材料和试剂

微量离心管（1.7毫升）
PCR管（0.2毫升）
T-25和T-175培养瓶（Corning，目录号：430639,431080）
96孔组织培养板（TPP，目录号：92696）
24孔板（TPP，目录号：92024）
22 G钝针（CML Supply，目录号：901-22-100M）
3.0μm孔径47 mm滤膜（GE Healthcare，Whatman，目录号：111112）
10毫升注射器（BD，目录号：309695）
50毫升聚苯乙烯锥形小瓶（Fisher Scientific，目录号：05-539-10）
1升Stericup过滤器（默克，目录号：SCVPU11RE）
13毫米细胞刮刀（TPP，目录号：99002）
47毫米聚碳酸酯注射器过滤器支架（GE Healthcare，Whatman，目录号：420400）
用于Western印迹湿法转移的滤纸（GE Healthcare，Whatman，目录号：3030-917）
硝化纤维素膜（GE Healthcare，Amersham，目录号：10600003）
培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5606）
Gilson移液器吸头（Gilson，产品目录号：F171101，F171301，F171501）
无菌血清移液器（5毫升，10毫升，25毫升）
电穿孔比色杯4毫米（BTX，目录号：45-0126）
pSAG1 :: Cas9-U6 :: sgUPRT质粒（Addgene，目录号：54467）（Shen等人，2014）
pYFP-AID-3HA，Floxed HXGPRT质粒（Addgene，目录号：87260）（Long等人，2017）。
pYFP-mAID-3HA，Floxed HXGPRT质粒（Addgene，目录号：87259）（Brown等人，2017）。
吨。弓形虫RH TIR1-3FLAG（基因型：RHΔ hxgprt Δku80 ; TUB1 ：TIR1-3FLAG，SAG1 ：）（Brown et。，2017; Long et al。，2017）
NEB5α化学胜任的E。用SOC培养基（New England Biolabs，目录号：C2987I）检测大肠杆菌
人包皮成纤维细胞（HFF）（ATCC，目录号：SCRC-1041）
Q5定点突变试剂盒，具有化学能力 E。（New England Biolabs，目录号：E0554S）
用于重编程pSAG1 :: Cas9-U6 :: sgUPRT（IDT，25nmole，标准脱盐）的诱变引物
2x SDS-PAGE样品缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：S3401）
1 kb的DNA梯（新英格兰生物实验室，目录号：N3232）
琼脂糖（Fisher Scientific，目录号：BP160）
SDS-PAGE 4-15％梯度Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：4561086）
6X凝胶加载染料（新英格兰生物实验室，目录号：B7025）
LB肉汤（BD，目录号：244610）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
质粒小量制备试剂盒（Macherey-Nagel，目录号：740588）
M13反向通用引物（5'-ACAGGAAACAGCTATGAC）（Genewiz）
Q5 DNA聚合酶（New England Biolabs，目录编号：M0491）
dNTP各10mM（New England Biolabs，目录号：N0447）
用于扩增（m）AID-3HA的兴趣标签引物基因，具有短同源性侧翼（IDT，25nmole，标准脱盐）的Floxed HXGPRT标签盒
基因目标诊断标记引物（IDT，25 nmole）
琼脂糖凝胶和PCR清除试剂盒（Macherey-Nagel，目录号：740609）
胰蛋白酶-EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：T3924）
ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A6419）
谷胱甘肽（Sigma-Aldrich，目录号：G6013）
霉酚酸（Sigma-Aldrich，目录号：M3536）
黄嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：X4002）
蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P2308）
Taq聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0273）
乙醇（EtOH）（Pharmco-AAPER，目录号：11100020）
GelRed核酸染色剂（Biotium，目录号：41001）
Licor抗小鼠800CW二抗（LI-COR，目录号：925-32210）
Licor抗兔680RD二抗（LI-COR，目录号：925-68071）
小鼠抗HA单克隆抗体（BioLegend，目录号：901501）
不含脂肪的奶粉（雀巢康乃馨）
兔抗醛缩酶（弓形虫）（Starnes等人，2009）或其他T细胞。弓形虫加载对照抗体
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A38-500）
0.5M EDTA pH 8.0（Merck，目录号：324504）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7128）
注：此产品已停产。
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L5750）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A412P）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
磷酸二氢钾（KH 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P8281）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12100046）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
200mM L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030149）
10mg / ml庆大霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：15710072）
表征的胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，目录号：SH30071.01HI）
Hanks平衡盐溶液（Sigma-Aldrich，目录号：H9269）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
EGTA（Merck，目录号：324626）
EDTA（Merck，目录号：324504）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M4880）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
3-吲哚乙酸（IAA /生长素）（Sigma-Aldrich，目录号：I2886）
琼脂（Fisher Scientific，目录号：BP1423）
10X Tris-Acetate-EDTA（TAE）缓冲液（见食谱）
10倍Tris-Borate-EDTA（TBE）缓冲液（见食谱）
10倍SDS-PAGE运行缓冲液（见食谱）
10倍蛋白转移缓冲液（见食谱）
1x蛋白转移缓冲液（见食谱）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水+吐温-20（PBST）（见食谱）
PCR裂解缓冲液（见食谱）
D10中（见食谱）
Hank平衡盐溶液与HEPES和EGTA（HHE）（见食谱）
0.1M KPO 4缓冲液pH 7.6（用于Cytomix缓冲液）（参见食谱）
Cytomix电穿孔缓冲液pH 7.6（Soldati和Boothroyd，1993）（见食谱）
500毫摩尔3-吲哚乙酸（IAA /生长素）（1,000×股票）（见食谱）

