材料和试剂

猎鹰锥形离心管，15毫升（康宁，目录号：430055）
（Eppendorf，产品目录号：0030120086和0030120094）。
直径90mm的培养皿（Thermo Fisher Scientific，Sterilin TM，目录号：101R20）
消毒牙签（福建福华，福华方圆，目录编号：855）
通过随机插入诱变产生的莱茵衣藻突变体（Cagnon et al。，2013）
One Shot TM TOP10化学感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：C404010）
Zero Blunt TM TOPO TM PCR克隆试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：450245）
Taq DNA聚合酶（5,000U ml -1），10x标准Taq反应缓冲液，dNTP（New England Biolabs，目录号：M0273S） br />
二甲亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：472301）
PCR级H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：W1754）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：34852）
KOD Xtreme热启动DNA聚合酶，dNTPs（各2mM），2x Xtreme缓冲液（Merck，Novagen，目录号：71842）。
琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
ExactLadder®DNA PreMix 2 log（OZYME，目录号：OZYC002-500）
SYBR TM Safe DNA凝胶染色（Thermo Fisher Scientific，目录号：S33102）
UltraPure TM 10x TAE缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：15558026）
Luria肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L1900）
硫酸卡那霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：11815024）
NucleoSpin凝胶和PCR清洁试剂盒（MACHEREY-NAGEL，目录号：740609.10）
NucleoSpin 质粒小量制备试剂盒（MACHEREY-NAGEL，目录号：740588.10）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（Sigma-Aldrich，目录号：H9151）
异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：W292907）
苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（Sigma-Aldrich，目录号：P3803）
蛋白酶K（20.0mg ml -1）（Sigma-Aldrich，目录号：P6556）
裂解缓冲液（见食谱）
1. 0.7 M NaCl
2. 10％SDS
3. 0.5M Tris-HCl，pH8.0
4. 10 mM EDTA
5 M KCl（见食谱）
10％CTAB（见食谱）
10％DMSO（见食谱）
1.0％琼脂糖凝胶（见食谱）
1倍TAE（见食谱）
70％乙醇（见食谱）

设备

Shaker（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：Innova 44，目录号：M1282-0002）
Accumet TM pH计（Fisher Scientific，型号：3合1套装，产品目录号：13-636-AE153）
PCR热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：2720，目录号：ED000651）
琼脂糖电泳槽（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-Sub Cell GT，产品目录号：1704401）
Gel Doc XR系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Gel Doc TM XR +，目录号：5838）
Fisherbrand TM公共台式涡旋器（Fisher Scientific，目录号：02-216-125）
台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra 64R，目录号：367586）
台式培养箱（Eppendorf，新不伦瑞克TM，型号：S41i，目录号：S41I230011）
NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 2000，目录号：ND-2000）
Multisizer 3 Coulter计数器（Beckman Coulter，型号：Multisizer TM 3，目录号：6605697）

软件

SPSS程序（版本19.0）

程序

DNA提取和定量
1. 在摇瓶中于25℃恒定的白色荧光下（约0.5×10 6个细胞ml -1）培养莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）细胞（约0.5×10 6个细胞/毫升）在TAP液体培养基（Harris，2001）中，用轻微摇动的100μmol光子m 2 / m -1。通常在24小时后它将达到指数期（约5×10 6个细胞ml -1）。
2. 用CTAB方法分离和纯化突变体的基因组DNA（Schroda等人，2001）。简而言之，细胞生长至对数期后（约5×10 6个细胞ml -1），收获总共5×10 7个细胞通过离心并悬浮于500μl裂解缓冲液（100mM Tris-HCl，pH8.0,1.75mM EDTA，150mM NaCl，2％[w / v] SDS和1.0mg ml -1蛋白酶K）。
3. 在55°C孵育裂解物2小时，然后加入80μL5MKCl和70μL预热的10％CTAB并在65°C孵育10分钟。
4. 用（500μl）苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，v / v / v）提取裂解物两次，然后加入（500μl）氯仿以除去剩余的苯酚。
5. 在冰上通过加入500μl异丙醇将核酸沉淀20分钟，并用70％冷乙醇洗涤。
6. 在50μl无菌水中重悬空气干燥的颗粒。
7. 使用NanoDrop 2000量化纯化的DNA，加入水调节终浓度为50ngμl-1。
  注意：所提及细胞的浓度是用Multisizer 3 Coulter计数器测量的。
PCR扩增
该程序主要遵循González-Ballester等人（2005）首次发表的方案。为了鉴定插入位点周围的DNA序列，需要两组后续的PCR反应，这里命名为第一和第二扩增。第一次PCR扩增是用一种简并引物（图1）使用一种AphVIII基因特异性引物从突变体的基因组DNA扩增片段。为了增加扩增的机会，可以检测4个简并引物，每个引物都含有序列特异性部分（5'端的Q0）和简并部分（3'端）。 PCR产物将用作第二轮PCR扩增（第二次PCR扩增）的模板，使用两个序列特异性引物。包括Q 0的简并引物（deg Taq I，Deg Pst I，Deg Alu I和Deg Sac II）和标记基因（emphVIII）特异性引物（RB1和RB4）显示在表1中。

