是优选的。然而，这也将需要染色体参照在同基因背景中，因为细菌可以对质粒和基于染色体的蛋白质表达在生长差异和质粒维持可能的自发荧光方面有不同的响应。

准备FRET实验
当FP融合蛋白准备好使用时，可以用供体和受体表达质粒转化感受态细胞。任何 E。大肠杆菌菌株应该是合适的。因为我们对影响形态的蛋白质感兴趣，所以我们倾向于使用野生型菌株MC4100或BW25113，它们在形态上是均一的。请注意，如果使用缺失菌株，则参考和对照应该在野生型变体中。所描述的FRET测定需要至少三个参考样品，其在与所评估的相互作用相同的遗传背景的细胞中表达。强烈建议使用由表达与受体FP融合的供体FP的质粒和表达供体或受体FP的两种质粒分别与已知不相互作用的无关蛋白融合的阳性和阴性对照。最好的对照在与蛋白质 - 蛋白质相互作用发生的相同区室中表达，以便能够评估分子拥挤效应。表2列出了最小FRET实验的样品列表。

表2.最小FRET实验所需的样品和质粒

为了检测两个感兴趣的蛋白质之间的相互作用，至少需要三个参考文献。建议积极和消极的控制。所描述的方案针对两种相容性质粒，其具有与氯霉素抗性结合的p15复制起点和结合氨苄青霉素抗性的ColE1复制起点。两种质粒都具有弱化的99A启动子和两种终止子。
稳态增长，诱导和收获细胞
生长在丰富培养基中的细菌细胞通常含有高浓度的自动荧光分子，降低了信噪比。出于这个原因，细胞在基本培养基中生长，不鼓励在富培养基中进行FRET实验。为了比较表达FP对的各种细菌培养物，在诱导蛋白质表达之前，细胞在约20代中生长至稳定状态（图3）。这确保了所有样品中相同的自发荧光背景。诱导表达至少2代后，固定和收集细胞。
1. 制备在5ml TY +氨苄青霉素+氯霉素+ 0.5％葡萄糖培养基中在37℃下振荡直至细菌生长可见的所有菌株的起始培养物， > 注意：向培养基中加入葡萄糖以抑制来自质粒的lacI / qq受控基因的表达。
2. 使用发酵剂培养物接种25ml（1：250）Gb1培养基+氨苄青霉素+氯霉素，并在摇动的同时在28℃继续过夜生长。
3. 第1天。在新鲜的Gb1培养基+氨苄青霉素+氯霉素中稀释过夜培养物1：250，并在摇动的同时在28℃继续生长。
  注意：从现在开始，定期测量并注意培养物的OD值，不要让它达到0.2以上。如果培养物接近这个值，就用新鲜的预热培养基稀释。
4. 使用提供的Excel工作表计算所有生长培养物的倍增时间（TD）“增长计算.xlsx “，并在继续实验时用它来计算第二天早上0.1的OD值450的稀释因子。
5. 重复在新鲜的Gb1培养基+氨苄青霉素+氯霉素中生长，同时保持OD 450值低于0.2，并在第二天早晨稀释，如步骤C4所示。 >
6. 重复在新鲜的Gb1培养基+氨苄青霉素和氯霉素中生长，同时保持OD 450值低于0.2，并在第二天早晨稀释，如在步骤C4中一样，但是这次的目标对于35ml新鲜的Gb1 +氨苄青霉素+氯霉素，其OD 450值为0.025。
7. 测量培养物的OD 450值，如果它们在0.03-0.04左右，则通过加入适当浓度的IPTG诱导来自质粒的表达（例如<！ - SIPO
8. 当培养物接近〜0.2的OD 450值时，准备足够量的FAGA固定剂（见食谱）。
  注意：所需FAGA的总体积取决于待固定培养物的总体积，需要1 ml FAGA来固定12.5 ml培养物。
9. 当细胞达到0.2的OD 450值时，用FAGA将细胞固定在振荡水浴中，这取决于培养物体积剩余10分钟。
10. 将固定的培养物倒入50ml Falcon管中，并通过在室温（Eppendorf 5804R）在6,300×g下离心10分钟来沉淀细胞。
11. 丢弃上清液，用1ml PBS在1.5ml Eppendorf管中在室温下在台式离心机（Eppendorf 5424R）中以4600×gg离心5分钟来洗涤3次。
12. 在1ml PBS中重悬最后一个沉淀，取决于使用的FRET对，在37℃或在周末在4℃孵育o / n以允许发色团成熟（emo mKO-mCh 或将样品保存在4°C直到准备测量（SYFP2-mCh＆amp; mNG-mCh）。
  注意：SYFP2和mNG的折叠速度很快，它们的发色团（快速）成熟很快，因此可以考虑直接测量，但是在第二天进行光谱测量更为实用。
  