设备

高压灭菌器（Steris，型号：SG-120）
台式离心机与15毫升和50毫升锥形小瓶持有人（Eppendorf，型号：5810 R）
生物安全柜（贝克，型号：SterilGuard®II）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma TM 310）。
不含洗涤剂的派热克斯玻璃器皿和搅拌棒用于培养基制备
Electroporator（BTX，型号：ECM 830）
凝胶文件系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Gel Doc TM XR +）
孵化轨道摇床（VWR，型号：3500I型）
倒置相差显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse TS100）
血细胞计数器（Sigma-Aldrich，型号：Bright-Line TM）
Licor Odyssey成像系统（LI-COR，型号：Odyssey®CLx）
微量离心机（Eppendorf，型号：5417 R）
微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM TM One）
微波炉（VWR，目录号：75856-526）
制造商：Argos Technologies，目录号：111092。
移液助剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：S1）
移液器（Pipetman，Gilson，型号：P2，P20，P200，P1000）
蛋白质湿转移印迹仪（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini Trans-Blot®）
冰箱冷冻箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：10ECEETSA）
SDS-PAGE电泳装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-Protean Tetra Cell）
标准轨道摇床（VWR，型号：1000型）
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，型号：Veriti TM 96孔）

软件

Google Chrome（Google）或其他网络浏览软件
Snapgene（Snapgene）或其他质粒浏览软件
Image Studio Lite（LI-COR）或其他凝胶分析软件
Axiovision（卡尔蔡司显微镜）或其他细胞成像软件
ImageJ（由Wayne Rasband开发）或其他图像量化软件
GraphPad Prism（GraphPad Software Inc.）或其他图形和统计分析软件

