材料和试剂

移液器吸头1,000μL，200μL，10μL（Gilson，目录号：F1735001，F1733001，F1732001）。
1.7毫升PosiClick管（Denville Scientific，产品目录号：C2170）
2.0毫升安全锁管（Eppendorf，目录号：022363352）
质谱瓶和瓶盖Vex Kit，9 mm，PP，300μl+ PTFE /硅胶，预切口（Phenomenex，样本号：AR0-9992-13）。
不锈钢珠5毫米（QIAGEN，目录号：69989）
手套（Denville Scientific，目录编号：G4161）。
样品盘
VanGuard墨盒架（WATERS，目录号：186007949）
XBridge BEH Amide 2.5μmXP Vanguard Cartridge，2.1 x 5 mm（WATERS，产品目录号：186007763）。
XBridge BEH Amide 2.5μm，2.1 x 100 mm色谱柱XP（WATERS，目录号：186006091）
Acquity UPLC色谱柱在线过滤器套件（WATERS，产品目录号：205000343）
MilliQ水-18mΩ，0.22μm过滤器（Merck，目录号：MPGP04001）
乙腈Optima LC / MS（Fisher Scientific，目录号：A955-4）。
醋酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：73594-25G-F）。
氢氧化铵TraceMetal等级（Fisher Scientific，目录号：A512-P500）。
氩气压缩气体（Airgas）
氯仿（Fisher Scientific，目录号：C298-1）。
甲醇最佳LCMS（Fisher Scientific，目录号：A456-4）。
氮气（Airgas，目录号：NI230LT230RB）
溶剂A（见食谱）
溶剂B（见食谱）
密封洗（见食谱）

设备

移液器（P1000，P200，P20，P10）
离心机（Eppendorf，型号：5430 R，目录号：022620511）
涡流
ACQUITY H-Class UPLC（沃特斯，型号：ACQUITY UPLC H-Class）
Bath Sonicator（VWR，产品目录号：97043-976）
高速Vacuum-Vacufuge Plus（Eppendorf，型号：Vacufuge plus，产品目录号：022822993）
TissueLyser II（QIAGEN，目录号：85300）
Xevo TQ-S Micro（WATERS，型号：Xevo TQ-S Micro）

软件

MassLynx版本4.1
TargetLynx XS
R（版本3.3）

程序

提取极性代谢物
使用如下所述的改进的Bligh-Dyer方案提取极性代谢物（Bligh和Dyer，1959，Tambellini等人，2013）。除非另有说明，否则在冰上进行提取。
1. 对于每个样品应该标记一组用于收集极性代谢物的1.5ml微量离心管。分析所需的生物学重复的次数取决于研究，对于高度控制的模型，其范围可以从少至5到数百到数千人类研究。
2. 在开始提取方案之前，应准备以下物质并进行冷却：
  1. 2：1甲醇：氯仿混合物（每个样品300μl）。
  2. 纯甲醇（每个样品100μl）
  3. 水（18mΩ，0.22μm过滤）（每份100μl）
3. 因此应该将离心机冷却到4℃。
4. 应将样品置于冰上解冻。
  注意：
  1. 较小的样本大小可以成功使用。例如，在Krishnaiah等，2017中使用了1×10 6个U2OS细胞。
  2. 如果提取组织，应使用2ml安全锁定微量离心管。
5. （可选）如果需要定量，则应在这些样品中添加以代谢物为基础确定浓度的稳定同位素标记内标。
6. 一旦取样，如果提取细胞沉淀，按照步骤A6a或如果提取组织A6b。
  1. 细胞团块的提取：
    1. 向每个样品中加入300μl冷的2:1甲醇：氯仿混合物。
    2. 将每个微量离心管涡旋直至形成均匀的混合物。图1A显示了一个代表性的终点。
      注意：涡旋时细胞团粒可能不会被均质化，因此对样品进行超声处理是必不可少的。
    3. 接下来，将样品在35kHz下在浴超声波仪中超声处理15分钟。图1B显示了一个有代表性的终点。
    4. 超声处理结束后，将样品置于冰上。
      
