材料和试剂

1.5ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）。
15 ml锥形离心管（不含DNase / RNase）（Corning，目录号：430052）。
吉尔森 TM EXPERT TM 大学适合吸移管过滤嘴（吉尔森，目录号：F1731031，F1733031，F1735031，F1737031）
凝胶加样移液枪头（Fisher Scientific，目录号：02-707-139）。
大口径移液枪头（Fisher Scientific，目录号：02-707-134）。
无菌聚苯乙烯一次性血清移液器（Greiner Bio One International，目录号：710180）
血清移液器
2毫升血清移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-11C）。
5毫升血清移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-11D）。
10毫升血清移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-11E）。
25毫升血清学移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-11）。
150厘米 2 排出组织培养瓶治疗中（Corning，隼®，目录号：355001）
100毫米TC处理的细胞培养皿（Corning，Falcon ，产品目录号：353033）
细胞刮刀（Fisher Scientific，目录号：08-100-242）。
HFF细胞（来自ATCC HFF细胞的替代来源：HS27（ATCC，目录号：CRL-1634））（从耶鲁皮肤病研究中心获得）
DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D7777）
最小基本培养基（MEM）非必需氨基酸，100x（Thermo Fisher Scientific，目录号：11140076）。
0.05％胰蛋白酶-EDTA与酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：25300054）。
10x PBS（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）
无核酸酶的水（未经DEPC处理）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9937）。
TRIzol TM试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：15596026）。
RNase AWAY TM表面去污剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：7002）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）。
乙醇，分子生物学级（Fisher Scientific，目录号：BP2818-500）。
异丙醇，分子生物学级（Fisher Scientific，目录号：BP26184）。
GlycoBlue TM 共沉淀（15毫克/毫升）（赛默飞世尔科技，产品目录号：AM9516）
TURBO DNA-free TM试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM1907）
抗m3G帽，兔多克隆，抗血清（突触系统）*
评级：*突触系统停止生产抗m3G帽，兔多克隆抗血清。创造性的诊断具有兔抗TMG抗体（抗M3G帽多克隆抗体，创意诊断，目录号：DPAB29202）也将是一个类似于我们以前使用但实验条件必须被重新评估
蛋白G Sepharose 4 Fast Flow Beads（GE Healthcare，产品目录号：17061801）
正常兔血清（对照，EMD Millipore，目录号：NS01L-1ML）。
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S671-3）。
NP-40（Thermo Fisher Scientific，目录号：28324）。
Tris碱（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）。
盐酸（HCl）（VWR，目录号：BDH7204-1）。
RNasin TM Plus RNase抑制剂（Promega，目录编号：N2611）
NaOAc（AMRESCO，目录号：0602）
乙二胺四乙酸（EDTA），pH8（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G）。
乙二胺四乙酸（EDTA）（AMRESCO，目录号：0105）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9822）
苯酚/氯仿/异戊醇; 125:24:1混合物，pH4.5（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9720）。
琼脂糖LE（Denville Scientific，目录号：CA3510-8）。
iScript TM cDNA合成试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：1708891）。
Sso Advanced TM Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad Laboratories，目录号：1725274）
PARIS TM Kit（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM1921）
硼酸（Fisher Scientific，目录号：A73-1）。
NET-2缓冲区（见食谱）
G-50缓冲液（见食谱）
1倍TBE（见食谱）

设备

微量移液管（Gilson，型号：Pipetman L，目录号：F167370）
FORMA TM 免缝周期 TM CO <子> 2 培养箱（Thermo Scientific的，型号：FORMA TM 免缝周期^{TM培养箱，目录号：370）}
-80°C冷冻
SORVALL TM 图例 TM 微21R微量（赛默飞世尔科技，型号：SORVALL TM 图例 TM 微21R目录号码：75002490）
的Eppendorf TM Thermomixer中 TM R（的Eppendorf，型号：Thermomixer中R，目录号：05-412-401）
Labquake TM Tube Shaker / Rotator（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：C4152110Q）。
SORVALL TM ST 40R离心机（赛默飞世尔科技，型号：SORVALL TM ST 40R，目录号：75004525）
纳米滴 TM 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司，型号：纳米滴 TM 2000，目录号：ND-2000）
T100 TM热循环仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：1861096）。
CFX Connect TM实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1855200）
紫外透照器