程序

生成用于C端标记的基因特异性Cas9 / sgRNA质粒
1. 基因组序列检索
  1. 从 www.toxodb.org ，导航到感兴趣的基因（GOI）的基因页面（图2A）。通常在RH TIR1-3FLAG生产线上使用GT1序列。点击基因ID上方的“下载基因”链接（图2A）。
  2. 从ToxoDB.org上的“下载基因”页面，通过选择以下选项下载3'标记区域：选择一个报告：FASTA;序列类型：基因组;地区：翻译站点-80，翻译站点+200;下载类型：在浏览器中显示。选择“获取序列”链接（图2B）。
  3. 从序列检索页面，选择没有FASTA标识符的基因组序列并复制到剪贴板（图2C）。
2. Protospacer选择
  1. 从真核病原体CRISPR指南RNA / DNA设计工具网页（EuPaGDT， http://grna.ctegd.uga.edu / ），首先输入“工作名称”。使用SpCas9建议的默认设置：'20 nt gRNA NGG PAM'。在“基因组选择”选项卡下，选择 T。 gondii血统和数据库（例如， T。gondii GT1 ToxoDB-32）。粘贴从ToxoDB.org复制的基因组序列，并选择“获取指导RNA”（图2D）。
  2. 从 http://grna.ctegd.uga.edu/ 上的gRNA输出页面，选择< （ eg ，STOP-N ... N）下游的NGG PAM 的20nt gRNA原型间隔区序列<100> GATCGACTTAGTAACGCATC
3. pSAG1 :: Cas9-U6 :: sgUPRT的突变（ Addgene＃54467 ）（Shen等人，2014）
  1. 质粒pSAG1 :: Cas9-U6 :: sgUPRT瞬时表达SpCas9-HA-GFP核酸酶和单一指导RNA（sgRNA），其结合Cas9并指导其在TgUPRT基因中进行双链断裂。 Cas9 / sgRNA核酶的基因靶标特异性基于sgRNA的5'端的20nt原型空间序列。要将Cas9目标从 TgUPRT 切换到另一个基因，需要将20 nt原空间序列更改为步骤A2“原型空间选择”中设计的序列。使用Q5定点诱变（新英格兰生物实验室）突变pSAG1 :: Cas9-U6 :: sgUPRT，将20nt TgUPRT原型间隔区改变为针对感兴趣的基因选择的20nt原型间隔区（图2E ）。标准的25μl反应包括：
    1μl（1ng）pSAG1 :: Cas9-U6 :: sgUPRT
    1.25μl（10μM）反向引物：（5'-AACTTGACATCCCCATTTAC）
    1.25μl（10μM）正向引物：
    （5' - （G）NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAGAGCTAGAAATAGC） 9μl去离子H 2 O
    12.5μl2x Q5热启动PCR混合物
  2. Q5诱变热循环
    步骤1.在98℃变性30秒
    步骤2. 98℃10秒变性
    步骤3.在55℃30秒退火
    步骤4.在72℃延伸5分钟
    第5步。重复步骤2-4 24次
    步骤6.在72℃延伸2分钟
    第7步。保持在4°C直到进一步使用。
  3. 在含有1kb DNA梯的0.8％琼脂糖凝胶（TAE或TBE）上分解1μlPCR反应以检测扩增。预期的扩增子大小是9.68 kb。
  4. 激酶，连接酶，消化（KLD）反应（包括在Q5定点突变试剂盒中）
    1μlPCR产物
    3μl去离子H 2 O
    5微升2x KLD缓冲液
    1μl10x KLD酶混合物
    
    在室温下混合并孵育5分钟
  5. 转化NEB5α化学胜任的E。用1μl的KLD反应培养大肠杆菌。在冰上孵育30分钟。在42℃加热化学转化的细胞30秒。添加950μLSOC培养基（新英格兰生物实验室）到转化细胞和孵化在37°C混合1小时。传播100微升转化的E。在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养大肠杆菌。 37°C孵育板过夜。第二天，从每个LB琼脂平板上挑取2-3个菌落，在5ml LB培养液+100μg/ ml氨苄青霉素中过夜培养，用于质粒提取。
  6. 使用台式离心机在3,000g x g下过夜培养细菌培养物10分钟
  7. 用质粒提取试剂盒（Macherey-Nagel）从细菌沉淀中提取质粒DNA。预热灭菌过滤缓冲液EB至70°C。
    用50μl预热的无菌过滤缓冲液EB将DNA洗脱到无菌的1.7ml微量离心管中
  8. 通过分光光度法（260nm / 280nm处的吸光度，NanoDrop（Thermo Fisher））测量DNA浓度和纯度。预期产量约为500-1000 ng /μl。
  9. 通过使用M13反向通用引物（5'-ACAGGAAACAGCTATGAC）（Genewiz）的Sanger测序确认pSAG1 :: Cas9-U6 :: sg“GOI”的突变的原型空间序列。
    
