材料和试剂

移液管吸头（USA Scientific，目录号：1111-1800,200μl;1111-2821,1000μl）
玻璃9孔板（PYREX TM Spot Plate，Fisher Scientific，目录号：13-748B）
剃刀刀片（单刃剃刀刀片，斯坦利•布莱克和德克，目录号：28-510）
圆锥形塑料包埋胶囊（电子显微镜科学，BEEM ，目录号：69913-01）
玻璃显微镜载玻片（Fisherfinest TM Premium Frosted，Fisher Scientific，目录号：12-544-2）
显微镜盖玻片（盖玻片），22×50-1（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：12-545E）
塑料保鲜膜
晚三分之一果蝇幼虫
组织冷冻培养基（TFM TM ），clear（通用数据，目录号：TFM-C）
Fluoromount-G （SouthernBiotech，目录号：0100-01）
清除指甲油（，Sally Hansen <硬指甲）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：P330）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Fisher Scientific，目录号：S233）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：C79）
磷酸二氢钠无水（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：S374）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P285）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
正常山羊血清（Jackson ImmunoResearch，目录号：005-000-121）
来自猪皮的明胶（凝胶强度300型A，Sigma-Aldrich，目录号：G2500）
D-蔗糖（Fisher Scientific，目录号：BP220）
叠氮化钠（Fisher Scientific，目录号：S2271）
16％多聚甲醛（Ted Pella，目录号：18505）
冰
干冰
林格的解决方案（见食谱）
4％的甲醛固定（解决方案A ;见食谱）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
PBT（见食谱）
5％正常山羊血清（ ;见食谱）
30％蔗糖（ C ;见食谱）
10％明胶（“D”溶液;见食谱）

设备

解剖显微镜（徕卡生物系统，型号：徕卡MZ6）
细钳（Dumont镊子＃5，世界精密仪器，目录号：500085）
移液管20μl，200μl，1,000μl（Gilson，型号：Pipetman P20，目录号：F123600; Gilson，型号：Pipetman P200，目录号：F123601; Gilson，型号：Pipetman P1000，目录号：F123602）
水浴，50°C（Fisher Scientific，型号：Isotemp TM 205）
低温恒温器（Leica Biosystems，型号：Leica CM1850，带防卷板组件，Leica Biosystems，产品目录号：14041933981）
注：产品“Leica CM1850”已停产。
低温恒温器样品架（样品盘，25 mm，Leica，目录号：14041619275）
超低温冰箱，-80°C（Thermo Fisher Scientific，型号：UXF60086A，目录号：315673H01）
荧光/共焦显微镜（激光扫描显微镜，蔡司，型号：LSM 780）

程序

翅膀成像盘的解剖和染色
注：有关更详细的协议，请参阅Klein（2008）。
1. 在解剖显微镜下：在冷冻林格溶液（参见食谱）中，解剖3龄幼虫，将它们向里翻出来，同时留下连接在尸体上的翅膀成像盘。去除尽可能多的有害组织（脂肪体，肠，唾液腺）
2. 在冰上解决解决方案A （制作新鲜;参见食谱）20分钟。
3. 每次用PBT清洗3次（见食谱）10分钟
4. 在解决方案B （请参阅食谱）中于室温下封闭1小时
5. 按照标准方案进行免疫染色（Klein，2008）。
6. 在解决方案A 后在室温下修复1小时。
7. 用PBT清洗3次，每次10分钟。
嵌入明胶
1. 在玻璃9孔板中，向每个孔中加入300μl50℃的明胶溶液D（明胶，参见食谱）。确保溶液表面平整无气泡
2. 放置在冰上30分钟以使凝胶凝固。
  注意：尽量避免在玻璃9孔板上产生冷凝，因为掉落的液滴可能会稀释明胶溶液并干扰凝胶。
3. 在解剖显微镜下：轻轻地从PBT的尸体上取下翼片。
4. 使用移液管，将翼片转移到 C（蔗糖，参见食谱）的一个孔中并在室温下孵育约60分钟。
5. 通过移液管（约20μl液体）从蔗糖溶液转移到固化明胶上（图2A）。注意：光盘应该直接放在井的中间。
6. 去除尽可能多的液体，确保光盘平放在凝胶上（图2B）。
7. 在翼片顶部再涂上300μl的50°C溶液D（明胶）（图2C）。
  
