材料和试剂

移液器吸头（Dutscher，ClearLine，目录号：037660CL（10μl）; 032260CL（200μl）; 027120CL（1.000μl））。
50毫升锥形管（Coming，Falcon ，目录号：352070）
20毫升注射器（Terumo，目录号：SS-20ES1）
无菌独立包装的5毫升刻度移液器（Corning，Falcon ，目录号：357543）
无菌的150×20mm细胞培养聚苯乙烯培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientic TM，产品目录号：168381）
10毫升注射器（Terumo，产品目录号：SS-10ES1）
无菌个体针21 G x 1 1/2“（Terumo，目录号：NN-2138R）
15 ml锥形管（Greiner Bio One International，目录号：188271）
0.22μm注射器过滤器（Dutscher，目录号：051732）
96孔微量平板清洁平底（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientic TM，产品目录号：269620）
50毫升注射器（Terumo，目录号：SS-50L1）
Stericup 500 ml（Merck，目录号：SCGPU05RE）
Clinicell®25盒（Mabio International，目录号：00109）
RNA裂解缓冲液（Quiazole，QIAGEN，目录号：79306）
游离甘油试剂（Sigma-Aldrich，目录号：F6428）。
Wako NEFA（SOBIODA，产品目录号：W1W434-91795和W1W436-91995）。
乳酸FS（Diasys诊断，目录号：1400199109）。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）。
葡萄糖GOD FS（Diasys Diagnostics，目录号：1250099100）
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1272）。
ECBM缓冲液（PromoCell，目录号：C-22210）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）。
HEPES 1M（PAA，目录号：S11-001）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
克雷布斯林格粉（西格玛奥德里奇，目录号：K4002）
（ - ）异丙肾上腺素盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：I6504）
人α-ANF（1-28）（R＆D Systems，目录号：1906/1）。
ECBM中等（见食谱）
BSA游离脂肪酸20％（见食谱）
脂肪组织外植体介质（ATEM）（见食谱）
癌症碳酸氢盐碳酸氢盐HEPES 0.1％BSA（KRBHA）（见食谱）
异丙肾上腺素储备液（见食谱）
ANP储备液200μM（见食谱）

设备

P20 pipetman（Gilson，目录号：F123600）
P200移液器（Gilson，目录号：F123601）
P1000移液器（吉尔森，目录号：F123602）
层流罩（更快，型号：BHA36）
无菌钢不锈钢剪刀，直径16厘米（杜卡迪，目录号：005055）
无菌不锈钢修整镊子直径11.5厘米（Dutscher，目录号：711202）
不锈钢圆形针14 G x 6“（Dutscher，目录号：075515）
用于15和50毫升锥形管的冷冻台式离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
37℃，5％CO <子> 2 水夹套培养箱（赛默飞世尔科技，热Scientic TM ，型号：Heracell TM 150 1）
Pipettor PipetGirl（Integra Biosciences，目录号：155 021）。
台式干浴（Thermo Electron LED，目录号：D-63505）
高压灭菌器
-20°C冷冻机
100毫升烧杯（康宁公司，PYREX®，目录：1000-100）
1个烧杯中（Corning，PYREX ®，目录：1000-1L）
微孔板分光光度计（Labsystem，型号：iEMS Reader MF）
pH计（梅特勒 - 托利多，型号：EL20）

软件

Excel 2013
GraphPad Prism6软件

程序

注意：

预热KRBHA缓冲液和ATEM（见食谱）到37°C
该协议在无菌条件下在层流罩下进行。

脂肪组织外植体的制备（图1）
1. 1-2厘米3并将其放入50毫升锥形管中（图1A）。每50毫升锥形管不要超过25毫升的AT外植体（这个数量足以完成4-5 x Clinicell AT外植体）。
2. 剪刀剪2分钟（图1B）
3. 加入20毫升的KRBHA，关闭试管，轻轻混合，倒置试管3-4次。
4. 100×g离心管2分钟（图1C）。
5. 通过使用14g不锈钢套管和20ml注射器去除infranatant（图H-1）。
6. 重复步骤A2-A6，直到可以用5毫升塑料移液管移取移液器。
7. 当AT外植体充分切割时，用20ml ATEM替代KRBHA（见食谱）。
8. 关闭试管，轻轻混匀，颠倒试管，在37℃的台式干浴中放置15分钟。
9. 通过使用14 G不锈钢套管和20毫升注射器（图G-1）去除infranatant。
  