图1. RESDA PCR的主要部分概述此电路图改编自González-Ballester 等，2005年。

表1.本协议中使用的引物及其序列

肌苷，N，A + T + G + C; S，G + C; W，A + T.
*基因特异性引物（RB1和RB4）可以根据标记基因的类型（即， AphVII ，
> aadA ）用于诱变。
1. 第一次放大
  在第1次扩增中，使用AphVIII基因特异性引物（RB1）和一个简并引物扩增抗生素标记基因AphVIII侧翼的片段来自从突变体纯化的基因组DNA。四个独立的反应可以通过使用四个不同的简并引物和RB1分别建立。
  PCR反应混合物的组成和循环程序分别显示在表2和表3中
  表2.用于1强扩增的PCR反应混合物的组成扩增
  
  *先使用一种简并引物。
  
  表3.用于1次扩增的PCR条件
  
  *每个循环依次包含十三个步骤;共设置了二十个循环。
2. 第二次放大
  为了获得更多特异性PCR产物，使用简并引物5'末端的制造者基因特异性引物（RB4）和特异性引物（Q0）用来自第一次扩增的PCR扩增作为模板（1μl稀释的PCR产物（1 / 1,000），从1st扩增）。
  PCR反应混合物的组成和循环程序分别见表4和表5
  表4.用于扩增和/或扩增的PCR反应混合物的组成
  
  表5.用于第2次PCR扩增的条件
琼脂糖凝胶电泳和DNA片段纯化
1. 将PCR产物从1.0％琼脂糖凝胶上进行2次扩增，在100V下电泳30分钟，然后用SYBR Safe（1 / 1,000）染色凝胶，并用GelDocXR系统（Bio-Rad Laboratories）。一些代表性的结果显示在图2中，并且通过四个独立的简并引物和RB1扩增后，用RB4和Q0引物进一步扩增的RESDA-PCR成功率的例子示于表6中。
2. 从凝胶上切下充分分离的PCR产物（用*标记），用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up Kit（MACHEREY-NAGEL）根据生产商的说明进行纯化。
  
  图2.使用简并引物DegQ TaqI的RESDA-PCR结果的实例所示的PCR产物是两轮PCR反应的结果：使用Deg > Taq I和RB1，然后用RB4和Q0引物进一步扩增。
  
  注：M指DNA标记（Exact Ladder DNA PreMix 2 log）;每条泳道（1,2,3 ...）指独立单突变体的扩增。黑色星号表示测序前将被克隆的PCR片段，红色星号表示可直接测序的PCR片段。
  
  表6.用四个独立的简并引物和RB1扩增后，用RB4和Q0引物进一步扩增的RESDA-PCR成功率的实例
随后克隆DNA片段
由于校正聚合酶（KOD Xtreme Hot Start DNA聚合酶）产生的回收的PCR产物是平端的，所以在该方案中使用pCR II-Blunt-TOPO载体。其他Taq DNA聚合酶也可用于此步骤。
1. 将回收的片段直接连接到pCR II-Blunt-TOPO载体上。该步骤可以在5分钟内完成，而不向PCR产物的3'末端添加单个脱氧腺苷（A）。如表7中所述将连接反应组分加入管中，轻轻混合并在22℃孵育5分钟。
  注：pCR-Blunt II-TOPO允许通过破坏致死性大肠杆菌基因ccdB直接选择重组体（Bernard et al。，1994）。包含非重组载体的细胞在接种后被杀死。
2. 根据制造商的说明将连接产物转化到One Shot感受态细胞（Thermo Fisher Scientific）中。在含有50μgml -1卡那霉素（37℃过夜）的LB琼脂平板上选择转化子。
  
