材料和试剂

纸巾（Georgia-Pacific Consumer Products，目录号：48100）
70％乙醇喷雾瓶
C57BL / 6J成年雄性小鼠（购自杰克逊实验室，3-5个月大）

设备

光线充足（约1,000勒克斯）的测试室，附近有一个容纳室（图1A）
Barnes迷宫装置（TSE Systems，目录号：302050-BM / M）包括：
1. 包含40个等距孔（直径= 5厘米）的圆形PVC平台*（直径= 122厘米;厚度= 1厘米）（图1B）
2. 灰色PVC起始室*由底板和盖子组成（图1C）
3. PVC逃生通道*可安装在40个逃逸孔中的任何一个（图1D）
4. 用于圆形PVC平台的铝支撑架*（高度= 80厘米）（图1E）
高架相机（松下，产品目录号：WV-BP332，图1F）
围绕平台的三个远端视觉提示（长度/宽度〜30厘米）（图1G）
用于90分贝白噪声的扬声器（索尼，目录号：SS-MB150H）
基于Windows的PC电脑（戴尔，型号：OptiPlex 780）连接到相机
理货柜台

图1.巴恩斯迷宫实验装置。：一种。用于分析的行为测试室和相邻房间的布局。 B-F。 Barnes迷宫平台（B），启动室（C），逃生通道（D），铝支架（E），头顶相机（F），单个视觉提示（G）的图像。

软件

TSE VideoMot2视频追踪软件（TSE Systems）
GraphPad Prism版本5.0（GraphPad软件）
Microsoft Excel

程序

软件设置
1. 校准
  1. 在VideoMot2软件程序左上角的“模式”选项卡下，选择“校准”（图2）。
  2. 点击“校准”按钮。
  3. 在Barnes迷宫平台的直径上绘制一条线。
  4. 在“真实长度”框中输入1220毫米。这对应于巴恩斯迷宫的实际直径。
    
    图2. VideoMot2分析软件的屏幕截图
2. 定义实验区域
  1. 在VideoMot2程序的“模式”选项卡下，选择“实验区域”。
  2. 使用位于显示窗口底部的绘图工具制作一个覆盖整个Barnes平台的圆圈。这定义了软件将跟踪鼠标的区域。
3. 定义信息区域
  1. 在VideoMot2程序的“模式”选项卡下，选择“信息区域”。
  2. 使用绘图工具在覆盖逃生通道的孔周围形成一个圆圈。
4. 测量
  1. 从“模式”选项卡中选择“测量”。
  2. 在文字'Autostop at'右侧的白色方框中输入00:03:00。确保“Autostop at”文本左侧的白色框被选中。这将确保视频跟踪软件在3分钟后自动停止每次试用。
  3. 点击位于显示窗口右下角的“开始”按钮。
  4. 在提示时输入相关研究信息（研究编号，等。）。
  5. 单击一次空格键开始背景测量，然后再次结束。在背景测量过程中，确保照相机没有移动或照明变化。
  6. 提示时输入试验数据（动物编号，组）。
  7. 单击一次空格键开始跟踪鼠标。在视频显示中，十字会叠加在鼠标的身体上，并在迷宫中跟随它的运动。
    。再次单击空格键结束试用。
  8. 要保存每个试用版的数据，请在屏幕左上角的“文件”选项卡下选择“另存为”。
巴恩斯迷宫程序（图3）
1. 习惯（第1天）
  1. 将逃生通道连接到平台，并为每个小鼠习惯性试验添加一张干净的薄纸。周围的视觉线索应该到位。这些线索应该保持不变，以适应习惯，习惯和探索阶段。
  2. 将鼠标放置在逃生通道中1分钟
  3. 将鼠标放在设备的中心。让它探索，直到它进入逃生隧道或经过5分钟。
  4. 用70％乙醇清洁设备并逃离隧道
2. 习得训练（第1-10天）
  1. 适应习惯和习得训练开始之间应至少间隔1小时。将逃生通道连接到与用于习惯性试验的位置不同的位置。在训练期间，逃生隧道的位置相对于房间中的空间线索保持在该固定位置。
    每次进行小鼠采集试验时，将一张干净的薄纸添加到逃生通道中。
  2. 训练包括每天两次采集试验（每次试验3分钟;间隔时间〜1小时），起始位置在四个象限中伪随机变化。
  3. 在每次试验开始时，将鼠标放置在位于四个象限中的一个的中心的灰色PVC开始室中。 15秒后，启动室被抬起（图3B），并允许鼠标探索迷宫。在每次试用期间，通过扬声器播放巨大的白噪声（90 dB）以诱导逃生行为。试验结束时，鼠标进入逃生通道（图3D）或3分钟过去。如果鼠标在3分钟内未能找到逃生通道，则由研究人员将其放置在通道中，并允许在移除之前停留15秒。
    
