材料和试剂

的材料

对于“窝烧杯”
1. 尼龙紧身衣
2. 即时超强胶（如苏格兰超级胶，3M，目录号：AD124）
3. 15毫升管（如VWR，目录号：89039-670美国，525-0450欧洲）
4. 一次性6厘米直径的塑料培养皿（如Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：123TS1）
解剖
1. 大厨房剪刀或断头台
2. 直的罚款剪刀（如精细科学工具，目录号：14060-11）
3. 弯曲的铲子（如Fine Science Tools，目录号：10092-12）
4. 手术刀（如Fine Science Tools，目录号：91003-12）
5. 玻璃一次性巴斯德吸管（如Fisher Scientific，FisherBrand，目录号：13-678-6A）
6. 滴管灯泡（如Fisher Scientific，FisherBrand，目录编号：03-448-25）
7. 塑料容器，高约2.5厘米，150毫升，如吸管尖端盒或大玻璃培养皿的盖子（Cole-Parmer Instrument，目录号：EW-34551-06）
8. Whatman纸（GE Healthcare，Whatman，目录号：1001-090）
9. 一次性剃刀刀片（如Personna双刃剃刀刀片[亚马逊，PERSONNA，目录号：BP9020]）

的试剂

葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
无水磷酸二氢钠（VWR，目录号：470302-666）
制造商：ALDON，产品目录号：SS0756-500GR。
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯化镁溶液（1M）（Sigma-Aldrich，目录号：63069）
氯化钙溶液（1M）（Sigma-Aldrich，目录号：21115）
股票人造脑脊液（ACSF）的解决方案（见食谱）
冰冷切片ACSF解决方案（见食谱）
恢复ACSF解决方案（见食谱）
实验ACSF（见食谱）

设备

250毫升派热克斯烧杯（如VWR，目录号：10754-952）
直弹簧剪刀（如Fine Science Tools，目录编号：15018-10）
弯曲细镊子（如Fine Science Tools，目录号：11152-10）
600毫升派热克斯烧杯（如VWR，目录号：10754-956）
95％O 2/5％CO 2罐（例如AirGas，目录号：Z 0 OXX9522000043）。
颤音（如Leica，型号：Leica VT 1200 S，目录号：14048142066）
浴加热器（如Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，型号：Precision 180，目录号：51221073）

程序

开始之前：

组装'巢烧杯'（图1）和改进的巴斯德吸管滴管（图2）。
1. “巢烧杯”的准备（图1）
  1. 使用尼龙紧身衣，一个6厘米的塑料培养皿，一个15毫升管，强力胶和一个250毫升的烧杯，准备一个'巢烧杯'，其中切片将在恢复期间和之后孵化。使用厨房剪刀（如果有的话）或者简单地打开培养皿的底部，最好不要打破墙壁。
  2. 在开放的培养皿周围拉伸尼龙以形成牢固的网状基底，并通过捆绑或使用弹性带将其固定。在培养皿的外壁上粘上尼龙。不要使用过量的胶水，因为这可能对切片有毒，并会妨碍适当的干燥。让干24小时。
  3. 用手术刀或精细剪刀剪掉多余的尼龙。大量冲洗，并在清水中浸泡过夜（我们有“新鲜”胶水显示对切片有毒的情况）。切割并丢弃15毫升管的圆锥形末端，并在底端附近切出一个矩形窗口。
  4. 如图所示组装所有三个元素。将95％CO 2/5％O 2储罐中的塑料管放入15ml试管中以保持合适的pH值和充氧量。
    
    图1.巢烧杯。使用尼龙紧身衣，一个6厘米的塑料培养皿，一个15毫升管，强力胶和一个250毫升的烧杯，准备一个'巢烧杯'，其中切片将在恢复过程中和之后孵化。
2. 改良的巴斯德吸管滴管（图2）
  
