材料和试剂

移液器吸头
1. 0.1-10μl容量（USA Scientific，目录号：1111-3700）
2. 1-200μl容量（VWR，目录号：89079-474）
3. 容量100-1,250μl（VWR，目录号：53508-924）
PCR 8孔管条（VWR，目录号：20170-004）
50毫升离心管（VWR，目录号：89039-660）
1.7 ml微量离心管（MIDSCI，目录号：AVSS1700）
真空驱动和一次性瓶顶0.22微米过滤器（默克，目录号：SCGPT05RE）
平底，96孔板（Greiner Bio One International，目录号：655180）
纯化的呼肠孤病毒储液（参见Berard和Coombs，2009; Kobayashi等人，2010，用于繁殖和纯化过程）
碎冰
标准SDS-PAGE材料和试剂（例如，10％SDS-聚丙烯酰胺微型凝胶）
考马斯亮蓝染色和脱色溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610435）
柠檬酸小牛血（科罗拉多血清公司，目录号：31023）
漂白剂（Biz4USA，Janitorial Supplies，目录号：CLO30966CT）
2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇（Tris）（MP Biomedicals，目录号：02103133）
氯化钠（NaCl）（Merck，目录号：SX0420-3）
0.1N盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：2104）
0.1N氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：2105）
N-α-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）处理的胰凝乳蛋白酶（Worthington Biochemical，目录号：LS001432）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
异丙醇（Avantor Performance Materials，Macron，目录号：3032-02）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：21600044）
氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
超纯脱氧核糖核酸酶/无RNA酶的蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10977015）
Triton X-100（TX-100）（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
50％的漂白剂（见食谱）
病毒存储缓冲区（VB）（请参阅食谱）
2毫克/毫升TLCK处理胰凝乳蛋白酶（见食谱）
100毫米苯甲基磺酰氟（PMSF）（见食谱）
补充有2mM MgCl 2（PBS Mg）的磷酸盐缓冲盐水（参见食谱）
10％Triton X-100（TX-100）（见食谱）

设备

个人防护设备（PPE）
1. 实验室外套
2. 手套
3. 眼睛保护
生物安全2级（BSL-2）实验室设施
BSL-2认证的组织培养罩
固体和液体废物容器
高压灭菌器
真空泵和吸气器
冰桶
-20°C冷冻机
微量移液器
1. 0.1-2.5μl容量（Eppendorf，目录号：3123000012）
2. 2-20μl容量（Eppendorf，目录号：3123000039）
3. 20-200μl容量（Eppendorf，目录号：3123000055）
4. 100-1,000μl容量（Eppendorf，目录号：3123000063）
数字pH计（VWR，型号：SB70P）
数字实验室天平（梅特勒 - 托利多，型号：PB1502-S）
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：ND-1000）
热板搅拌器（VWR，目录号：12365-382）
磁力搅拌棒（VWR，目录号：58948-273）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：S1000TM）
温控水浴（VWR，目录号：89501-466）
凝胶成像系统（LI-COR，型号：Odyssey®Classic）
酶标仪（Molecular Devices，型号：FilterMax F5 Multi-Mode）
250毫升玻璃烧杯（VWR，目录号：89000-204）
1000毫升玻璃烧杯（VWR，目录号：89000-212）
100毫升量筒（VWR，目录号：65000-006）
1000毫升量筒（VWR，目录号：65000-012）
100毫升储存瓶（VWR，目录号：89000-234）
1000毫升储存瓶（VWR，目录号：89000-240）
注：此产品已停产。