  图2.明胶包埋过程的示意图A.通过移液管将翼片转移到明胶上。 B.从圆盘周围除去多余的蔗糖溶液。 C.在圆盘上加入300μl明胶。
8. 放在冰上，让凝胶凝固约30分钟。
9. 在解剖显微镜下，使用刀片将明胶切成块状注意：这应该根据冷冻切片的所需取向来完成。例如，如果需要穿过机翼袋背腹侧的横截面，凝胶块的一个面应该垂直于背腹边界（图3A和3C）。
  
  图3.切割明胶立方体中翅片的取向。用DAB染色的翼片可视化表达Wingless＆amp;为了说明，在修剪过的明胶块中进行修补。 A.在明胶立方体中的翼片的俯视图。红线表示立方体的面部，其应该被面朝下地放置到包埋囊中以获得背腹对齐的部分。 B.从A.C.中的箭头所示的方向看翼片的“边缘”视图。一个交替倾斜的立方体，其将允许与背侧边界成45°的区段。红线表示应放置在下方的立方体的面。
10. 准备一个塑料包埋胶囊，用剃刀切割圆锥形尖端（图4A-4B）。
11. 将凝胶块放在塑料包埋胶囊的盖子上（图3B和4C）。
  
  图4.塑料包埋胶囊的制备：一种。塑料包埋胶囊（上述步骤B8）。 B.用剃刀刀片将锥形尖端从胶囊上切下（箭头指示刀片运动）。丢弃圆锥形尖端。 C.将所需的切割面向下放到胶囊盖上（红色方块，箭头所示）。 D.关闭胶囊并用组织冷冻介质从顶部填充（箭头表示添加介质的位置）。
12. 使用组织冷冻介质轻轻地填充胶囊，使大量气泡逸出（图4D）
13. 立即将胶囊放入干冰或-80°C冰箱中。
冷冻切片
1. 从塑料包埋胶囊中取出冷冻的样品。这是通过首先取下盖子，然后用剃刀刀片切除塑料胶囊的其余部分来实现的。
2. 使用组织冷冻培养基将样品固定在冷的（-80°C）切片机样品架上（图5A-5B）。
3. 将低温恒温室设置为-24°C，将固定器放入切片机（图5C）。
4. 切割10-20微米厚的切片。防卷板确保刀片（视频1）的平面部分脱落。
5. 拿起组织切片，轻轻触摸玻璃显微镜载玻片。创建一排部分（视频1）。
6. 在荧光显微镜下检查明胶切片中是否有椎间盘组织，并将其位置标记在切片背面。
7. 在样品上添加Fluoromount-G ®。
8. 将盖玻片放在幻灯片上，用指甲油密封。
  
  图5.准备用于冷冻切片的样品。：一种。一个空的切片机样品架; B.使用TFM固定在固定器上的样品; C.在低温恒温箱中拿着样品。
  
  视频1

数据分析

激光扫描共聚焦显微镜可用于检查组织切片。有关组织切片的形态学背景，请参阅注释1.有关冷冻切片翼片与xz光学切片的比较，请参阅图1。

笔记

可以使用几个标准来判断组织切片的角度是正确的还是稍微倾斜的。椎间盘本身是假复层柱状上皮。细胞核紧密堆积在核层中，占据了上皮的顶端一半。细胞通过管状延伸到达顶端和基底表面。对于通过背囊中心的横向切片（图7）：
1. 翼袋的整体外观是对称的，在中心部分具有相同的高度，而在腹部铰链区域附近具有相对较小的向内曲率（图7A）。
2. 穿过核层的切片出现约四个深的核，大部分局限于上皮的顶端部分（图7A）。通过圆顶形上皮的斜切片可以增加核层的厚度和位置（图7B和7C）。
3. 晚期三龄翼瓣的翼袋中心的上皮高度约为35μm（图7）。
  从更高的表观高度可以明显看出斜切（图7B）
4. 细胞轮廓应平行（图7A）。通过细胞的斜切口主要揭示细胞核周围的圆形轮廓，并且到达顶端和基底表面的管状延伸部分是不可见的（图7B和7C）。
  