    图3. Barnes迷宫程序 A.实验时间表; B-d。从开始室（B）释放一只老鼠的图像，检查一个洞（C），然后进入逃生通道（D）。
  4. 每次试验后，迷宫和逃生隧道都用70％乙醇清洗。
  5. 对于每个试验，记录许多参数以评估性能。这些包括定位（主要延迟）和输入（总延迟）延迟，以及在定位（主要错误）和输入（总误差）隧道之前检查的错误孔数量。错误定义为检查任何不包含逃生通道的洞，并使用计数器计数器进行实时评分。还记录了定位逃生隧道之前的行进距离（路径长度）和每次试验的总距离。另外，我们还记录了每次试验期间给定鼠标相对于逃生隧道检查的第一个孔的位置（主孔距离）。对于此测量，值范围从0（目标孔）到20（与目标孔正对）。最后，对于每个试验，搜索策略被分类为空间，连续或随机（图4）。将小鼠的主要误差和主要洞距均小于或等于3分的试验定义为空间搜索（视频1）。小鼠大部分时间在外围进行的试验以顺时针或逆时针方式进行系统孔搜索，被分类为连续搜索（视频2）。所有其他试验被认为是随机搜索，包括在3分钟试用期内没有进入逃生通道的那些试验（视频3）。
    
    图4. Barnes迷宫搜索策略。 A-C。跟踪分类为随机（A），连续（B）和空间搜索（C）的单独试验的数据。
    
    视频1
    
    视频2
    
    视频3
3. 探测试验
  1. 在最后一次采集训练后的三天，小鼠进行1分钟的探针试验，其中逃生通道从设备中移除。
  2. 除了将起始室放置在设备的中心而不是任何给定象限的中心之外，探测试验以与采集试验相似的方式进行。
  3. 对于探测试验，记录到达前一个逃生隧道位置之前的行程延迟和距离（路径长度），以及主孔距离，总行程距离，目标孔检查次数和不正确的孔检查次数。 br />

数据分析

在VideoMot2程序的“模式”选项卡下，选择“分析”。
在“文件”选项卡下，选择要分析的选定文件。
录制的数据可以使用位于软件程序右下角的视频播放器进行检查。在这里，实验者可以确定和/或审查错误的数量和目标洞距，并对搜索策略进行分类。
点击位于软件程序右下角的“协议”按钮。这将打开一个新的显示，其中包含延迟目标（主要延迟）和行进距离的数据。
在每个试验的所有相关数据从VideoMot2列表后，然后使用Microsoft Excel将其合并为试用区块。每个试验区由连续两天进行的四项试验组成，每个试验区在四个象限中各有一个起始位置。将每个试验块的平均值输入到GraphPad Prism 5.0中以生成图表并确定组间是否存在统计学显着差异。
图5显示比较野生型和敲除小鼠组的主要潜伏期（A），主要错误（B）和主要洞距（C）的图。两组均显示类似的减少，所有三项措施都增加了培训，表明发生了空间学习。其他Barnes迷宫参数通常包括路径长度，平均速度，失败试验的百分比（3分钟没有发现逃生隧道）以及使用空间搜索策略的试验百分比。

图5.巴恩斯迷宫数据展示。 A-C。主要潜伏期（A），主要误差（B）和主孔距离（C）的比较图，比较野生型和敲除小鼠组之间的表现。对于主洞距离，虚线表示随机机会表现（得分= 10）。

笔记

巴恩斯迷宫的一个潜在缺陷是缺乏压力刺激会导致学习缓慢。为了提供轻微的压力并增加逃生动机，我们在所有试验中通过扬声器播放90 dB白噪声。其他团体以相似的方式使用蜂鸣器噪音来诱导逃跑行为（Bach et。，1995; O'Leary and Brown，2012）。
还应该指出，增加焦虑的药理学和/或遗传操作可以作为Barnes迷宫表现的混杂因素。然而，这种潜在的混乱似乎是MWM比巴恩斯迷宫更为关注的问题。例如，一项研究使用MWM和Barnes迷宫来评估神经颗粒素无效小鼠（一种焦虑增加的突变株）的空间学习。这些小鼠无法达到MWM上的采集标准，但能够为Barnes迷宫（Miyakawa等人，2001）做到这一点。尽管如此，在巴恩斯迷宫中测试焦虑增加的小鼠时，减少光强度将是减少焦虑影响的一种可能的补救措施。
除了上面列出的程序外，我们还使用了一个更广泛的采集培训版本，其中包括20天内发布的40个试验（Pitts et。，2013）。在我们的研究中，我们发现野生型C57BL / 6J小鼠在15-20次采集试验后发展空间偏好，如主孔距明显小于10（随机几率）所示。进一步的培训会减少主孔距离，并增加空间搜索策略的比例。然而，这种额外的训练也可以具有饱和效应，因为认知障碍的老鼠可能最终赶上正常老鼠。研究人员之间没有明确的一致意见，何时应该结束培训。在最初的文章中，巴恩斯迷宫适用于小鼠，研究人员不断对一只给定的小鼠进行测试，直到它在8次连续试验中的7次出现3次或更少的错误（Bach et。，1995年）。对于本研究中使用的野生型小鼠，每天进行一次试验的培训方案中，符合此标准的中位时间为22天。从那时起，在公开的文献中，典型的范围是15-30次采集试验（Seeger等人，2004; Patil等人，2009; O'Leary等人，等，2011和2012）。
我们对巴恩斯迷宫的经验仅限于使用年轻（3-5个月大）的成年C57BL / 6J小鼠。我们发现，给定组内的个体小鼠之间的学习速度可能有很大差异。由于这种差异，我们建议将10-12只小鼠（年龄和性别匹配）的小组大小为准确比较这项任务之间的群体之间的表现。在性别差异方面，我们观察到，随着培训的进展，男性采用空间搜索策略的程度高于女性。此外，还应该指出的是，其他组已经报道了在小鼠背景应变（O'Leary等人，2011）和年龄（Kesby等人）方面Barnes迷宫表现的显着差异。，2015）。
在进行探查试验之后，可以进一步延伸训练以检查逆转学习（Seeger等人，2004年）。为了反向学习，逃生通道移动到与最初目标站点正对的位置。培训以与上述初始采集类似的方式进行，并测量相同的参数。

