材料和试剂

Parafilm
0.22微米无菌真空过滤器（Corning 瓶顶真空过滤器，康宁，目录号：430015）
0.45微米过滤器（VWR，目录号：514-4127）
注：0.45微米过滤器适用于鱼类。
30G注射器（BD，目录号：324826）
狭窄的塑料瓶
22-G微型Renathane植入管（Braintree Scientific，目录号：MRE025）
一次性注射器0.3毫升BD针30 G（Insuline）（BD，目录号：324826,320837）
大约20毫米高的软海绵（如Jaece Industries，目录号：L800-D）
果蝇和鱼（任何来源）
FD＆amp; C蓝色染料＃1（Sigma-Aldrich，目录号：861146，SPS Alfachem Ref：101-2912和A＆amp; Z食品添加剂Brilliant Blue FCF（CAS No.3844-45-9），FD＆amp; C Blue 1 ，E133）
荧光素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：F6377-500g）
FD＆amp; C Red＃40，Allura Red（SPS Alfachem）
双蒸去离子水（ddH2O）
Hanks平衡盐溶液（HBSS，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14175053）
缓冲的三卡精甲磺酸盐（西格玛奥德里奇，目录号：A5040）164毫克/升鱼缸水
Moldex（VWR，目录号：25605.293）
蓝色＃1储备溶液（12.8x）（见食谱）
染色的媒体（见食谱）

设备

磁力搅拌器
5升玻璃烧杯
2升玻璃瓶
LED冷白色照明
白色背景
外荧光显微镜尼康Eclipse 80i线虫蓝精灵（尼康，型号：Eclipse 80i）

软件

ImageJ 1.46j及以上
GraphPad棱镜6.01

程序

准备解决方案
见“食谱”部分。
蓝精灵分析
注意：
1. 所有的鱼类工作都是在1986年动物（科学程序）法案和英国内政部批准（PPL 70/8681）之后进行的。
2. 如果蓝色染料以正确的浓度使用，溶解和过滤良好，30分钟潜伏期内不会产生副作用，除了一些暂时的压力和不适。在蓝色孵化后，鱼在分开水的主要水族箱之前应该保持在独立的水槽中至少4小时，以确保所有的染料都被排出体外。
3. 任何潜在不利影响的迹象，例如长时间游泳和喂养受损，应引起NACWO和/或NVS的注意，并且任何明确的或可能的不利影响应该导致使用由个人执行的批准程序扑杀动物注册为证书/持证持有人（10.1089 / zeb.2016.1248）的主管。
标准化审查蓝精灵的条件非常重要。
1. 将个人转移到SA媒体上
  1. 果蝇和线虫：过夜。
  2. 鱼：30分钟
2. 将个体转移到新鲜的正常培养基上以便立即打分
  1. 果蝇：如果您必须处理大量的小瓶，您可能需要一次转移一个小瓶以防止个体在计分前清除蓝色染料。
  2. 线虫可以用荧光显微镜直接在荧光素培养基上检测。
  3. 鱼：冲洗它们，直到连续和独立鱼缸中的个体没有蓝色出现（图5）。
    
    图5.使用“沐浴协议”识别斑马鱼中的蓝精灵。：一种。连续的鱼缸被用来冲洗个人，直到没有进一步的染料排放。 B.WT AB斑马鱼中Smurf和非Smurf个体的代表性图像。
3. 计算对Smurfness（SA +）以及负面（SA-）为阳性的个体。
  然后，人口中Smurfs的比例为 />
4. 然后可以分别监视Smurf和非Smurf个人的进一步分析。
  对于鱼的替代方案（Raquel Martins和Catarina Henriques）：由于蓝色染料通过鱼的皮肤渗透将始终是浸渍方案的混杂因素，因此我们测试了口服蓝色染料遵循Collymore等人发表的成年斑马鱼灌胃方案（2013年）。通过口服灌胃施用5μl溶于Hanks平衡盐溶液（HBSS）中的5％（m / v）过滤的蓝色染料。老年人表现出Smurf表型，而我们没有在年轻人中观察到这一点（图6C）。这种方法需要培训，以防止实验者伤害肠道。然而它是非致死性的，因此可以进一步监测检测后的个体。
  
  图6. Gavage可以识别斑马鱼Smurfs。使用“灌胃方案”（A）获得的Smurf斑马鱼。（B）和分别量化通过肠道泄漏的蓝色色调，并且现在在皮肤上可见，所有六个斑马鱼WT AB个体的6个月和29个月龄使用。（C）从ImageJ中的数字图像中进行量化，选择身体/鱼的三个不同部分，避免蓝色条纹并量化每个区域的像素的中值。所有3种较老的鱼变得比年轻的鱼更蓝（假设正态性和等方差：<0.05或更保守：不等方差t 测试或非参数Wilcoxon秩和检验P ≤0.10）。见视频1.
  
