材料和试剂

实验室外套和防护手套
记号笔
细胞培养瓶T75（SARSTEDT，目录号：83.1813.001）
细胞培养板24孔（SARSTEDT，目录号：83.1836）
血清移液器
2毫升吸管（SARSTEDT，目录号：86.1252.001）
5毫升吸管（SARSTEDT，目录号：86.1253.001）
10毫升吸管（SARSTEDT，目录号：86.1254.001）
25毫升吸管（SARSTEDT，目录号：86.1685.001）
无菌塑料环
1μl塑料环（SARSTEDT，目录号：86.1567.050）
10μl塑料环（SARSTEDT，目录号：86.1562.050）
猎鹰管
15毫升管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
50毫升管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
移液器提示
20-200μl容量（SARSTEDT，目录号：70.760.502）
50-1,000μl容量（SARSTEDT，目录号：70.762.100）
5μm孔径过滤器（VWR，目录号：514-4106）
细胞培养板96孔（SARSTEDT，目录号：83.3924）
细菌培养皿，92×16毫米（SARSTEDT，目录号：82.1473）
5毫升注射器（VWR，目录号：613-3940）
250毫升真空过滤装置，0.22微米（SARSTEDT，目录号：83.1822.001）
细菌菌株：脑膜炎奈瑟球菌血清群C菌株FAM20野生型和ΔpilC1（Rahman等，1997）。细菌菌株FAM20是在ATCC（ATCC，目录号：700532）可获得的FAM18的萘啶酮酸抗性突变体。
25％甘油：75％GC液体培养基（见食谱）-80℃。
细胞系：咽上皮细胞系FaDu（ATCC，目录号：HTB-43）
注意：细胞系在-140℃下储存在90％FBS：10％DMSO中。
70％乙醇
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
DMEM高葡萄糖，GlutaMAX TM补充物，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：31966047）。
胎牛血清（FBS），热灭活（西格玛 - 奥德里奇，目录号：F9665）。
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）。
磷酸缓冲盐水（PBS），10倍浓缩（StatensVeterinärmedicinskaAnstalt，产品目录号：992442）
GC琼脂培养基（NEOGEN，Acumedia，目录号：7104A）。
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）。
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G8540）。
硝酸铁（Sigma-Aldrich，目录号：F3002）
注：此产品已停产。
羧化酶（Sigma-Aldrich，目录号：C8754）。
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：S7900）
蛋白酶蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0085）。
淀粉，可溶（Sigma-Aldrich，目录号：S9765）
磷酸氢二钾（Sigma-Aldrich，目录号：60353）
磷酸二氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：60218）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
胰蛋白酶-EDTA（0.5％），无酚红，10x（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15400054）。
GC琼脂平板（见食谱）
凯洛格的补充（见食谱）
羧化酶溶液（见食谱）
2x胰蛋白酶（见食谱）
1％皂素（见食谱）
磷酸盐基GC液体培养基（见食谱）

设备

II级生物安全柜（，，Esco Micro，型号：Airstream Max）
在37℃和5％CO 2亚环境（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heracell > TM 150i）
细胞培养罩（例如，ESCO层流柜，Esco Micro，型号：Airstream Gen 3）
倒置显微镜（，，卡尔蔡司，型号：Axiovert 40℃）
分光光度计（例如，Bio-Rad Laboratories，型号：SmartSpec Plus）
血细胞计数器（例如，VWR，目录号：631-0923）。
吸管男孩（例如，Fisher Scientific，型号Fisherbrand电动移液管控制器）
移液器
（例如，Eppendorf，产品目录号：4924000053）。
（例如，Eppendorf，目录号：4924000088）。
多通道移液器，10-100μl容量（Eppendorf，产品目录号：3125000036）
设置在37℃的水浴（例如Grant Instruments，型号：Sub Aqua Pro，目录号：SAP12）。
离心机
1升烧瓶
高压灭菌器

程序

小心：脑膜炎奈瑟氏菌被指定为II类病原体。所有细菌培养物的制备都应在II类生物安全柜内按照国家生物安全指南进行仔细的处理。在处理细菌的过程中，穿上实验服和防护手套。使用前后用70％乙醇去除工作表面。取下手套后洗手。所有与细菌接触的物质都应作为传染性/生物危害性废物丢弃。
第1天

N的增长脑膜炎奈瑟氏球菌
1. 野生型和ΔpilC1突变细菌在GC琼脂平板上从甘油储液中划线（参见食谱）。
2. 在5％CO 2环境的培养箱中37°C孵育板过夜16-18小时。
制备细胞培养物（在无菌条件下在细胞中工作）
注：细胞系FaDu保持在含有10％FBS的DMEM中，每3-5天以1:3或1:6的比例分开。在实验前一天需要75cm2（T75）来制备一个24孔板，下面在步骤2a-2d中给出的所有体积都是作为起始材料给一个75cm 2的烧瓶。细胞系被分类为生物安全级别1.