  图3.稳态增长的例子基于MC4100的大肠杆菌培养物的培养物生长曲线在28℃下在Gb1中生长至稳态，表达周质FP-融合体。圆圈表示过夜稀释的时间点。在第4天，用IPTG诱导培养物（箭头）以表达周质性mNG-或mCh-融合物。 EV（空载体）文化不表示任何FP，并作为对照。在OD 450下给出X轴以表示指数增长。细胞在至少两次质量加倍（星号）后固定和收获。这个数字是根据Meiresonne et al。，2017年改编的。
样品制备和数据采集
1. 如步骤C10所述将细胞沉淀，并重悬于1ml PBS中。
2. 通过用新鲜的PBS稀释细胞，并将1,200μl加入到搅拌的石英比色皿中，制备至少1,300μl具有1.00±0.005的OD 450值的样品。
  注意：
  1. 可以在光谱分析仪内进行稀释。 OD值等于450就是等于450的值。结果就越可靠。
  2. 在测量之前，不要忘记将磁力搅拌器添加到比色杯中。
3. 使用表3中所示的设置和光学过滤器测量受体发射光谱，并在'使用荧光计测量光谱 - 荧光计设置和实际设置'中描述。
4. 使用表3中所示的设置和光学过滤器测量供体发射光谱，并在'<使用荧光计测量光谱< - 荧光计设置和实际设置>“中进行描述。
  注意：建议按照相同的顺序测量每个样品的受体和供体谱图，以防止FP漂白的可能差异。
5. 对每个样品重复步骤D2到D4，并在测量开始和所有测量结束时测量空白PBS样品。这使您可以验证仪器响应中的任何变化。
6. 将数据保存为可导出到Microsoft Excel的任何方便的文件格式。
  注意：
  1. 在接收样品之前和之间，需要通过执行下面清洁规程中列出的步骤彻底清洁石英比色皿。
  2. 450 使用读板仪测量光谱 '。
    
    表3.荧光光谱测量的过滤器设置
    
    a 可以使用具有类似传输属性的滤镜。
使用荧光计测量光谱 - 荧光计设置和实际设置
使用荧光计测量发射光谱。荧光计应激发窄带波长的样品，然后发射测量的荧光。荧光计的示意图如图4所示。光源发出白光，通过一个狭缝到达激发单色器，在那里被分离成它的波长成分。光通过一个狭缝，然后通过激发滤波器，并撞击石英比色皿中的样品悬浮液。样品中的细胞将被激发并在各个方向发光，但是激发光也会从中散射出去。在90°的角度，散射光被发射滤光器过滤，并且荧光发射通过进入发射单色器的狭缝。在这里，发射波长被扫描并通过最后一个狭缝，然后进入一个光子倍增器，在那里光子的量子被转换成一个可测量的电流。产生的发射光谱是计算FRET所需的原始数据。不同FPs的测量需要不同的激发，滤波和测量设置，如表3所示。狭缝宽度通常设置为6 nm，如果荧光蛋白表达良好，通常会得到很好的结果。较小的狭缝宽度导致更具体的测量，但是也将使较少的光通过，以便当荧光信号非常高时狭缝应当更加闭合。如果荧光信号较低，狭缝可能会变宽，但这会导致较少的特定信号。当背景荧光是一个问题，这将成比例地增加。
注意：
1. 在光输出稳定之前，白光源必须加热。开机30分钟后，检查灯泡功率是否为75W，如果不调整。其他荧光计将有不同的要求。
2. 其他白光源或设备的使用可能需要不同的准备。
  