  s视频1
  
  注射前准备：
  1. 在灌胃程序之前，鱼在管饲之前必须禁食24小时或至少4小时，这将清空肠球（胃）内容物。
  2. 在平坦的表面上，在软海绵上做一个切口（10-15毫米深），这将保持注射鱼。
  3. 然后，将海绵放入60毫米的培养皿中。这将持有水，以帮助保持海绵湿润。
  <麻醉，注射和恢复：
  1. 用稀释的Tricaine麻醉鱼并监测鱼的行为。当鱼安静时，将其转移到湿海绵（用三文鱼浸泡），并将海绵移动到垂直位置，如视频所示。
  2. 然后，使用调整到鱼的大小（约2.5厘米）的22-G导管管打开斑马鱼嘴，轻轻插入管，直到尖端超过鳃（约1厘米或管的长度）。植入管不应该被迫。阻力表明管可能击中鳃弓或心脏。因此，如果有阻力，轻轻撤回，重新定位，再试一次。
  3. 当试管完全插入（到达中肠）时，缓慢注入（HBSS稀释5％过滤（0.45μm注射器过滤器）5％（w / v）蓝色1号）。为了精确测量5μl，吸取5μl的溶液到Parafilm上并用注射器抽吸，避免气泡。在注射的同时，确保溶液不会通过鳃或嘴出口。
  4. 在注入所有内容后，将海绵中的鱼取出并放入回收罐中。如图所示，通过观察鱼从嘴里积极排出物质，或者没有运动，可以监测鱼的反流情况。
    一旦鱼类恢复正常，鱼可以放回正常水箱，或者分开存放在配套箱内
蓝色色调测量
使用ImageJ手绘选择工具，在转换为HSB空间的图像（命令图像→类型→HSB堆栈）上选择ROI。然后，通过图片的色相维度中的平均灰度值（分析→设置测量...→平均灰度值）来测量色调。

数据分析

有可能考虑两种不同的方法来比较条件A中的Smurf比例与条件B.

在一个给定的时间点，比较条件A和B之间Smurfs的比例：
1. 使用双侧二项式检验来估计SA +个体在总体群体中的分布差异的统计学显着性，条件B与对照条件A中的分布相比较。我们在（Rera等人，，2011）。由于GraphPad Prism卡方只是一个近似值，可以使用在Excel或R中实现的精确测试。
2. 在条件A和B中，对每个小瓶的SA +个体的平均比例使用Mann-Whitney检验。
在多个时间点上，比较条件A和B中Smurfs的年龄相关比例的斜率和y轴截距。我们最初使用GraphPad Prism（2012年）描述了这种方法（Rera等人，2012年）。计算遵循J Zar，Biostatistical Analysis，第2版，Prentice-Hall，1984年第18章中的方法。它相当于协方差分析（ANCOVA）。类似的方法在混合模型中是可用的，在二项模型背景下，并且如果想要校正实验混淆，例如批处理或其它随机项（Gelman等人，2004），应该考虑相似的方法。 br />

我们建议使用方法2，因为时间趋势确保误报的风险较小。

笔记

确保鱼类沐浴液不含蓝色染料粉末的团块是非常重要的，因为它们往往会粘在鳞片上，使其难以区分Smurf个体。
规范您的Smurf评分条件。
培训多个人认识Smurf个人，并与他们交叉检查自己的得分。
请记住，你所评估的Smurfness个体的遗传背景可能会影响其结果，所以请适应你的评分。

食谱

FD＆amp; C蓝色染料＃1是非常易挥发的深紫色粉末。第一步是将其放入水溶液中。我们在室温下可以达到的最大浓度是320g L -1。这对应于12.8x储备溶液，因为培养基中的最终浓度是2.5g / 100ml（2.5％w / v）。

蓝色＃1储备溶液（12.8x）
1. 将700毫升dH 2 O倒入5升玻璃烧杯中
2. 称重400克蓝＃1粉
3. 轻轻地把粉末倒入装有烧杯的水中
4. 添加磁力搅拌棒
5. 用Parafilm
  盖上烧杯
6. 搅拌，直到粉末完全溶解（通常是几个小时）
7. 用剩余的300ml dH 2 O缓慢冲洗烧杯的壁。
8. 搅拌30分钟
9. 将蓝色溶液真空过滤到无菌瓶中
注意：

对于鱼类：直接在从鱼缸中提取的水中准备1x溶液并将其过滤。
对于荧光素：使用与蓝色＃1相同的步骤。
该溶液优选立即使用或冷冻，并且不在室温下储存，因为其深色不允许观察到任何潜在的污染。

染色的媒介
1. 准备你的标准果蝇食谱（Rera et al。，2011; Katzenberger et al。，2015; Tricoire and Rera，2015; Barekat < 2016）; Regan et al。，2016），水量减少7.8％
2. 煮沸介质后，加入Moldex（VWR）
3. 每100毫升（最后）的食物添加7.8毫升的蓝＃1储备液
4. 彻底搅拌至着色均匀
5. 分配在狭窄的小瓶（过夜SA最少1.25毫升）
注意：

对于线虫：使用与蓝色＃1相同的步骤。尽管在该浓度下荧光素的摩尔质量比蓝色＃1的摩尔质量小2.9倍，但是荧光素不发荧光。这使得可以直接在培养基上直接识别线虫荧光Smurfs。
荧光素溶液直接加到琼脂平板上或与细菌混合。

致谢

这项工作得到了CNRS到M.R的支持。该协议改编自（Rera等人，2012年，Dambroise等人，2016年）。 M.J.P.S.由亨利•惠康爵士和谢菲尔德大学副校长研究员和自然环境研究委员会（N013832）支持。 A.W.McC。由NERC ACCE博士培训计划提供支持。 C.M.H得到一位爵士的支持。维尔康姆信托基金会亨利戴尔奖学金皇家学会和谢菲尔德大学校长奖学金。 R.R.M由谢菲尔德大学博士学位博士研究生支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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