程序

板HFF细胞在无血清DMEM补充有以低密度MEM非必需氨基酸（约1×10 6 细胞/150厘米 2 烧瓶）。在5％CO 2的潮湿空气中37°C孵育HFF细胞48小时（图1）。
说明：
1. 为了获得足够的RNA用于每个实验中，使用4至6150厘米 2 烧瓶中。
2. 在无血清DMEM中培养HFF细胞;洗70-80％汇合的HFF细胞英寸（100毫米TC处理的细胞培养皿）用10ml磷酸盐缓冲盐水各三次，加入1ml 0.05％胰蛋白酶与酚红以分离细胞，加入10毫升的无血清DMEM培养基和将细胞收集在15ml锥形管中，通过在室温下以300xg离心沉淀细胞，并在无血清DMEM补充培养基中重新悬浮沉淀。
3. 由于培养基不含有FBS以使胰蛋白酶失活，因此在重新接种之前从HFF细胞中去除胰蛋白酶是重要的。
通过在冰上刮瓶收集HFF细胞，在4℃下300g×5g颗粒沉淀，并用2ml磷酸盐缓冲盐水洗涤。细胞沉淀可以在-80冻结℃，直到RNA提取（细胞沉淀必须保持在冰上直到用TRIzol TM 裂解）（图1）。
注意：
1. 为了沉淀HFF细胞，从细胞中除去无血清的旧DMEM，并加入3ml新鲜的无血清DMEM。使用细胞刮刀的刀片收集烧瓶角落的细胞。在冰上的细胞中加入1-2％体积的FBS或BSA以帮助造粒。
  使用TRIzol™试剂按制造商的说明书从粒状细胞中提取RNA。
2. 在这个协议中的所有步骤应在无RNA酶的长椅面积通过使用RNA酶AWAY TM 表面净化剂喷雾和擦拭最表面区域包括微型移液管和冰桶来进行。
1. 在1ml TRIzol TM试剂中重悬在冰上解冻的细胞沉淀5分钟以裂解。
2. 加入氯仿（TRIzol TM试剂体积的20％），充分混合样品，并在室温下孵育2-3分钟。
3. 离心机样品在12000 ×g的在4℃下15分钟以分离红色的苯酚 - 氯仿（红/下层），界面和wässrige相位（清零/上层）。
4. 用异丙醇（0.5体积的原始TRIzol TM试剂）在室温下收集层和沉淀RNA 10分钟;此时可加入GlycoBlue TM共沉淀剂（15μg）以辅助RNA沉淀。
5. 沉淀通过离心沉淀RNA（12,000×g，4℃10分钟）。
6. 洗涤RNA沉淀用75％乙醇（加在等体积的75％乙醇，以TRIzol试剂 TM 试剂，并简要涡流）中并再沉淀通过在7500离心 XG 5分钟在4℃
7. 空气干燥的RNA沉淀几分钟，重新悬浮在无核酸酶的水中。
  注意：不要完全干燥RNA沉淀，因为它很难再悬浮。在55°C孵育10分钟可以帮助溶解RNA。
使用来自TURBO DNA-free TM试剂盒的DNA酶根据制造商的方案消化RNA样品中的DNA污染物：
1. 将RNA与10x TURBO DNase缓冲液（0.1体积）和1μlTURBO DNase混合。
2. RNA在37°C孵育20分钟，并通过添加脱氧核糖核酸酶灭活试剂（0.1体积）停止反应。
3. 孵育5分钟间歇搅拌RNA样品通过轻弹管然后以10,000 ×g的离心在室温下搅拌2分钟。
4. 收集RNA（上清液）并用NanoDrop TM 2000分光光度计定量。
注意：从每个烧瓶中获得的平均总RNA量为1.5-2μg。
预负荷蛋白G琼脂糖® 4个快速珠粒与兔血清对照或抗M3G帽抗体（图1）。
注意：使用大孔移液管尖端或夹前端关闭吸管头，以帮助蛋白质的转移G琼脂糖 ® 4个快珠子。
1. 洗蛋白G琼脂糖四次® 4个快速珠（40微升浆料/ IP样品）各用1ml NET-2缓冲液（见配方），使用短30秒的转速为1000 XG <去粒珠。
  等级：在“洗涤”步骤中可以使用未过滤的凝胶装载吸管尖端以帮助防止珠子的意外损失。
2. 稀于500微升NET-2缓冲液洗蛋白G琼脂糖珠，并添加兔抗M3G帽抗体（15微升/ IP样品，将大约150微克）或兔血清对照（15微升/ IP样品，将大约150微克）。为了达到与抗体相等的珠粒加载，仅使用一个微量离心管/抗体;
  在将珠子预加载之后，将珠子等分成单独的管子