      图1.提取过程中代表性终点的实例A.向其中加入300μl2:1甲醇：氯仿的细胞沉淀提取的实例并涡旋。 B.超声处理后细胞提取的一个例子（步骤A6a.iii）。 C.在离心结束时（步骤A10至A11）显示含水层（1）和有机层（2）。
  2. 使用TissueLyser II提取组织：
    1. 放置在-80°C预冷组织匀浆块
    2. 每个组织样本，小心添加300μl的冷2：1甲醇：氯仿混合物。
    3. 接下来，使用预冷块（使用手套的手柄），使用Tissue Lyser II将组织样品以25Hz匀化4分钟。
    4. 在均化结束时，将样品放回冰上。
7. 接下来，将100μl的水和氯仿加入到每个含有样品（细胞团或组织）的微量离心管中。
8. 然后将样品再次涡旋直至形成均匀的混合物。
9. 为了分离极性和非极性代谢物，将包含样品的微量离心管在4℃以18.787xg（RCF）离心7分钟。
10. 现在将样品小心地放在冰上，以避免分离层的破坏。
11. 接下来，仔细收集含有极性代谢物的上层（在图1C中表示为层1）到预标记的微量离心管组中。（如果需要，可以以类似的方式收集含有非极性代谢物的较低部分（在图1C中表示为层2）。）
  注意：建议在实际样品之前对测试样品进行提取程序。
12. 然后将微量离心管在速度真空下干燥4小时或直至干燥。
13. 在完成干燥后，代谢物可以如下所示重新悬浮或储存在-80℃
  注意：储存在-80°C的干燥样品不同化合物对代谢产物的影响不同，因此建议在提取后立即进行LC-MS分析。 >
重新悬浮并制备用于LC-MS的极性代谢物
1. 样品制备顺序应该产生一个随机的顺序。
2. 在分析开始时，除了10个平衡（EQ）样品以外，还将使用最少5个空白（参见本节步骤B13，了解有关准备EQ和QC样品的信息）。接下来，样品将进行4个质量控制（QC）样品。分析结束时，每6至10个样品，一个QC想要添加到2个QC（图2）。请注意QC注射之间的间距可能会有所不同，可能取决于样品数量。更好的质量控制频率（例如，每6个样品）提供更强大的数据校正，但需要更多样品。
  
  图2.显示样品运行的示例。应在分析开始时运行至少5个空白（蓝色），然后是10个平衡样品（绿色）。接下来是4个质量控制样品（红色），待分析样品（紫色），然后是2个质量控制样品。
  在整个分析过程中，6个样本可以从6到10个样本变化
3. 1：1乙腈：水组成的稀释剂应事先准备和冷却
4. 另外，离心机应该冷却到4℃。
5. 干燥的极性代谢产物，稀释剂以及样品盘应置于冰上
6. 含有干燥的极性代谢物的微量离心管以及空白的微量离心管。同样，将代谢物的体积重新悬浮在样品范围内并进行调整以确保它们被代谢。适当稀释代谢物可确保更长的柱寿命。
7. 然后将每个离心管涡旋至少20秒，以重新悬浮代谢物。
8. 接着，在离心机的18.787微量离心管7分钟×g的（RCF）在4℃下作为额外的预防步骤来清理样品。
9. 然后如下将各样品的上清液等分：
  1. 5微升被添加到一个微离心管，以产生一个汇集的质量控制（QC）样品。例如，如果要运行10个QC样品，则如果要添加20μL，则将需要至少200μL到每个小瓶。）
  2. LC-MS样品瓶中至少添加20μl，用于分析每个重复样品。（两种分析重复的最小，理想地3建议。）体积加入到每个小瓶中取决于注射体积为注射量的范围可以从2至10微升。（已经注意到较小的注射量可以产生更好的色谱。）
    注意：建议您使用1.5 ml HPLC瓶。
10. 根据预先随机的运行顺序将LC-MS样品瓶置于样品盘中。
11. 将90μl的空白（或足够的空白数量）加入到LC-MS小瓶中并放入样品盘中。
12. 一旦所有的样品都被分装，合并的QC样品被涡旋以确保均一性。
13. 从汇集的QC样品：
  1. 通过用稀释剂（1：1乙腈：水）将QC样品稀释10倍来制备平衡样品。
  2. 将20μl添加到质量规格的样品瓶中，并将样品瓶放在样品盘中的适当位置。（小瓶的数目取决于总QC样品上进行运行，并加入到小瓶中的体积变化的基础期望的注射体积。）
14. 将90μl的EQ样品加入到LC-MS小瓶中并放入样品盘中。音量可以根据EQ的数量进行调整。
通过UPLC-MS获取数据
然后使用通过COLMeD方法优化的方法（Rhoades and Weljie，2016）通过UPLC-MS分析极性代谢物。以下程序应作为获取质谱仪培训人员数据的指导原则。
1. 溶剂A是根据配方1新鲜制备的。另外，存在足够的溶剂B（配方2）和密封剂洗涤剂（配方3）。如果不准备溶剂。
2. 在XBRIDGE BEH酰胺柱（2.5微米100×2.1毫米）柱前在线过滤器和先锋在40℃的温度下，利用色谱柱用于与Waters Xevo三重四极杆质谱联用的Acquity（H-Class）UPLC系统。
3. 样品管理器的温度设定为8°C。
4. 另外，在分析过程中，氮气压力应保持在100PSI以上。
  使用氩气作为碰撞气体
5. 在分析开始之前，溶剂管线，密封清洗和样品管理器都已准备就绪。另外，使用100％乙腈洗涤针头。
  在开始分析之前，质谱仪至少要运行30分钟
6. “色谱柱维护和使用手册”概述如下。
7. 表1用于每次进样的LC进样方法。每次注射的运行时间是30分钟，然后是1分钟的密封洗涤。
  