  图4.在荧光计中测量样品的示意图。单色仪上的双黑色和灰色圆圈表示可调整的狭缝。＆nbsp;＆nbsp;
  
  清洁石英比色皿
  1. 大量用H 2 O冲洗反应杯的内部和外部
  2. 仔细摆脱多余的H 2 O.
  3. 用70％的乙醇大量冲洗内外
  4. 小心摇掉多余的70％乙醇。
  5. 重复步骤1至4（协议清洁石英比色皿），三次。
  6. 用96％的乙醇大量冲洗内外
  7. 小心摇掉多余的乙醇96％
  8. 用压缩空气吹干比色杯
  9. 用镜头纸擦拭比色杯，去除指纹等意外污渍。现在比色杯已经被正确地清洗过，可以拿着样品进行测量。
  注意：
  1. 搅拌器豆在手掌上用同样的冲洗方法清洗。
  2. 最后一次测量后，再次将所有的比色杯和搅拌器豆冲洗干净，然后将其浸入2％Hellmanex III中保存。如果比色皿不需要更长的时间，请将其储存干净，干燥。
  3. 由于石英比色皿易碎且价格昂贵，因此应小心照料。只需用手指靠近开口处触摸小杯，以防止在石英的重要部分上印出指纹。在食指和拇指之间携带小杯，同时用小拇指或无名指支撑底部，如图5所示。
    
    图5如何正确握住石英比色皿，用拇指支撑拇指和食指
使用读板器测量光谱
测量样品发射光谱的便捷方法是使用荧光读板仪。因为大多数荧光读板器的灵敏度低于专用荧光计的灵敏度，并且提供较弱的荧光信号，所以要谨慎。如果荧光较低，则应使用荧光计。该Bio-protocol描述了BioTek协同MX读板机的使用，该读板机具有激发和发射单色器，而无需额外的光学过滤。此外，这款读板机具有最小9纳米开口的狭缝。平均而言，较低的信噪比和来自读板器的较少特定信号可能因此导致解混问题。因此，建议首先使用荧光计牢固地建立FRET相互作用，然后使用读板器进行确认。如果结果是可重复的，则只能使用读板仪进行实验。

用于固定细胞的方案读板器FRET（仅限mNG-mCh）
1. 如步骤D1和D2中所述，准备具有1.00±0.005的OD 450值的样品。
2. 在玻璃底黑色96孔板中分配200μl样品复制品。如果进行8次重复，则可以在96孔板中留出11个准备样品和1个PBS测量的空间。
3. 使用表4所示的设置测量每口井的供体和受体发射光谱。
4. 以兼容Excel的格式导出排放数据，绘制重复数据以检查明显的偏离数据。
5. 根据来自其他重复的大而明显的偏差排除可能的异常值，并平均受体和供体发射光谱。这些数据将用于光谱解混和FRET计算。
  
  表4.使用平板读取器进行光谱测量的设置
数据分析
当所有样品的受体和供体发射光谱都由荧光计或平板读数器测量时，它们可以不混合。根据提供的参考，光谱分解将排放数据分解为其组成部分。供体通道由背景发射，仅供体发射，直接激发受体发射和可能的FRET受体发射（图6）组成。受体通道由背景发射和受体唯一发射组成。形成这个谱图，样品中受体的数量可以使用背景谱和参考谱来计算谱图的混合。知道受体荧光的量，可以计算由于供体和受体在包含两者的样品中的交叉激发而从受体预期有多少荧光。利用参考光谱和样品中受体数量的知识，可以将样品的发射光谱分解为背景光谱，供体光谱和受体光谱。剩下的是与受体光谱相同的光谱形状，如果没有发生敏化发射（能量转移），则不能说明这一点。这额外的受体谱对应于能量转移的量。 Alexeeva等人的补充数据（2010）给出了基于超出协议范围的生物物理学工作的详细描述（Clegg，1992; Clegg等人 1992; Wlodarczyk等人，2008; Gadella，2009）。在补充信息中，提供随时可用的Excel表格来计算每个描述的FRET对的FRET效率。 ' mNG-mCh.xlsx '' mNG-mCh plate reader.xlsx '' SYFP2-mCh.xlsx ”和“ mKO-mCh.xlsx ”。