  图6.组织切片示例A.通过沿着前后舱边界的翼袋的近乎完美的截面。翅膀的成像盘是一个相对平坦的囊，其中盘适当由假复层柱状上皮组成;一个简单的立方形上皮提供了转换到构成大部分（覆盖）周围膜（PM）的简单鳞状上皮。翼袋是圆顶形的并且被未来的翼铰链的折叠包围（腹侧铰链区域具有特征性的折叠图案）。指示背腹舱边界的位置（箭头，“D / V”）;背面是左边，腹边是右边。 B.由于形状不规则，核层不均匀，通过翼袋的斜切面明显，上皮过高，高度不均匀。 C.尽管大部分在背腹方向上，但该部分在盘上略微“对角”切割。没有明确的平行单元轮廓是明显的。上皮显得过高而且高度不均匀。不均匀的深度和增加的核数（> 4个核剖面）确定了斜切。切片的翅膀袋与椎间盘的其余部分呈一定角度，显露出偏离背腹轴的切口。比例尺A为15μm，B为9μm，C为12μm。
在切割含有组织的明胶（图3）时，在切割过程中明胶保持冷却和刚性以促进精确切割和适当的倾斜是重要的。
为了实现正确的角度切片，明胶切割和冷冻切片步骤是至关重要的。在明胶切割过程中，重要的是要确保翼片完全平坦（图3B）。在冷冻切片过程中，确保切片刀片均匀地切割样品表面是很重要的。
如果荧光显微照片中存在过量的背景，可能有助于：确保明胶是新鲜的;确保组织冷冻介质中不存在染料（推荐使用清亮的TFM）;确保样本正确后置。为了减轻进一步的背景，在使用Fluoromount-G 和盖玻片进行安装之前，可以使用PBT仔细冲洗载玻片上的组织切片。
偶尔，组织中可能会出现孔或空泡。我们相信，如果在该过程中使用不匹配的溶液离子浓度，则会出现这些问题。

食谱

林格的解决方案
对于1.0升解决方案：
6.5克NaCl
0.14克KCl
0.2克NaHCO 3•/ 2 0.16克CaCl 2 2 /
0.01克NaH 2 PO 4 4 用去离子H 2 O和无菌过滤器补足至1000ml
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）
对于1.0升解决方案：
80克NaCl
2克KCl
14.4克Na 2 HPO 4 4 2.4克KH 2 PO 4 4克/克用去离子H 2 O和无菌过滤器补足至1000ml
PBT
对于1.0升解决方案：
100毫升10倍PBS
10毫升10％Triton X-100
用去离子H 2 O和无菌过滤器补足至1000ml
PBS中4％的甲醛
对于1.0毫升的解决方案：
650μl去离子H 2 O
100μl10x PBS
250μl16％多聚甲醛
B液：5％山羊血清PBT
对于1.0毫升的解决方案：
50μl正常山羊血清
950μlPBT
Solution C ：30％蔗糖溶液
对于50毫升的解决方案
15克蔗糖
在H 2 O中50μl10％叠氮化钠用1x PBS补足50 ml
溶液D ：10％明胶溶液
对于50毫升的解决方案：
5克明胶，凝胶强度300，A型
15克蔗糖
在H 2 O中50μl10％叠氮化钠用1x PBS补足50 ml
置于50°C水浴中溶解
短期储存在50°C或长期储存

致谢

我们感谢K. Hanson，J.M. Laumann，A. Snyder，M. Boardman，S. Kaech-Petrie，A. Nechiporuk和特别是M. Deza-Culbertson先生对这种方法的讨论和改进。这项工作得到了NIH（R01GM67029和R01GM103876），NSF（IOS-1021573和IOS-1353799）和医学研究基金会（OR）对M.W的资助。作者没有利益冲突或利益冲突。

参考

Cohen，S.M。（1993）。 Imaginal光盘开发。在：贝特，米和马丁内斯阿里亚斯，答（编辑）。果蝇的发展。冷泉港实验室出版社 pp：747-841。
Culbertson，M. D.，Lewis，Z。R.和Nechiporuk，A. V.（2011）。神经嵴的软骨形成和胶质细胞亚群在上臂神经节装配过程中起着不同的作用。 PLoS One 6（9）：e24443。
Klein，T。（2008）。免疫标记成像盘在：Dahmann，C. （Ed。）。果蝇：方法和实验方法方法Mol Biol 420：253-263。
McClure，K.D。和Schubiger G.（2005）。果蝇果蝇的周围上皮的发育分析和鳞状形态发生。开发 132（22）：5033-5042。
Sui，L.，Pflugfelder，G.O.and Shen，J。（2012）。 Dorsocross T-box转录因子促进果蝇翼的组织形态发生imaginal disc。开发 139（15）：2773-2782。