  图2.修饰符巴斯德吸管滴管。打破玻璃一次性巴斯德吸管的最薄端，并将其插入滴管灯泡。
前一天准备1L ACSF，并在4°C过夜。

设置：

在实验当天，在600ml派热克斯（Pyrex）烧杯中（通过加入2mM MgCl 2和1mM CaCl 2）制备300ml冰冷切片ACSF（参见食谱）至300ml的ACSF储备液），并置于-20℃冰箱中约20-30分钟，或直到烧杯壁上和表面形成一薄层冰。大力搅拌，将冰块打成均匀的冰块。避免过度冻结，因为这将彻底改变溶液的渗透压，并降低切片的质量。但是，在整个切片过程中，冰量应足以使溶液保持在0-1℃。因此，建议根据您的需求/速度调整解决方案的冰冷度。我们建议不要将切片ACSF的烧杯放在-80°C的冷冻箱中。
在冷冻切片ACSF在冰箱中时，在“巢式烧杯”中制备150ml的回收ACSF（通过加入1.5mM的MgCl 2和2mM的CaCl 2 2） 150毫升ACSF）。在33℃的加热浴中预热至少25分钟，同时用95％O 2/5％CO 2氧化至少25分钟（图3B） br />
通过在切片室周围的托盘中放入冰和水的混合物来准备vibratome。用厨房剪刀（或使用两个刀片）将刀片切成两半：将一半放在vibratome的刀架中，另一半放在夹层程序B中。
熟悉下面的程序A到C，并相应地准备工具，以优化过程。通常情况下，这是按照以下顺序放置工具（从右到左，但根据你的优势手调整）：大厨房剪刀，手术刀，细剪刀，细镊子，塑料容器或大玻璃培养皿和一张沃特曼纸在底部（这将有助于增加视觉对比度和提供更大的表面抓地力）和附近的弯曲的刮刀，准备抢下半年的刀片，vibratome切割板和胶管，改进的巴斯德吸管滴管和弹簧剪刀（图3A）。

图3.设置。：一种。解剖和切片台上的工具按照本协议所述步骤的顺序从右到左设置。 B.填充有95％O 2/5％CO 2的回收ACSF鼓泡并在33℃孵育的巢式烧杯的近视图。

快速提取大脑
1. 将大约一半（150毫升）的冰冷切片ACSF倒入塑料容器或大玻璃培养皿和含氧化合物中。
2. 使用异氟醚麻醉小鼠，检查尾巴或爪子捏反射的情况下，使用小型断头台或大型厨房剪刀快速断开鼠标（图4A和4B）。通过皮肤沿中线（图4C）的大切口暴露颅骨，切开每侧的听觉传导（图4D和4E）。将皮肤拉向动物的鼻子以完全暴露头骨（图4F）。这也将提供更好的头部抓地力。
3. 将头放入冰冷的含氧切片ACSF中。让它淹没10秒冷却。
4. 在确保头部始终处于水下的情况下，用精细的剪刀，通过立刻切开小脑的尾部（图4G和4H），打开颅骨的后部，然后沿着中线从尾部切开颅骨按照你的方式去嗅球（图4I-4L）。避免对头骨施加压力，并确保下面的剪刀尖不会对下面的大脑造成伤害。我们还建议通过颚骨在颅骨的底部做一个侧面切口，这将有助于提取大脑（图4M）。
5. 用细镊子抓住中线一侧颅骨的开口边缘，牢固地握住并向侧面开放，同时用另一只手稳稳地压住头部（图4N和4O，理想的是，你的指标和拇指应该在每个老鼠脸上的一面，大致在眼睛上，手指紧贴皮肤通常是有帮助的）。
6. 然后转到另一边（图4P和4Q）。使用弯曲的铲子，并且非常温和地到达大脑下面（让头骨的地板引导你），轻轻地舀出大脑，而不用拉动（图4R-4T）。视神经，腹部和颅神经，可能需要用精细的剪刀或直接用刮刀切割，以使脑完全释放。将提取的大脑留在冰冷切片ACSF中（图4U）。
  在整个过程中，确保将大脑浸入冰冷的ACSF中。
  