软件

Image Studio Lite（LI-COR）
SoftMax Pro（Molecular Devices）

程序

产生感染性亚病毒颗粒（ISVPs）
1. 如先前所述（Berard和Coombs，2009; Kobayashi等人，2010）繁殖和纯化呼肠孤病毒毒粒。使用NanoDrop分光光度计，通过测量纯化的病毒原液在260nm处的光密度（OD 260 = 1，OD 260 = 2.1×10 -1， > 12颗粒/ ml）（Smith等人，1969）。
2. 在8孔管条的1根管中，将2×10 11病毒体稀释到90μl冰冷的VB中（见食谱）。
3. 加10μl冰冷的2mg / ml TLCK处理的胰凝乳蛋白酶（见食谱）到稀释的病毒中。
  上下移液3-4次注意：对于未消化的对照，用10μl冰冷的VB取代10μlTLCK处理的胰凝乳蛋白酶。
4. 在32°C的热循环仪孵育反应20分钟注意：在这些条件下，σ3被降解（Joklik，1972; Borsa等，1973a），而μ1被裂解（Nibert和Fields，1992; Chandran等，1999）。 >
5. 消化后，通过加入1μl100mM PMSF淬灭糜蛋白酶活性（参见食谱）。
  上下移液3-4次
6. 在冰上孵育反应20分钟
7. 为确认产生了ISVP，在10％SDS-聚丙烯酰胺微型凝胶上每泳道运行2×10 10个颗粒。
  在200V恒定温度下运行凝胶40-45分钟
8. 通过考马斯亮蓝染色显示蛋白质条带（见数据分析，图1）。
9. 将ISVPs储存在冰上，2-3小时内进行溶血实验。
牛红细胞（RBCs）的制备
1. 在冰上或4°C执行所有步骤
2. 将1毫升柠檬酸牛血液转移到微量离心管中。
  注：柠檬酸牛血液应在抽签日期的2周内使用。
3. 在500gxg离心5分钟沉淀RBCs 注：红细胞是溶血实验膜的来源。
4. 吸出并丢弃上清液。
5. 在1毫升冰冷PBS（参见食谱）中重悬红细胞。
  轻轻地上下移液
6. 重复步骤B3-B5，直到造粒后上清液保持澄清。
7. 以30％（体积/体积）浓度重新悬浮在冰冷PBS中的RBCs。
  轻轻地轻弹管子的一边注意：使用微量离心管上的体积标记来评估RBC颗粒体积。
8. 将红细胞储存在冰上，立即用于溶血实验
ISVP诱导的溶血试验
1. 在单独的离心管中，在冰上组装下列反应物：
  1. 33.3μlVB +3.7μl30％RBCs（0％溶血对照）
  2. 30.3μlVB +3.7μl30％RBCs +3μl10％TX-100（100％溶血对照，见食谱）
  3. 3.3μlVB +3.7μl30％RBCs +30μlISVPs
2. 通过轻轻地轻弹管子的侧面来混合反应。
3. 孵育反应1小时（T3D呼肠孤病毒）或2小时（T1L呼肠孤病毒）在37°C在水浴。
  注意：在这些条件下，诱导了ISVP对ISVP *的转换（Chandran等，2002; Sarkar和Danthi，2010），并释放了μ1-来源的成孔肽（Nibert等，1991; Chandran等，2002; Odegard等，2004; Nibert等，2005; Zhang等，2005; Agosto等，2006; Ivanovic等，2008）。 >
4. 将反应物放置在冰上20分钟。
5. 在500gxg离心5分钟沉淀完整的RBCs 注意：这个步骤应该在4°C。
6. 将20μl上清液转移到96孔板的各个孔中。
7. 用80μl的VB稀释每个转移的上清液。
  上下移液3-4次
8. 为了量化释放的血红蛋白的量（即RBC裂解），使用酶标仪在405nm处测量稀释的上清液的吸光度（em）。在SoftMax Pro软件中记录 A 值。
9. 计算溶血百分比（见数据分析）。

数据分析

产生感染性亚病毒颗粒（ISVPs）
1. 使用凝胶成像系统和Image Studio Lite软件记录和分析结果（图1）。
  1. 病毒体含有λ1,2,3，μ1C，σ2和σ3。
  2. ISVPs包含λ1,2,3，μ1C，δ和σ2。
  注意：δ的出现，μ1C的损失以及σ3的损失表明从病毒粒子到ISVP的转变。 λ1,2,3和σ2应保持不变。
  