    图2. C末端mAID标签构建体的产生。A-E。生成基因特异性Cas9 / sgRNA质粒。来自ToxoDB.org的TgPKG（TGGT1_311360; C端标记的示例基因）的基因页面。红色箭头指向下载基因链接以获取所需的TgPKG基因组序列。 B.从ToxoDB.org上下载 TgPKG 的“下载基因”页面。红色星号突出显示需要输入的字段，如图所示。红色箭头指向获取序列链接。 C.ToxoDB.org的FASTA基因组序列（来自翻译终止密码子的-80至+200）（其为来自ToxoDB.org的TgPKG（-80至+200）），其为C端标签所需的gRNA和供体同源性设计所需。 D.从EuPaGDT（ http://grna.ctegd.uga.edu/）指导RNA设计工具（裁剪以适合））。红色的星号表示需要完成的基本领域。红色箭头指向“获取指南RNA”链接。 E.来自EuPaGDT的每条链上的TgPKG基因组序列（来自翻译终止密码子的-80至+200）的gRNA原始空间的输出（上方示意图）。选择具有来自EuPaGDT的质量评分的gRNA protospacer和protospacer毗邻基序（PAM）序列（表格）。通过定点诱变（下示意图）将pSAG1 :: Cas9-U6 :: sgUPRT中的TgUPRT原始间隔子与设计的TgPKG原始间隔子交换。 F.产生TgPKG特异性C-末端mAID-3HA，HXGPRT标签盒。来自ToxoDB.org的FASTA基因组序列（TgPKG）（来自翻译终止密码子的-80至+200），具有所示的突出特征。 mAID-3HA的PCR扩增，来自pYFP-mAID-3HA的HXGPRT标签盒，具有供体同源性（40bp）的5'和3'区域的Floxed HXGPRT到TgPKG（侧接Cas9断裂位点）
    分别添加到正向和反向引物（星号）
生成基因特异性AID标签盒
1. Microhomology侧面选择和引物设计
  1. 5'微同源性侧翼是紧接在翻译终止密码子之前的感兴趣基因的最后40个核苷酸。 3'microhomology侧翼将是紧接着选定protospacer / PAM网站的第一个40 nt。通过使用约60个核苷酸的DNA寡聚引物进行PCR，这些侧翼将被附加到（m）AID标签盒（图2F）。
  2. 订购标签引物。标记正向引物将是40nt 5'同源侧翼+ GCTAGCAAGGGCTCGGGC。标签反向引物将是40nt 3'同源性侧翼（反向互补）+ ATAGGGCGAATTGGAGCTCC。我们从Integrated DNA Technologies（ www.idtdna.com ）购买25 nmole DNA寡核苷酸引物，进行“标准脱盐” 。
2. PCR扩增和清理AID标签扩增子
  1. Q5 PCR设置。使用pYFP-mAID-3HA，Floxed HXGPRT（ Addgene＃87259 ）（Brown ，2017）或pYFP-AID-3HA，Floxed HXGPRT（ Addgene＃87260 （Long等人，2017）质粒作为模板（图2F）。标准的500μl反应包括：
    100μl5x Q5缓冲液
    10μldNTPs
    5μL（50μM）标签正向引物（图2F）
    5μL（50μM）标签反向引物（图2F）
    5微升（5毫微克）质粒模板
    5μlQ5 DNA聚合酶
    370μl去离子H 2 O
    将PCR混合物分成5个PCR管，每个100μl
  2. Q5 PCR热循环。
    步骤1.在98℃变性30秒
    步骤2. 98℃变性10秒
    步骤3.在60℃退火30秒
    步骤4.在72℃延伸2.5分钟
    第5步。重复步骤2-4 29次
    步骤6.在72℃延伸2.5分钟
    第7步。保持在4°C，直到进一步使用
  3. 检查PCR质量。在含有1kb DNA梯的0.8％琼脂糖凝胶（TAE或TBE）上解决1μlPCR反应以检查扩增。（m）AID-3HA，Floxed HXGPRT-3'同源性侧翼（预期的扩增子大小：mAID为2.9kb，AID为3.4kb）。
    标签扩增子由5'同源性侧翼接头 -
  4. 用PCR Cleanup Kit（Macherey-Nagel）进行PCR清除。合并5个PCR反应物并添加1,000μl缓冲液NTI。加750μl混合物到DNA柱中。用微量离心机以11000×g离心1分钟。放弃流量。将剩余的750μl混合物装入柱中。在11,000×g下离心1分钟。放弃流量。用700μl缓冲液A3清洗柱子。在11,000×g下离心1分钟。放弃流量。重复洗涤步骤并丢弃流过。再以11,000×g克离心另外3分钟。预热灭菌过滤缓冲液EB至70°C。
    用30μl预热的无菌过滤缓冲液EB将DNA洗脱到无菌的1.7ml微量离心管中
  5. 通过分光光度法（260nm / 280nm处的吸光度，NanoDrop（Thermo Fisher））测量DNA浓度和纯度。旨在为寄生虫转染至少有10微米的标签盒。重复PCR和清理步骤，如果需要更多的DNA。
细胞培养
1. 人包皮成纤维细胞（HFF）培养
  1. 起动器文化。在35ml D10培养基（见配方）中，在37℃5％CO 2培养箱中的无菌T-175培养瓶中培养起始HFF细胞。