  图4.从颅骨中提取大脑：一种。捣毁被麻醉的动物; B-F。使用手术刀，切开皮肤，切开听觉导管，拉动皮肤暴露头骨。 G-小时。打开后面的头骨通过切割立即尾小脑。我-L。用精细的剪刀沿着中线小心地切开头骨。将剪刀倾斜以最小化尖端对下方大脑的潜在损害。 M.如果使用的动物是成年人，我们建议在颅骨的底部通过颚骨进行侧切。 ñ-Q。用镊子抓住一侧头骨的开放边缘，用一只手牢固地握住头部，一边用鼻子牢牢按住头部。然后转到另一边。 R-Ú。使用弯曲的小铲，小心地到达大脑下面（让头骨的地板引导你），然后轻轻舀出大脑。用细剪刀或直接用抹刀（T）切开视交叉。为了清晰起见，在G-U面板的解决方案中没有冰块和起泡。
隔离感兴趣的区域
1. 用剃刀刀片，去除感兴趣区域的大脑，嘴唇和尾部不需要的部分。在海马的情况下：将大脑腹侧向下放置，找到上丘，做一个横切和尾部（小脑，图5A）。
  注意：确保切口垂直于rostro-caudal轴，因为这个脸将粘在vibratome的切割板上。
2. 然后翻转大脑腹侧，找到视交叉，并做横切（图5B和5D）。这应该暴露穹窿的海马立即在海马（即，海马在其下面）的穹窿。在切割板上涂上足够的粘合剂（确保板预先干燥，图5E）。
3. 使用弯曲的铲子和你的指标和拇指作为基台（不要用手指抓住大脑！），将大脑嘴侧朝上，腹侧朝向你（图5F和5G）。轻轻地将抹刀的底部放在纸巾上，通过毛细作用排出多余的ACSF（不要用纸巾擦大脑）。将刮刀放在胶水的正上方（不要接触它），用手指将其从刮刀上推下（图5H），轻轻地将胶囊上的大脑一次性移动到胶水上。
  注意：缓慢或犹豫会“拉伸”大脑，降低切片的质量。不要压下大脑，不要轻拍大脑，等待，让大脑干掉，否则这将大大降低切片的质量。
  
  图5.隔离感兴趣的区域。：一种。当大脑背侧朝上时，找到下丘，并用剃刀刀片在垂直于尾骨轴的正上方进行切割。丢弃包含小脑的部分。公元前。翻转大脑腹侧，找到视交叉，并使用剃刀刀片，垂直于rostro-caudal轴进行切割。丢弃正面部分。这应该释放位于海马正上方的穹窿的伞状。 E-H。在vibratome板上涂上所需量的胶水。 F.使用弯曲的铲子和您的指标和拇指作为基台（不要用手指抓住大脑！）拿起大脑。用手指将大脑从胶水上方的刮刀上推下来，然后轻轻地将胶水“一滴一滴地”滴在胶水上。为了清楚起见，在A-D和F组的溶液中没有冰和不起泡。
获取大脑切片
1. 立即将平板转移到切片室（图6A），使大脑的腹侧部分面向您，并将背部（即，皮层表面）朝向振动切片的背部。轻轻倒入其余的冰冷含氧切片ACSF（图6B）。
2. 降低解决方案的刀片，并使用vibratome控制面板，建立一个相当狭窄但安全的“切片窗口”（每边约2毫米）。将刀片下降到大脑表面（不要按压大脑的刀片），开始切片，获得300-350微米的海马冠状切片（厚度应该是预先设定的）。
  注意：
  1. 避免将ACSF直接倒在大脑上，注意不要把冰块掉到大脑上。在确保由起泡引起的搅动不会过度的同时进行充氧，因为一旦切片未连接，这可能是一个问题。
  2. 为了优化切片的质量并尽量减少整个手术的持续时间，我们建议当刀片不在任何感兴趣的区域时，将vibratome的速度调整到中等（在Leica VT1200上为0.12-0.16 mm / sec），当刀片处于海马或感兴趣的区域（Leica VT1200s为0.08-0.1毫米/秒）时为低。
  3. 一旦叶片到达最后的腹径微米，视交叉或脑膜可抵抗并防止切片完全分离。这也可以在切片被完全释放之前扭曲或“拉”切片。在大多数情况下，不用施加任何压力（图6C）用弹簧剪刀轻轻地将切片保持在刀片上就足以帮助刀片切开交叉或脑膜。在极端情况下，我们建议快速但非常小心地狙击脑膜或其余部分，如果用弹簧剪刀片。无论如何，要特别小心，不要推动振动刀片，在下面的大脑上，或者在连接时拉动切片。任何形式的机械压力（“拉动”）都会损坏切片。这也可能导致大脑脱胶。
3. 一旦释放第一个切片（图6D），用弹簧剪刀分离两个半球（图6E），并使用巴斯德吸管滴管，将它们转移到含有回收ACSF的巢烧杯中（参见食谱），在33℃在浴缸加热器（图6F）。
4. 重复，直到获得所有切片，并且所有半切片在包含恢复ACSF的巢式烧杯中转移。在33°C孵育另外30分钟。
5. 小心地从加热浴中取出巢烧杯，并在室温下恢复45分钟。
6. 切片现在准备用于电生理学或其他程序，如生物协议'脑切片或其他组织外植体中的D-丝氨酸测量'（Papouin and Haydon，2018）。
  