致谢

我们的实验室在最近的两个出版物中使用该协议来评估小鼠的空间学习（Pitts等人，2013和2015）。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款G12 MD007601，R01 DK47320（Marla J. Berry）的支持，以及G12 MD007601向M.W.P提供的试点项目奖金。作者感谢Ann Hashimoto，Ting Gong，Daniel Torres和Tessi Sherrin帮助获取伴随此稿件的图像和视频。作者声明，没有任何冲突和/或竞争利益。

参考

Bach，M. E.，Hawkins，R. D.，Osman，M.，Kandel，E. R.和Mayford，M.（1995）。 CaMKII突变小鼠的空间记忆障碍，而非上下文记忆障碍，选择性丢失海马LTP的范围theta频率。 Cell 81（6）：905-915。
Barnes，C.A。（1979）。与衰老有关的记忆缺陷：大鼠的神经生理学和行为学研究 J Comp Physiol Psychol 93（1）：74-104。
Harrison，F. E.，Hosseini，A. H.和McDonald，M. P.（2009）。水迷宫和巴恩斯迷宫空间记忆任务中的内源性焦虑和压力反应 Behav Brain Res 198（1）：247-251。
Kesby，J.P.，Kim，J.J.，Scadeng，M.，Woods，G.，Kado，D.M.，Olefsky，J.M。，Jeste，D.V.，Achim，C.L。和Semenova，S。（2015）。暴露于高脂肪饮食的成年和老年小鼠的空间认知 PLoS One 10（10）：e0140034。
Iivonen，H.，Nurminen，L.，Harri，M.，Tanila，H。和Puolivali，J。（2003）。在Morris水迷宫中测试的小鼠体内低体温 Behav Brain Res 141（2）：207-213。
Miyakawa，T.，Yared，E.，Pak，J.H.，Huang，F.L.，Huang，K.P。和Crawley，J.N。（2001）。 Neurogranin null突变小鼠在与焦虑相关成分的空间学习任务中显示出表现缺陷 Hippocampus 11（6）：763-75。
Morris，R.（1984）。开发研究大鼠空间学习的水迷宫程序 J Neurosci方法 11（1）：47-60。
O'Leary，T.P.和Brown，R.E。（2012）。仪器设计和测试程序对Barnes上C57BL / 6J小鼠的学习和记忆表现的影响迷宫。 Neurosci Methods 203（2）：315-324。
O'Leary，T. P.，Savoie，V.和Brown，R.E。（2011）。巴恩斯迷宫中具有不同视觉能力的近交小鼠品系的学习，记忆和搜索策略。 a> Behav Brain Res 216（2）：531-42。
Patil，S.S。，Sunyer，B.，Hoger，H。和Lubec，G。（2009）。评估Barnes迷宫中的C57BL / 6J和CD1小鼠的空间记忆，多重T迷宫，以及莫里斯水迷宫。 Behav Brain Res 198（1）：58-68。
Pitts，M. W.，Kremer，P. M.，Hashimoto，A. C.，Torres，D.J.，Byrns，C.N.，Williams，C.S。和Berry，M.J。（2015）。在硒受损情况下大脑与睾丸之间的竞争：洞察硒代谢和风险方面的性别差异神经发育疾病。
Pitts，M. W.，Reeves，M. A.，Hashimoto，A. C.，Ogawa，A.，Kremer，P.，Seale，L.A。和Berry，M.J。（2013）。硒蛋白M的缺失导致没有认知缺陷的肥胖 J Biol Chem 288（36）：26121-26134。
Porsolt，R. D.，Le Pichon，M.和Jalfre，M。（1977）。抑郁症：一种对抗抑郁药治疗敏感的新动物模型 Nature 266（5604）：730-732。
Seeger，T.，Fedorova，I.，Zheng，F.，Miyakawa，T.，Koustova，E.，Gomeza，J.，Basile，A.S。，Alzheimer，C.and Wess，J。（2004）。 M2毒蕈碱乙酰胆碱受体敲除小鼠在行为灵活性，工作记忆和海马可塑性方面表现出缺陷。 Neurosci 24（45）：10117-10127。