  图1.制备脂肪组织外植体A.切碎前的AT片段; B.开始2分钟切碎; C.在第一次切碎，洗涤和离心后的外植体中; d-F。每张照片显示2分钟后用剪刀和添加ATEM和100×g离心后的脂肪组织外植体的方面。 G-我。在最后一次ATEM洗涤后的外植体中，休息15分钟并使用14g不锈钢套管和20ml注射器除去infranatant。
诊所填充（图2）
1. 在引擎盖下，取一个150毫米的无菌培养皿，并使用下部。
2. 每个Clinicell准备10毫升的预热ATEM在一个50毫升的锥形管。对于异丙肾上腺素和ANP的脂解，终浓度通常分别为1和0.5μM。考虑到ATEM中盒的总体积分别为异丙肾上腺素和ANP的1.33和0.667μM。
3. 填充与21 G针连接的10毫升注射器。
4. 打开诊所的一侧和另一侧，以填补临床与AT外植体（图2B）
5. 取下外罩下的AT外植体，用14G不锈钢插管和20毫升注射器抽吸ATEM。
6. 移取3.5 ml的AT外植体和5 ml移液管连接移液器（图2B）。
7. 使用连接到21G针的10ml注射器一侧完全填充诊所，并轻轻倾斜（图2E-2F）。当介质水平靠近另一侧的顶部（图2G）时，关闭此侧并完全填满盒子并关闭第二侧（图2H）。
8. 通过旋转运动将诊所倾斜并将其水平放置在150mm培养皿中（图2I），轻轻混合AT外植体和培养基。
9. 将所有系统放入培养箱（37°C，5％CO 2）中，并保留一段时间。通常4小时的孵育时间足以研究短期的脂肪分解。
  。为了研究脂肪组织基质细胞的长期效应，孵育时间可以延长至48小时
  
  图2.诊所盒带的填充。 A.在填充前处理诊所B-d。用5ml移液管用AT外植体填充诊所; E-H。使用连接到21G针的10ml注射器用ATEM完成诊所的填充; I.在培养箱中培养之前，将培养皿置于培养皿中。
外植体和培养基回收（图3）
1. 准备15毫升锥形管，10毫升注射器和不锈钢插管。
2. 将诊所从培养箱中取出，在层流罩下转移。大力倾斜（图3B）打开一侧后，把它竖直地15ml锥形管上方，然后打开第二侧，并让外植体和所述媒体倒出来（图3C-3E）。
3. 100 g离心管2分钟。
4. 使用连接到不锈钢插管的10毫升注射器回收条件培养基（图3F）。完成后，注射器和套管垂直返回，吸入1毫升空气，丢弃套管，将0.22微米的过滤器连接到注射器，并过滤条件培养基（图3G）。
5. 在-20°C或-80°C下将等分的条件培养基进行长期储存。
  在-20°C保持300至500μl的等分试样进行代谢物测定。
6. 所述AT外植体可以或者使用胶原酶消化以分离基质血管级分和成熟脂肪细胞被离解或在0.5ml RNA裂解缓冲液的加入0.5mL等分并冷冻并储存在-80℃。
  
  图3. AT外植体和条件培养基的回收A.孵育后24小时外植体的外观; B至E。 AT外植体和培养基的回收; F.在100×g离心后回收条件培养基; G.代表性摄影的外植体和介质经过0.22微米的过滤器过滤后。
脂解和代谢物测定（图4）。
甘油和游离脂肪酸的测定可以使用96孔微量培养板和微孔板分光光度计进行。通常，20μl的培养基足以用于甘油和NEFA的测定，而对于葡萄糖和乳酸盐则为5至10μl。标准曲线进行在ATEM介质除了葡萄糖酮所有其在PBS（在ATEM培养基中的葡萄糖浓度，全部完成这大约是5.5毫米，如果为了进行测量，以便能够计算葡萄糖之间的葡萄糖消耗[差在ATEM和AT外植体条件培养基中的浓度]）。所获得的数据的例子如图4所示。