  图6.获取大脑切片。：一种。将粘有大脑的板转移到vibratome的切片室中，然后放下刀架。 B.把剩下的冰块切成片状。 C.如果在切片过程中脑膜或视交叉是一个问题，用弹簧剪刀（不施加任何压力）将切片轻轻地夹在刀片上以帮助切断。 D.一旦切片被释放，用弹簧剪刀将两个半球分开（您可以用细钳子夹住切片的底部），并在33℃下用恢复ACSF孵育和鼓泡转移到巢烧杯中。为了清晰起见，在B-E面板的解决方案中没有冰块，也没有鼓泡。

数据分析

用任何给定的显微镜的5倍物镜可以非常容易地评估切片（特别是海马切片）的质量（图7）。通常情况下，健康的切片显示形成鲜明的对比，跨层和区域的差异着色。地层和 radiatum 将具有明亮的橙色。 lamusasorum分子层通常看起来更暗（深棕色到深灰色）。相比之下，金字塔层将显得薄或“紧凑”，并且根据切片的角度，可以从该图案划定。 oriens 和 radiatum 。不健康的切片采取灰色和统一的色彩。不健康的切片金字塔层显得非常白或透明，通常“肿”。

图7.一个健康的海马切片。健康的脑/海马切片典型地显示橙色着色，层间的色彩和对比度有明显的差异。在皮质层也是明显的。
注意：两组水平的“琴弦”来自“harp”系统，它在显微镜下保持切片（本协议中没有描述）。

笔记

根据我们的经验，步骤A2（一旦鼠标被斩首）到C4（当最后一个切片被提取时）应该在10分钟内达到最佳脑切片质量。特别是，在2分钟内完成大脑的提取应该在动物断头和大脑转移之间不超过2-3分钟的时间内完成vibratome室。
请注意，与大多数实验室或协议相反，我们强烈建议不要使用基于蔗糖的切片溶液。我们发现，减少钙浓度，同时增加镁的含量，确保程序迅速执行（见上文）和冰冷ACSF是减少兴奋性毒性的最有效方法，也是切片质量最好的保证。 >
请注意，与大多数实验室或协议相反，我们强烈建议不要使用画笔来操作切片。虽然他们的手指摸起来很软，在350微米的切片尺度上，油漆刷相当于许多小刀捆在一起，导致多次刺伤切片。

食谱

股票人造脑脊液（ACSF）的解决方案（1升，存储在4°C）
葡萄糖10毫克（1.8克，1升）
氯化钠125毫克（7克，1升）
无水磷酸二氢钠1.25mM（1L，0.119g）
氯化钾2.5mM（1L为0.23mg）
碳酸氢钠26毫克（2.18毫克，1升）
调节pH值至7.3，渗透压浓度为290-300 mOsm L-1
用ddH <2：O>补足1L
冰冷切片ACSF（约300毫升）
股票ACSF
2 mM氯化镁
1 mM氯化钙
恢复ACSF（〜150毫升）
股票ACSF
1.5 mM氯化镁
2 mM氯化钙
用于后续电生理或电流记录的实验性ACSF（约550 ml）
股票ACSF
1.3 mM氯化镁
2 mM氯化钙

致谢

这项工作得到了两项菲利普基金会的资助以及授予T.P.的人类前沿科学计划长期奖学金（LT000010 / 2013）和两项授予P.G.H.的NIH / NINDS R01奖学金（NS037585和AA020183）的支持。谁也是GliaCure的创始人。作者声明不存在利益冲突。我们感谢Jaclyn M. Dunphy对本协议的仔细校对。

参考

Garré，J.M.，Yang，G.，Bukauskas，F.F。和Bennett，M.V。（2017）。用于研究神经胶质激活的急性小鼠脊髓切片准备 ex vivo 。 Bio-protocol 7（2）：e2102。
Papouin，T.，Dunphy，J.M.，Tolman，M.，Dineley，K.T。和Haydon，P.G.（2017）。中隔胆碱能神经调节调节海马NMDA受体的星形胶质细胞依赖性门控以调整清醒状态 < Neuron 94（4）：840-854 e847。
Papouin，T和Haydon，P.G。（2018）。脑切片或其他组织外植体的D-丝氨酸测量 Bio-protocol 8（2）：e2698。