在37℃水浴中加入10％FBS，无菌1x PBS和2x胰蛋白酶（参见食谱）至少30分钟的DMEM培养基。
用5毫升的1x PBS洗细胞一次。
加入1毫升的2x胰蛋白酶，让细胞分离在37°C的孵化器5分钟。在倒置显微镜下检查细胞，确保没有聚集体可见。
重悬于20毫升预热的补充有10％FBS的DMEM中的分离的细胞。使用10毫升血清移液管混合，直到均化。
用血细胞计数器计数每毫升细胞的数量。将细胞以1.5×10 5个细胞/孔的密度接种到24孔板中。
孵育细胞培养板过夜，并允许在37℃下在具有5％CO 2环境的培养箱中生长至100％汇合（2×10 5），
。
。
注意：使培养的上皮细胞达到100％汇合，消除了脑膜炎奈瑟氏菌滞留在细胞间隙之间的可能性。该程序确保了粘附于上皮细胞而不是任何非生物表面。脑膜炎奈瑟菌粘附于上皮细胞

第2天

粘附分析（在II类生物安全柜中工作）
注：粘附试验之前，OD <子> 600nm的确实等于活菌数10 已经使用了8μg/ ml的cfu / ml用于所使用的细菌储备物。这可以通过系列稀释和电镀到GC板来确定。对于在该实验中所用的细菌种群，OD <子> 600nm的：0:36等于10 8 cfu / ml。
1. 预热DMEM。在实验之前，轻轻地洗涤细胞并加入800μl新鲜的DMEM。在制备细菌培养物时，将细胞培养板保持在37℃，5％CO 2环境的培养箱中。
  注意：在粘附测定过程中，使用不含FBS补充物的DMEM。
2. GC，琼脂平板过夜生长，并重新悬浮在含有2ml DMEM的15ml Falcon管中。使用1毫升移液器上下吸移4次以混合细菌溶液。
  3分钟到管底注意：用于粘附分析的脑膜炎奈瑟球菌细菌培养物不应该被涡旋，因为这可能剪切物质并影响结果。
3. 取1毫升的上清液，转移到含有5毫升DMEM的50毫升Falcon试管中。
  过滤细菌溶液通过5微米的孔过滤器注：脑膜炎奈瑟球菌聚集的水平可以增加附着的细菌数量。因此，我们选择在开始附着测定之前使用溶液中的细菌悬浮液。因此过滤可以防止粘附水平的人为变化。（Eriksson等，2012;Sigurlásdóttir等，2017）。
4. 用分光光度计测量细菌溶液的吸光度。通过用DMEM稀释细菌溶液，将吸光度调节至OD <600> = 0.36（相当于10 8 cfu / ml）。
5. 后，将细菌溶液已被调整至OD <子> 600 = 0:36，稀释溶液10倍（900微升100微升，10当量 7 CFU / ml）中。用1毫升移液管上下移取溶液4次。将200μl的细菌溶液（2×10 6 cfu / ml）加到细胞培养板的相关细胞中。因为如步骤1a所示，指示800μl新鲜DMEM，所以孔中的总体积应为1ml。为确保接种物平均分布，在孔内轻轻地逐滴加入200μl细菌溶液。
  每个细菌菌株应加入三份，至少一式两份注：含感染细胞的多孔板可在感染开始前离心（200×g，5分钟）。离心可以增强宿主与细菌的接触。如果粘着测定在平行进行的时间推移成像，然后离心可能是有用的加速了细菌对宿主细胞（Eriksson等人，2012 ;.Sigurlásdóttir等人2017）的结合。
6. 将细胞培养板转移到具有5％CO 2环境的37℃培养箱中。孵育4小时。
7. 为了确保进行的每个实验的活细胞计数，开始粘附试验孵育之后立即将连续稀释的每种菌株制备的细菌培养物重复进行两次。板上的GC板和孵化过夜，在37°C孵化器与5％CO 2过夜。
  每个实验的实际MOI应该从可行数量计算
8. 孵育4小时期间，将生物安全罩中的2个GC琼脂平板颠倒干燥。用标记笔将GC琼脂平板分成12个正方形（图1A）。该部门希望帮助在同一盘子上发现12种不同的稀释物，从而节省媒体（图1B）。作为需要24个GC板的替代方法，通过使用10μl环将100μl的每种稀释液涂布到GC琼脂平板上。准备系列稀释液，在96孔板（图2）中，在DMEM中制备5个1:10稀释系列，总体积为200μl（180μlDMEM）。
  