  表1. LC参数
8. 在MSMS模式中用于质谱仪的参数在表2中示出，并且用于电喷雾正离子模式和负离子模式。
  
  表2.正面和负面模式的MS参数
9. 注入2μl的空白和平衡样品，而2-10μl的进样体积用于质量对照样品和样品。
10. 采用多反应监测（MRMs）处理样品，其中338种代谢物以其质荷比为目标。 MRM产生除了沃特世的IntelliStart软件和标准利用数据库METLIN（史密斯等人，2005年）和HMDB（威沙特等人，2013），以及（Basu和Blair，2011，Yuan等人，2012）。扫描代谢物及其设置（过渡和锥体和碰撞电压）中的表S1 。

数据分析

使用TargetLynx软件如上所述通过LC-MS采集的数据。总强度色谱图，整合它们并获得离子计数（图3）。

图3.显示总强度色谱图的示例。在这里，甲硫氨酸的高峰被识别并使用TargetLynx进行整合，导致离子计数为994753.69。
目标TargetLynx现在被导出到一个文本文件，在R进一步处理。
在R中，定制的脚本用于去除QC样品少于50％的代谢物。该QC样品，以便用于拟合一个交叉验证局部估计散点图平滑函数（LOESS）每一代谢物（唐恩等人，2011），以便在的过程中考虑到仪器漂移分析用于离子计数的标准化（图4）。 Waters的TargetLynx软件。）
标准化离子计数，然后用于进一步的统计和多元分析。

图4.显示的样本数据集的主成分分析（PCA）平均两个分析重复的两个果蝇基因型（富民和不眠）的PCA示出质量控制（QC）样品的在数据分析过程中的各个步骤的群集。 LESS校正（B）QC样品（红色）在LOESS校正和归一化（A）之前显示。
在LOESS校正数据（C）的中位倍数变化归一化之后，QC样品保持紧密聚集

笔记

上述提取方案已经在细胞沉淀的分析被利用（Krishnaiah 等人，2017），肝（Krishnaiah 等人，2017年），全果蝇（。马奎尔等人，2015年），和脑组织（麦格拉思等人，2008）以及其它样品类型：诸如等离子体（Banoei 等。，2017），血清（丽怡等人，2016和豪等人，2016），cereberal脊髓液生物流体，酵母（Tambellini ，2013和2017）等我们也强烈建议没有任何结果通过包含提取或类似的矩阵，以确认的保留时间和裂解谱分析未标记的标准之前的稳定同位素标记的内标物进行验证。

食谱

溶剂A
95：5水：乙腈
20 mM醋酸铵
氢氧化铵，pH值为9
在35 kHz超声15分钟
溶剂B
100％乙腈
超声5分钟。
密封清洗
50:50水：乙腈
在35 kHz超声15分钟

确认

D.M.M和S.D.R.通过药理T32培训资助（T32 GM008076）并通过奖励AMW部分支持研究所转化医学和治疗学（ITMAT）跨学科项目在转化医学和宾夕法尼亚大学的治疗项目的支持。项目描述由国家研究资源中心，格兰特UL1RR024134什么支持，现在是国家中心为推进转化科学，格兰特UL1TR000003。内容完全是作者的责任，并不代表NIH的官方观点。上述协议已经从（罗兹和Weljie，2016）并适于（Krishnaiah 等人，2017年）。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。