图6.周质FRET测定的原理A. mCh和mNG的激发和发射光谱，指示用于测量受体通道（左）或供体通道（右）的波长。粗虚线代表使用的激发波长。带阴影的蓝色区域表示mNG发射光谱与mCh激发光谱之间的光谱重叠。灰色阴影区域代表测量发射的波长。 B.测量样品以计算周质FRET。需要参考背景，mCh和mNG来计算样本中对FRET的贡献。 C.混合周质串联FRET样品，显示所测量的光谱为黑点（Peri-tandem）和计算的光谱为实红线（Unmixed Calc。）。测量的受体光谱由背景荧光（非混合空单元）和在590nm激发的样品中存在的mCh（未混合受体）的量组成。使用受体的直接激发来确定样品中存在的受体的量。然后使用该量来计算在供体激发样品中检测到多少额外的受体（致敏发射）。测量的供体谱包含背景（未混合的空单元格），mNG（未混合的供体）和mCh（未混合的受体）荧光和敏化发射（Unmixed SE），这是解混算法不能归因于直接激发的额外荧光mCh。 D.测量和计算光谱之间的低残差是解混的质量的量度。这个数字最初发表在Meiresonne 等，2017年。

使用解混表单的协议
计算机屏幕上的解混过程如何显示如图7所示。高分辨率屏幕截图可以在补充数据中找到。
注意：根据使用的设备，原始数据可能有不同的输出格式，并进行相应的调整。
1. 将光谱数据复制到相应的Excel表格1“原始数据”中。
2. 减去第2页“减PBS”中所有样本的PBS测量结果
3. 复制表3'数据'中指定位置的空矢量，受体参照和供体参照。这会自动从受体和供体参考光谱中减去背景信号。
4. 将样品数据复制到表3'数据'中的指定位置，表格将根据给定的参考值将这些质谱图解混。
  注：参考和样品光谱绘制在表3的底部进行检查。
5. 检查表4“结果”中的混合概述，如下所述。
6. 将结果复制粘贴到表格5'摘要'。
7. 对其余样本重复步骤4-6。
  
  图7.计算屏幕上显示的FRET效率的解混过程不会直接使用的原始捐助者和接受者解混合计算会显示在补充文件中的高分辨率屏幕截图中“取消混合screens.pptx ”。
  
  什么决定了一个好的测量？
  光谱分离高度依赖于应在相同条件下测量的清晰的荧光信号。供体和受体参考光谱是通过从其各自的发射测量结果中减去PBS和空单元格数据而获得的，如'使用解混表格的方案中所述。这应该只产生一个纯粹的发射光谱或只有受体FP。有时光谱不再类似测量的FP，甚至可以看到特别是供体的负光谱。这可能是由空白细胞样本中强烈的自体荧光水平和参考样本中低FP信号引起的。如果其中一个参考不好，光谱的混合将不会给出值得信赖的结果。或者，先前测量的参考光谱可以用于仍然获得样品的FRET值的粗略指示。建议不要将这些值作为确定的值，并且需要重复实验以获得可信的数据。当实验结果良好时，样本数据可以不混合。不能归因于受体谱的发射信号称为非混合差异。非混合差异是测量FRET光谱质量的一个很好的方法，在一个理想的实验中它应该是零。更实在的，它应该是测量光谱的一小部分，如图6D和8D所示。
  
  图8.完整的体内阅读板FRET实验。：一种。在28℃下在Gb1中生长的细胞的生长曲线仅显示周质串联mNG-mCh的倍增时间的微小差异。在测量荧光光谱之前，所有良好培养物的OD 450值在彼此的〜10％之内。箭头指示通过1：2稀释开始诱导构建体的时间点。 B.具有标准偏差误差棒的周质参考的平均归一化荧光光谱显示重复之间只有小的强度变化。 C.左侧受体通道和右侧供体通道的高质量混合平均周质串联样品的平均参考值表明敏化发射的可靠计算。 D.测量的光谱和计算的光谱之间的差异仅显示受体和供体的很少的混合差异。这个数字最初发表在Meiresonne 等，2017年。