图4.人类AT外植体的条件培养基中的典型代谢物测定。数据表示4至8次实验的平均值±SEM。在1μM的β-激动剂异丙肾上腺素或在500nM的ANP诱导的脂解可持续指定的时间。 Cont代表没有药物的基础状况。

数据分析

使用Excel 2013和GraphPad Prism6软件进行数据计算和分析。

食谱

ECBM介质
加入2.5 ml庆大霉素溶液，每500 ml一瓶ECBM
BSA游离脂肪酸20％（50毫升）
1. 在37℃预热在100ml烧杯中的40ml ECBM培养基
2. 重量10克BSA在50毫升锥形管
3. 在ECBM培养基的顶部添加BSA，让其在37°C溶解
4. 使用ECBM
  将pH值调节至7.4，完成至50 ml
5. 使用连接到50毫升注射器的0.22微米过滤器消毒
6. 在4°C储存几个星期
脂肪组织外植体培养基（ATEM）（100ml）
1. 添加1毫升1M HEPES和2.5毫升的20％BSA游离脂肪酸到97.5毫升ECBM
2. 调整到pH = 7.4
3. 在与真空连接的500ml Stericup上通过0.22μm过滤消毒
4. 在4°C储存
癌症碳酸氢盐碳酸氢盐HEPES 0.1％BSA（KRBHA）（1 L）
1. 在一个15毫升的锥形管中加入1,260克碳酸氢钠。
2. 重量2.38克的HEPES在一个15毫升的锥形管
3. 在1升的烧杯中放入HEPES，碳酸氢钠和一瓶Krebs林格粉。
4. 加入950ml的ddH 2 O
5. 添加5毫升的20％BSA，无FFA（方案2）。
6. 调整pH值到7.4
7. 用ddH <2> O完成体积至1L
8. 在与真空连接的500ml Stericup上通过0.22μm过滤消毒
9. 在4°C储存
异丙肾上腺素储备液（10mM）
1. 称重5毫克的异丙肾上腺素，并在2.018微升的双蒸水稀释。
2. 通过0.22μm过滤消毒
3. 制成50μl等分试样并储存在-20°C
ANP原液200μM
1. 在812μl无菌水中稀释0.5 mg人ANP。
2. 制作10μl等分试样并储存在-20°C

确认

这项工作得到了INSERM和Clarins Dermocosmetique的财务支持。我们感谢Rangueil医院美容外科的Grolleau-Raoux收集AT样本。这个方法最近由我们的小组发布（Gao等人，2016）。作者没有冲突或利益冲突的披露。

参考

高，H.，长凳，F.，Sandhow，L.，Galitzky，J.，阮，T.，埃斯泰夫，D.，乻tr歮-H，G.，Mejhert，N.，勒杜，S.，Thalamas，C.， Arner，P.，Guillemot，JC，Qian，H.，Rydén，M.和Bouloumié，A。（2016）。 CD36是具有显着的生脂和甘油三酯积累潜在的人类脂肪细胞祖细胞的标志物。干细胞 35（7）：1799-1814。
Lafontan，M.（2012）。脂肪细胞生物学历史观脂肪细胞作为激素和代谢途径上午生理学杂志细胞生理学 302（2）的研究的模型：C327 -359。
Large，V.，Peroni，O.，Letexier，D.，Ray，H.and Beylot，M。（2004）。在人类脂肪细胞白脂质的代谢的影响。糖尿病代谢 30（4）：294-309。
Robdel，M.（1964）。分离的脂肪细胞的代谢的影响。 I.对葡萄糖代谢和脂肪分解代码激素的影响的生物化学杂志 239：375-380 ..
阮，H.，Zarnowski，M. J.，库什曼，S.W。和洛迪什，H. F.（2003）。从小鼠的附睾脂肪垫初级脂肪细胞的标准隔离诱导的炎症介质和下调基因脂肪细胞代码生物化学杂志 278（48）：。47585-93。