  2. HFF通道。一旦融合，取出D10培养基并用35ml无菌1x PBS洗涤并丢弃洗涤液。加入5毫升胰蛋白酶，替换盖帽，孵育细胞在37°C 1-5分钟，直到细胞相互分离（如使用10倍放大倍率检测）。牢牢地轻敲瓶子的侧面几次，使塑料脱离细胞。添加175毫升新鲜的D10培养基胰蛋白酶细胞和混合产生1：5细胞悬液。通过35毫升到新的T - 175。通过5毫升进入T-25s，使HFF饲养瓶支持弓形虫培养。通过96孔板每孔200μl和24孔板每孔1ml用于转染后的寄生虫克隆。
2. 寄生虫文化
  1. 寄生虫信息。 T。弓形虫RH TIR1-3FLAG（基因型：RHΔ hxgprt Δku80 ; TUB1 ：TIR1-3FLAG，SAG1 <因为它为AID系统提供了三个关键要素：△KU80 限制非同源结束连接，减少了AID标记的随机集成卡带; Δhxgprt基于HXGPRT介导的霉酚酸抗性提供了正确选择AID标签盒的正确遗传背景; TIR1-3FLAG是植物生长素受体在生长素诱导的SCF TIR1-靶向蛋白酶体降解标记蛋白质中所需的植物生长素受体。
  2. 寄生虫通道。用RH TIR1-3FLAG寄生虫接种融合的HFF T-25饲养瓶，每两天使用350μl新鲜寄生的寄生虫，或根据需要在自然出口后立即接种。在D10培养基中培养寄生虫在37℃5％CO 2中。
（m）使用CRISPR基因组编辑（例如，TgPKG-mAID-3HA;图3）的AID标记;
1. 寄生虫转染
  1. 培养寄生虫用于转染。在足够RH TIR1-3FLAG寄生虫（95μl新鲜从T-25寄生的寄生虫）中感染在T-25烧瓶中生长的融合宿主细胞以在感染后2天实现约75％宿主细胞裂解。刮单层和通过细胞悬液通过一个22 G钝头针3-5次破坏宿主细胞和释放所有寄生虫。避免使用针棒，并将使用过的针头小心处理到生物危害锐利容器中。预先湿润的3.0μm聚碳酸酯膜通过用10ml注射器将5ml HHE通过过滤器进入废物容器。将注射器溶解的寄生虫通过具有10ml注射器的过滤器放入50ml聚苯乙烯锥形小瓶中。通过过滤器再加入5毫升HHE到50毫升圆锥形中，以从过滤器收集额外的寄生虫。用台式离心机在18℃下离心过滤的培养物10分钟，在10ml HHE中重悬沉淀，用血细胞计数器计数细胞密度，并在相同条件下再次离心。随后，在Cytomix缓冲液中重新悬浮寄生虫细胞沉淀物（参见食谱）以达到4×10 7 ml -1的寄生物密度。
  2. 准备在电穿孔比色皿
    转染混合物 Cytomix缓冲液中有250μl寄生虫。
    10微克GOI特异性CRISPR / Cas9质粒（图2A-2E）
    10μgGOI特异性AID标签PCR扩增子（图2F）
    3μlATP（0.2M，100x）
    3μl谷胱甘肽（0.5M，100x）
    用Cytomix缓冲液调整至300μl。
  3. 电穿孔。 Electroporate寄生虫根据electroporator制造商的指示。我们使用带有4 mm间隙比色杯的BTX ECM-830电穿孔仪，具有以下参数：
    1,700 V
    176微秒的脉冲长度
    2个脉冲
    脉冲间隔100毫秒
    在电穿孔后立即将寄生虫转移到具有融合宿主细胞的新鲜T-25烧瓶中，并在37℃，5％CO 2下生长。
2. 药物选择和寄生虫克隆
  1. 药物选择。在电穿孔和恢复后24小时，使用补充有黄嘌呤（50μg/ ml）的霉酚酸（25μg/ ml）开始用于（m）AID-3HA，Floxed HXGPRT构建体的药物选择。重复传代，直到耐药池变得稳定（通常2-3次直到培养稳定（即每隔两天用350μl接种新鲜出壳的寄生虫溶解单层） >
  2. 通过有限稀释克隆寄生虫。如上所述，在耐药群体的自然出口之后，净化并计数寄生虫。用D10培养基（无药物）稀释纯化的寄生虫以达到3个寄生虫/150μl。随后，将150μl/孔的这种稀释的培养物加入96孔板中，使融合的宿主细胞在37℃，5％CO 2下生长7天，而不移动以允许斑块通过溶解寄生虫复制来宏观地破坏宿主细胞单层）来发展。
3. 筛选克隆用于基因重组
  1. 识别克隆。在斑块发育后，在倒置相差显微镜（例如Nikon TS100）下用肉眼检查96孔板的每个孔并寻找只含有一个斑块的孔（参见Ufermann等人 >，2017年为高分辨率斑块形态的例子）。将阳性寄生虫的寄生虫转移到含有融合的宿主细胞单层的24孔板中，并培养它们直到它们自然流出。
  2. 使裂解物用于诊断性PCR。从每孔接种一小份（例如，10μl）到含有汇合单层宿主细胞的新的24孔板中以继续培养寄生虫。其余的裂解培养物将用于诊断性PCR。添加1毫升寄生虫克隆到1.7毫升microfuge管。对于阴性对照，加入1毫升外出的野生型寄生虫（亲本系）到一个单独的1.7毫升微量离心管中。在18℃下用微量离心机将所述寄生物悬浮液沉淀在400μg×10分钟并除去寄生虫沉淀物的上清液。向每个沉淀中加入100μl在1x PBS中的蛋白酶K（PK）（0.2mg / ml）并混合。在37℃加热10分钟，50℃10分钟，98℃加热10分钟。
    冻结样品或在冰上放寒，然后进行诊断性PCR。
  3. 诊断PCR设置。应该执行两个简单的PCR来确定标记成功。 PCR1应专门扩增未修饰的基因座，而PCR2应专门扩增标记的基因座（图3A）。每25μl诊断PCR反应包括：
    2.5μl10x Taq缓冲液
    0.5μldNTPs
    