  表7.使用Zero Blunt TM TOPO TM PCR克隆试剂盒设置克隆反应
测序
1. 对于每个PCR片段，在LB培养基中分别培养三个独立的菌落，并使用NucleoSpin质粒（MACHEREY-NAGEL）按照生产商的说明提取质粒。＆nbsp;
2. 使用T7通用引物对纯化的质粒进行测序，并且对于一个代表性突变体的测序结果的实例显示在图3中。
  
  图3.一个代表性突变体的测序结果示例
  注：AphVIII的部分序列以红色标出，以莱茵衣藻基因组（v5.5）为靶标的序列以黑色标出，未加下划线的序列属于载体（pCR-Blunt II -TOPO）序列。

数据分析

首先将获得的序列轰击AphVIII表达盒以确认RESDA-PRC片段是否含有该盒的序列。如果是这样的话，所获得的序列随后被轰击到C的基因组中。（在Phytozome的v5.5）（Merchant等，<2007年），以鉴定盒插入位点周围的侧翼序列。如前所述，通过分子遗传学和生物化学分析进一步研究了目的靶基因即维持型DNA甲基转移酶和酰基辅酶A氧化酶基因（Kong等人， 2015年和2017年）。所有的实验都进行了三个生物学重复，每个单个菌落（含有PCR片段）的三个质粒分别测序。统计分析采用SPSS程序（版本19.0）进行。

笔记

这种方法很容易适用于其他插入诱变，其中使用除了AphVIII以外的标记基因。在这种情况下需要设计基因特异性引物。
在第一次PCR扩增中，使用不具有校对活性的Taq DNA聚合酶（即，NEB）是必需的（缺少3个'至5'DNA酶活性）以避免与基因组DNA杂交的简并引物（含肌苷）的降解。 DMSO用于减少单链DNA发夹结构中的氢键。我们发现使用Deg Pst I和Deg TaqI I简并引物的扩增产生PCR产物的可能性更高。
在第二次扩增中，发现来自第一次PCR反应的1/1000稀释的PCR产物是具有较高扩增机会的最佳情况。 PCR产物通常在0.8kb至1.5kb的范围内。如果PCR产物具有足够的特异性，则可以直接回收和测序，即不经过克隆步骤。
pCR II-Blunt-TOPO载体可用于随后克隆DNA片段;也可以使用通用TA克隆技术进行亚克隆和DNA测序。

食谱

0.7 M NaCl
加入40.95克NaCl结晶（Sigma-Aldrich）到800毫升无菌MilliQ水中并搅拌直到NaCl溶解，并使最终体积达到1升。
10％SDS
用灭菌的MilliQ水（1:10，w / v）稀释SDS粉末（Sigma-Aldrich）以制备工作溶液
0.5M Tris-HCl，pH8.0
向800ml无菌MilliQ水中加入60.55g Tris基本能量（Sigma-Aldrich）并搅拌直至Tris碱溶解，用pH计用HCl调节pH至8.0以监测pH变化并使最终体积为1L />
4.10mM EDTA
加入2.92克Tris基本能量（Sigma-Aldrich）至800毫升无菌MilliQ水中并搅拌至EDTA溶解并使最终体积达到1升。
裂解缓冲液
将最终浓度（100mM Tris-HCl，pH 8.0，zss10mM EDTA，0.7M NaCl，10％SDS和蛋白酶K（20.0mg ml -1） HCl，pH8.0,1.75mM EDTA，150mM NaCl，2％SDS和1.0mg ml -1蛋白酶K）
5 M KCl
加入372.76克氯化钾结晶（西格玛奥德里奇）到800毫升无菌MilliQ水，搅拌，直到氯化钾溶解，并使最终体积为1升
10％CTAB
用0.7M NaCl（10：100，w / v）溶解CTAB粉末（Sigma-Aldrich）
10％DMSO
用PCR级别H 2 O（1:10，v / v）稀释DMSO（Sigma-Aldrich）至工作溶液。
1.0％琼脂糖凝胶
加入琼脂糖（Sigma-Aldrich）至1×TAE（1：100，w / v）
1x TAE
用灭菌的MilliQ水（1:10，v / v）稀释UltraPure 10x TAE缓冲液（Thermo Fisher Scientific，UltraPure TM），制成工作溶液。
70％乙醇
用无菌MilliQ水（7：3，v / v）稀释乙醇（Sigma-Aldrich）以制备工作溶液。

致谢

这项工作得到了法国国家法律研究所（ANR-Diesalg和ANR-MUsCA）的支持。该协议基于González-Ballester等人发表的协议（2005）。没有利益上的冲突。

参考

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