3. 在管旋转器上在室温下孵育珠/抗体1.5小时;确保样品实际上是混合。
4. 通过洗涤蛋白G琼脂糖珠除去过量的抗体每5次用1ml NET-2缓冲液（短30秒转速为1.000 ×g的）;在NET-2缓冲液中重悬珠（50μl/样品）。
5. 将抗体结合的蛋白G琼脂糖珠分装到1.5微量离心管中;每个样品使用一种抗体（抗M3G帽和对照）。
用蛋白G Sepharose珠预清除RNA以减少非特异性结合：
1. 添加的RNasin加RNase抑制剂（1微升）以RNA（10微克/微升500与NET-2缓冲液中稀释），并在85℃下孵育3至5分钟
  注意：加热后立即将RNA切成冰块，以避免重新折叠RNA。
2. 加热后，再加入1μLRNasin Plus RNase抑制剂至RNA。
  注意：请记住AWAY用RNase擦拭管 TM 开口之前的表面去污剂，以防止RNA的可能的污染和降解
3. 旋转RNA用40微升的NET 2洗涤的蛋白G琼脂糖4快流珠（没有抗体）处理2小时，在4℃（10微克/每个抗体样品）慢慢地（无振动）
4. 1.000克xg离心RNA 2分钟以去除预清除珠粒。
旋转预澄清RNA缓慢（无振动）用抗M3G帽或控制预加载蛋白质G琼脂糖® 4个快速珠粒对4至16小时，在4℃下确认样本正在混合（图1）。
通过在1,000 ×g的 2分钟离心收集珠并去除上清液（保存250微升提取RNA）。
用1ml的NET-2缓冲液洗涤珠子5次，使用1.000gxg的短暂30秒自旋。
注意：可以将RNasin Plus RNase抑制剂添加到NET-2缓冲液中（请参阅食谱）以防止RNA降解。
用250μlG-50缓冲液重悬微珠（参见食谱）以洗脱TMG封端的RNA（图1）。
通过酚 - 氯仿 - 异戊醇（PCI）提取纯化RNA（即从TMG封端的耗尽的上清液中提取RNA）
1. 在G-50缓冲液中加入250μl酚 - 氯仿 - 异戊醇到RNA中。
2. 持续20秒涡旋RNA样品（10向上和10成角度的），并离心样品10分钟，在12,000 ×g的在室温下。
3. 50μl的3M醋酸钠（NaOAc），pH5.2。
4. 加入1ml 100％乙醇（预冷至-20℃）以沉淀RNA;可以添加1μl的GlycoBlue来帮助沉淀RNA并使颗粒可视化。
5. 在-20°C孵育RNA 48小时
6. 通过在4℃下将样品在12,000×gg离心10分钟来沉淀RNA。
7. 吸取乙醇，用500μl75％乙醇（预冷至-20°C）洗涤RNA沉淀。
8. 通过在4℃以12,000×gg短时间旋转1分钟重新沉淀纯化的RNA，并抽吸75％乙醇。
9. 将干燥的m3G-封端的RNA沉淀溶于无核酸酶的水（20至30μl）中。
注：从每个实验（5瓶）获得的平均下拉m3G-封端的RNA的量为1.5-2μg。
通过使用的iScript TM cDNA合成试剂盒和RT-PCR M3G封端的RNA 2X SsoAdvanced TM SYBR ® Green超PCR雅丁制造商的方案：
注意：使用未处理的RNA（输入）和从上清液中提取的RNA进行RT-PCR以确定RNA（m3G-封端的和未封端的）的表达水平。
1. 混合5微升M3G加盖的RNA与5x iScript反应混合物（0.2体积）和1微升iScript逆转录酶。
2. 过程RNA成cDNA中通过进行下述条件的热循环：25℃5分钟，46℃20分钟，95℃1分钟，并在4℃下保持该反应可以储存在4°C短期储存或-20°C长期储存。
3. 混合得到的cDNA（总的cDNA反应混合物的周围1/4）用2x SsoAdvanced TM SYBR ® Green超（0.5体积）和所需的正向和反向引物（12.5 UM股票; 0.04卷）。
4. PCR产物：95℃1.5分钟; 40个循环：95℃30秒，60℃30秒。
5. 将PCR产物跑1％琼脂糖凝胶在100V进行2小时（用1x TBE [见配方]和溴化乙锭制造），和条带与一个紫外透射仪成像。
  