    0.25μl（50μM）正向引物（与PCR1和PCR2相同） 0.25μl（50μM）反向引物（PCR1和PCR2专用）
    1μlPK处理的寄生虫裂解物
    0.25μlTaq DNA聚合酶（New England Biolabs）
    20.25μl去离子H 2 O
    PCR1和PCR2的正向引物应该在翻译终止密码子的上游（5'侧）〜350bp处引发。 PCR1反向引物应在翻译终止密码子下游的3'UTR，〜300bp处引发。
    PCR2反向引物应该从mAID或AID序列开始〜+ 50
  4. 诊断PCR热循环
    步骤1.在98℃变性30秒
    步骤2. 98℃10秒变性
    步骤3.在60℃30秒退火
    步骤4.在68℃延伸1分钟
    第5步。重复步骤2-4 29次
    步骤6.在68℃延伸1分钟
    第7步。保持在4°C，直到进一步使用
  5. 解决诊断PCR扩增。在含有1kb DNA梯的1％琼脂糖凝胶（TAE或TBE）上分解10μlPCR反应以检查阳性扩增（图3C）。对于野生型未修饰的基因座，PCR1应产生约650bp的扩增子。对于成功标记的克隆，PCR2应产生约400bp的扩增子。使用抗HA抗体，可以通过其他方式进一步检测PCR阳性克隆，如免疫荧光显微镜（图3D）或Western印迹（图3E）（m）AID-3HA表位标签。
  6. 亚克隆标记的克隆。一旦鉴定出阳性克隆并确认，应将其从24孔板转移到T-25瓶中并冷冻保存以供将来使用。
    