数据分析

这个生物协议描述了如何准备，执行和分析体内细菌FRET实验。在相关章节（程序E），提供有关数据分析的信息，并提供深入的技术信息。所获得的FRET值的重要性可以使用标准置信区间统计方法来计算。由于拥挤，FRET值应该显着高于从非相互作用样品获得的值。对于这个分析，可以使用标准的 t - 测试。

食谱

TY中等
1升重量：
10克细菌胰蛋白胨
5克酵母提取物
5克NaCl
加H 2 O至1L，121℃高压灭菌15分钟。
20％葡萄糖溶液
对于200毫升20％的葡萄糖溶液重量：
40克葡萄糖
加入H 2 O至200ml，并在121℃高压灭菌15分钟。
Gb1中等
对于1升联合（使用无菌技术）：
100毫升MM1-10x（方案3a）
100毫升MM2-10x（方案3b）
10毫升MM3-100x（方案3c）
10毫升MM4-100x（配方3d）
注：对于基于BW25113，TB28和MG1655的大肠杆菌菌株
20毫升葡萄糖20％
1毫升盐酸硫胺素4毫克毫升（方案3e）
2.5毫升L-赖氨酸一盐酸盐20毫克毫升（方案3f）
1毫升氨苄青霉素毫克每毫升
1毫升氯霉素25毫克ml -1
加无菌H 2 O至1L
1. MM1-10x
  对于1升MM1-10x重量：
  63.3克K 2 HPO 4•3H 2 O
  29.5克KH 2 PO 4 4 加H 2 O至1L，121℃高压灭菌15分钟。
2. MM2-10x
  对于1 L MM2-10x重量：
  10.5克（NH 4）2 SO 4 1克MgSO 4•7H 2 O 0 加H 2 O至1L，121℃高压灭菌15分钟。
3. MM3-100x
  对于1 L MM3-100x重量：
  28毫克FeSO 4•7H 2 O 710毫克Ca（NO3）2•4H2O 2
  加H 2 O至1L，121℃高压灭菌15分钟。
  注意：灭菌后，MM3会显示一个红色的降水，应该忽略。
4. MM4-100x
  对于50毫升MM4-100x重量：
  250毫克L-精氨酸
  250毫克L-谷氨酰胺
  10毫克胸腺嘧啶
  100毫克尿嘧啶
  将H 2 O 2加至50ml，用Filtropur S0.2μm过滤器过滤灭菌。
5. 维生素B1储备液（4毫克ml-1）
  对于50毫升维生素B1 4毫克毫升-1储备液称：
  200毫克盐酸硫胺素
  将H 2 O 2加至50ml，用Filtropur S0.2μm过滤器过滤灭菌。
6. 赖氨酸原液（20毫克ml -1）
  对于50毫升赖氨酸20毫克毫升的储液重量：
  1克赖氨酸
  将H 2 O 2加至50ml，用Filtropur S0.2μm过滤器过滤灭菌。
磷酸盐缓冲液（PBS 1x）
PBS缓冲液（pH 7.2）
140 mM NaCl
27 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4•2H 2 O 0/2 2 mM KH 2 PO 4 4/2
甲醛和戊二醛（FAGA）固定剂
每1毫升甲醛添加21微升戊二醛

致谢

该生物方案的改变已经用于以下出版物（Alexeeva等人，2010; Fraipont等人，2011; van der Ploeg等人。，2013和2015; Meiresonne 等，2017）。作者想感谢教授。博士。 Theodorus W. J. Gadella开发了原始的Excel混合表单（Alexeeva et al。，2010），并严格阅读手稿和Laureen M. Y. Mertens测试了混合协议。 NYM由NWO，ALW开放计划（822.02.019），NWO的Svetlana Alexeeva，ALW的Van Molecuul tot Cel计划（805.47.200）以及RVDP由欧盟委员会DIVINOCELL项目（FP7-Health-2007- B-223431）。作者宣称没有利益冲突。

参考

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