  图1.本协议的主要步骤图

数据分析

（TMG）的回收加帽的RNA什么通过公知的超甲基化的RNA的RT-PCR扩增测量值：诸如小核RNA（snRNA启动）U7（图2）或小核仁RNA（的snoRNA）U3（Martinez的等。，2017）。

的图2（TMG）的RNA免疫沉淀在静态人类加帽初级miRNA的（PRI-miRNA的）包皮成纤维细胞（HFFS）。 RT-PCR的数据显示在静止期HFFS小学-的miR-34a和小学-MIR-3188的RNA免疫沉淀（以及作为阳性对照的snRNA U7），但不小学-MIR-423使用抗体对（ TMG）加帽的RNA。装载有对照抗体（正常兔血清，密理博）或15微升总RNA使用Trizol试剂，其提取，RNA的10微克，其稀释在NET-2缓冲器，预澄清，并用蛋白G琼脂糖4个孵育Fast Flow的珠识别（TMG）帽（抗-m3G帽，兔多克隆，突触系统）的抗体。用NET-2缓冲液漂洗珠子5次，并重新悬浮在G-50缓冲液中。通过苯酚 - 氯仿 - 异戊醇萃取从珠中提取RNA并重新悬浮于20μl无核酸酶的水中。免疫沉淀的三甲基化的加帽的RNA使用的iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad公司），然后通过RT-PCR，其转化成cDNA，并在凝胶电泳后可见。

笔记

该协议可以通过从新鲜培养的细胞（PARIS TM 试剂盒）核和细胞质RNA级分的分离进行修改，以确定矿TMG-加帽的RNA的位置。

食谱

注意：所有的试剂都应该用无核酸酶的水和高压灭菌器制成。

NET-2缓冲区
150 mM NaCl。
0.05％NP-40
50mM Tris-HCl，pH7.4
G-50缓冲液
20 mM Tris，pH 7.5。
300 mM NaOAc。
2mM EDTA，pH 8
0.25％SDS
1x TBE
216克Tris基地
110克硼酸
80ml 0.5M EDTA，pH8
1.5升的水。
（将溶液带到pH 8.3）

确认

我们感谢Dr. Joan Steitz的实验室共享这个协议的一部分。 I.M.，J.A.B.和K.E.H.得到了西弗吉尼亚大学基金会（2V882）的部分支持。 K.E.H.这是由美国VFW辅助女士（CK 003229）支持的。 M.X.由NIH资助R00 CA190886支持。 J.A.S.霍华德休斯医学研究所的调查员。该协议是从以前的工作进行修改（Yu等人，1998）。我们没有任何利益冲突或利益冲突。

参考

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