    图3.（m）AID蛋白融合的产生和调节。 A.在RH TIR1-3FLAG系中CRISPR介导的C-末端mAID标记。此处显示的实例是编码蛋白激酶G（TgPKG）的基因，其经许可从[Brown等人，2017年]中转载）。注意诊断性PCR 1和2的位置。B. TgPKG-mAID-3HA表达的示意图，显示了从转录物上的备选翻译起始位点产生的两种PKG-mAID同种型。 IAA的加入促进了两种PKG-mAID同种型的同时降解。光盘。数据根据（Brown等人，2017年）修改的空间限制进行复制。 C.来自基因组DNA样品的诊断性PCR 1和2，显示mAID标签构建体成功整合入TgPKG（参见A的PCR位置）。 WT（野生型），TIR1-3FLAG亲本;标签，PKG I，II -mAID-3HA寄生虫。 D.PKG-mAID-3HA同种型I和II的免疫荧光用抗-HA mAb染色并用Alexa Fluor 488-缀合的二抗检测。比例尺= 5微米。 E.用识别HA（绿色）和醛缩酶（红色）的抗体探测裂解的PKG1，II-mAID-3HA寄生虫的蛋白质印迹分析。在裂解之前，用500μMIAA或载体（EtOH）处理寄生虫4小时。
AID标签蛋白的消耗
1. 寄生虫文化。用RH TIR1-3FLAG和RH POI-（m）AID-3HA寄生虫感染HFF培养物。用于感染的HFF单层的类型（例如，盘，孔板，烧瓶）和数量将取决于实验，但是对于生长素和媒介物处理，每寄生生产线至少需要两种培养物。 >
2. 生长素治疗。使用1：1,000的生长素消耗终浓度为500μM的（m）AID标签蛋白。模拟处理由等体积的100％EtOH组成，终浓度为0.0789％（w / v）。在37°C孵育。实现完全蛋白质敲除所需的孵育时间将根据蛋白质定位，稳定性和丰度而变化。仅使用15分钟就可以完全敲除可溶性胞质（m）AID融合物，如YFP（Brown等人，2017; Long等人，，2017）。在敲除后，寄生虫可直接检查表型，收获后续检测，或溶解（m）AID标记的蛋白水平的分析。
3. 检测AID标签蛋白水平。（m）AID构建体的3HA部分可以用于通过免疫荧光显微术（图3D）或Western印迹（图3E）使用抗HA抗体（图2）进行蛋白质检测。