  图1.在GC琼脂平板上电镀12个样品的模板。 A. GC琼脂平板分成12个正方形的插图。 B.对于每种细菌菌株（WT-野生型和ΔpilC1三重复），每个样品将四个（-2至-5）稀释液分成琼脂板上的12个方块。
9. 孵育4小时后，将细胞培养板从培养箱中取出。在第二类生物安全柜中工作。通过去除所有的细胞培养基，并添加1毫升新鲜的DMEM轻轻洗三次未结合的细菌。小心尽量不要分离细胞。清洗完毕后，显微镜下应看不到未结合的细菌。在显微镜下，未结合的细菌会以漂浮在生长介质中的游离细菌的形式出现。
10. 在37℃培养箱中用1ml 1％皂苷溶解细胞（参见食谱）于DMEM中10分钟。
11. 从培养箱中取出培养皿，通过显微镜检查细胞。如果细胞没有完全从平板的底部去除，使用无菌平板的末端从底部刮细胞。使用1毫升移液器，混合细胞裂解物上下4次，并转移200微升到96孔板A行（图2）。使用100μl多支管将所有样品混合4次，然后将20μl转移至B列进行-1稀释。使用一个100μl的多管吸管将所有样品混合4次，然后将20μl转移到下一行进行-2次稀释，依此类推。在每次稀释之间更换枪头是非常重要的。重复进行至-5稀释（图2）。
  
  图2.在96孔板中进行稀释系列。向-1至-5孔中加入180μlDMEM。将20μl细胞裂解物（从A行）转移到含有180μlDMEM的B行。混合溶液并继续进行系列稀释，直至完成稀释。
12. 点样50μl的稀释液-2（10 -2 -2），-3（10 -3 -3），-4（10 -4 -4）和-5（10 -5 -5）在GC琼脂平板上标记的每个正方形以获得可数克隆（图1B）。使用移液器吸头或1μl回路将滴落物（如果不是自然发生的话）滴在GC琼脂平板上。
  在转移到培养箱之前让滴液在细菌罩内干燥
13. 将GC琼脂平板在含5％CO 2的37℃培养箱中培养过夜。

第3天

过夜孵育后，计算20-100个菌落稀释的菌落数。

数据分析

为了计算粘附的细菌数量，将菌落数量乘以20，通过稀释获得1ml中的细菌数量，因为只涂布了50μl。为了计算每次稀释的cfu / ml乘以10。例如，如果从第5次稀释计数50个菌落。 50×20×10 5 = 1×10 7。数据可以表示为粘附的细菌（cfu / ml）或附着的细菌/细胞。计算重复/一式三份的平均值。结果可以在Microsoft Excel中以图表形式绘制。
可以计算标准偏差，也可以计算双尾不成对学生t检验分析三种独立的粘附分析。
数据呈现的例子可以在Sigurlásdóttiret al。（2017）观察到。

食谱

GC琼脂平板（1 L）
向1L烧瓶中加入36g培养基并加入600ml蒸馏过的H 2 O 高压灭菌器
用无菌冷蒸馏H 2 O加入至多1L
当温度约为60°C时，加入10毫升凯洛格的补充剂（配方2）把琼脂倒入陪替氏培养皿中，让培养皿冷却下来
存放在4°C的板块
凯洛格的补充（200毫升）
将80克D-葡萄糖溶于100毫升蒸馏过的H 2 O中加入1克L-谷氨酰胺，0.1克硝酸铁和2毫升0.2％羧化酶溶液（方案3）。
当一切都溶解时，加入蒸馏水至200ml。
无菌过滤器，带0.22μm真空过滤装置，4°C储存
羧化酶溶液
在100ml蒸馏水中加入0.02g，带有0.22μm过滤器的无菌过滤器，在4℃下储存。
2x胰蛋白酶

加入5 ml至20 ml的1x PBS，稀释至2x胰蛋白酶
1％皂素
0.1克皂甙，溶于DMEM中并充满10毫升
6.基于磷酸盐的GC液体培养基（500毫升）
溶解7.5克蛋白酶蛋白胨，0.5g的可溶性淀粉，将2克磷酸氢二钾，0.5g的磷酸二氢钾和在450ml蒸馏水<子> 2 O. 2.5克氯化钠溶解后，用蒸馏水和高压灭菌器充满500毫升

确认

这项工作从我们用于先前公布的研究的协议是什么改编（Sigurlásdóttir的等的，2017年）。其由瑞典研究理事会（DNR 2006-4112，2012至2415年，2013年至2434年），瑞典癌症协会和托斯滕•索德伯格Stiftelse资助这项工作。作者声明没有利益冲突。

参考

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