  图1.呼肠孤病毒和ISVPs的SDS-PAGE凝胶
ISVP诱导的溶血试验
1. 所有的溶血实验都应该重复进行至少三次独立的重复。
2. 使用以下公式计算溶血百分比：
  
  [（
  ）]×100
  1. 缓冲
  2. TX-100 代表来源于VB，RBCs和TX-100的上清液。
  3. 样品
3. 当比较不同呼肠孤病毒毒株的溶血能力时，使用学生t检验来计算p值。
4. 使用图形软件绘制溶血百分比。
  注意：对于T3D呼肠孤病毒，在37°C孵育1小时后，通常会观察到40-60％的溶血。

笔记

如果可能的话，所有的程序都在BSL-2认证的组织培养罩中进行。
实验室人员应使用适当的PPE。
所有的固体废物都是在处理之前进行高压灭菌。
所有的液体废物在处理之前都用50％的漂白剂灭活。

食谱

50％漂白
在储存瓶中，将50ml 100％漂白剂稀释到50ml超纯H 2 O中，
病毒储存缓冲液（VB）（10mM Tris，pH 7.4,15mM MgCl 2和150mM NaCl）
1. 在玻璃烧杯中，将以下成分溶解在900ml超纯H2O2中：
  1.21克Tris
  3.05克MgCl2•6H2O 2 O. 8.77克NaCl
2. 使用磁力搅拌棒在搅拌板上在室温下混合
3. 用0.1N盐酸调节至pH7.4
4. 在量筒中，用超纯水将终体积加至1000毫升
5. 将溶液转移到储存瓶中
6. 通过高压灭菌消毒
7. 在室温下储存3。
2毫克/毫升α-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）处理的胰凝乳蛋白酶
1. 在离心管中，将100mg TLCK处理的胰凝乳蛋白酶溶于50ml超纯H 2 O
2. 在室温下轻轻颠倒管子直至溶液变澄清
3. 将1ml等分试样转移至微量离心管中
4. 在-20°C储存
100毫米苯甲基磺酰氟（PMSF）
1. 在微量离心管中，将17.4mg PMSF溶解在1ml异丙醇中
2. 在室温下轻轻颠倒管子直至溶液变澄清
3. 在-20°C储存
补充有2mM MgCl 2（PBS Mg）的磷酸盐缓冲盐水
1. 在玻璃烧杯中，将以下成分溶解在900ml超纯H2O2中：
  9.55克Dulbecco磷酸盐缓冲液
  0.41g MgCl 2•6H 2 O.
2. 使用磁力搅拌棒在搅拌板上在室温下混合
3. 调整到pH值7.4
4. 在量筒中，用超纯水将终体积加至1000毫升
5. 通过0.22μm瓶顶过滤器过滤消毒
6. 在室温下储存
10％Triton X-100（TX-100）
1. 在玻璃烧杯中，将以下成分溶解在80ml超纯H2O2中：
  0.12克Tris
  0.31g MgCl 2•6H 2 O 0.88g NaCl
  10ml的100％TX-100
2. 使用磁力搅拌棒在搅拌板上在室温下混合
3. 调整到pH值7.4
4. 在量筒中，用超纯水将终体积加至100ml
5. 将溶液转移到储存瓶中
6. 通过高压灭菌消毒
7. 在室温下储存

致谢

该协议是从以前发表的研究（Chandran等人，2002; Sarkar和Danthi，2010）改编的。在该出版物中报道的研究得到了国立卫生研究院的过敏和传染病研究所的支持，奖项号码分别为1R01AI110637（至P.D.）和F32AI126643（至A.J.S.），印第安纳大学布卢明顿分校。内容完全是作者的责任，不一定代表出资者的官方观点。作者宣称没有利益冲突。

参考

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