数据分析

可以使用ImageJ密度测定软件进行（m）AID融合敲减的Western印迹数据的定量三次重复。我们建议您查看由圣何塞州立大学Dr. Luke Miller创建的在线资源（ http://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-image-j/ ）for ImageJ密度测量的详细指南。

在ImageJ中，打开（m）AID-3HA抗HA蛋白质印迹的灰度TIF图像。文件 - ＆gt;打开 - ＆gt; .tif
使用矩形工具，在第一条泳道的蛋白质条带周围绘制一个垂直矩形。
这个矩形必须比它宽。
按Ctrl + 1选择第一个车道。一个'1'将出现在矩形。
左键单击矩形并将其拖到下一个通道。
按下Ctrl + 2选择第二个车道。 “2”将出现在第二个矩形。
左键单击最新的矩形并移至第三个通道。重复步骤5和6，直到每个车道都有一个矩形。
按下Ctrl + 3将数据绘制在直方图中。一个新的窗口会弹出。
使用线条绘制工具，在连接左侧背景线和右侧背景线的每个峰下绘制一条线。
在所有的背景线绘制完毕后，使用“魔棒”工具点击每个顶点的内部，从顶部（第1道）开始，向下工作。
每个峰（带）的密度值将在新的弹出表中找到。
重复步骤1-11加载控制污点。
将每个样品的总蛋白（AID-3HA密度/加样控制密度）归一化，然后将该比例转换为未处理对照的百分比（归一化样品值/归一化对照比率×100）。
根据制造商的说明，使用GraphPad Prism软件可以对来自一式三份实验的数据取平均值和分析统计学显着性。

笔记

T.弓形虫RH TIR1-3FLAG（基因型：RHΔ hxgprt Δku80 ; TUB1 ： TIR1-3FLAG，SAG1 ： CAT ）（Brown et al。，2017; Long et al。，2017）提交给ATCC进行分发。将生长素degron系统应用于其他的 T。 gondii株，质粒pTUB1：OsTIR1-3FLAG，SAG1：CAT（ Addgene＃87258 ）可用于转染。请访问 http://www.addgene.org/David_Sibley 获取其他与AID相关的质粒。

食谱

10倍Tris-乙酸乙二醇酯（TAE）缓冲液
48.4克Tris碱
11.42毫升冰醋酸
20毫升0.5 M EDTA pH 8.0
适量用去离子H 2 O至1L 在室温下储存
10倍Tris-Borate-EDTA（TBE）缓冲液
108克Tris基地
55克硼酸
40毫升0.5 M EDTA pH 8.0
适量用去离子H 2 O至1L 在室温下储存
10倍SDS-PAGE运行缓冲区
30克Tris基地
144克甘氨酸
10克SDS
适量用去离子H 2 O至1L 在室温下储存
10倍蛋白转移缓冲液
30.3克Tris碱
144克甘氨酸
适量用去离子H 2 O至1L
1x蛋白转移缓冲液
700毫升去离子H 2 O
200毫升甲醇
100毫升10X蛋白转移缓冲液
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）
2克KCl
80克NaCl
14.4克Na 2 HPO 4 4 2克KH 2 PO 4 4克/克适量用去离子H 2 O至1L 在室温下储存
磷酸盐缓冲盐水+ Tween-20（PBST）
899毫升去离子H 2 O
100毫升10倍PBS
1毫升吐温-20
在室温下储存
PCR裂解缓冲液
蛋白酶K在PBS中0.2mg / ml
D10中等
1包DMEM粉剂
3.7克碳酸氢钠
2.38克HEPES
10毫升的200毫米L-谷氨酰胺
1毫升10毫克/毫升庆大霉素
100毫升特征胎牛血清
适量用去离子H 2 O至1L 用1升Stericup过滤器过滤灭菌，并在4°C储存
Hank平衡盐溶液与HEPES和EGTA（HHE）
含有10mM HEPES和1mM EGTA的Hanks平衡盐溶液
0.1M KPO 4缓冲液pH 7.6（用于Cytomix缓冲液）
17.4克K 2 HPO 4 4 13.6克KH 2 PO 4 4 适量用去离子H 2 O至1L
Cytomix电穿孔缓冲液pH值7.6（Soldati和Boothroyd，1993）
100ml 0.1M KPO 4 pH 7.6 8.95克KCl
22.1毫克氯化钙。
1.02克MgCl 2 2/2 5.96克HEPES
744毫克EDTA
适量用去离子H 2 O至1L 无菌过滤器和存储在4°C
500毫摩尔3-吲哚乙酸（IAA /生长素）（1,000x库存）
87.59mg 3-吲哚乙酸加入到1ml 100％EtOH中在-20°C储存，避光

致谢

我们要感谢Nisha Philip博士和Andy Waters博士在“弓形虫”中为AID协议的开发提供有益的讨论和共享质粒。我们没有利益冲突要申报。

参考

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