材料和试剂

培养皿，100×15毫米（Genesee Scientific，目录号：32-107G）
微铲（VWR，目录号：82027-518）
Parafilm M（Bemis，目录号：PM999）
50毫升锥形管（Corning，Falcon ，目录号：352070）
15毫升无菌管
垃圾袋足够大，可放置冷却器
报纸
手套
标识泡沫塞（Jaece Industries，目录号：L800-E）
铝箔
小金属珠（弹道产品，＃4拍摄SHZ04或类似）
冷冻在50％甘油中的 Cochliobolus heterostrophus 的分离株
高粱谷物（小麦或大麦也可以使用）
注意：高粱不应该用任何化学物质或杀真菌剂处理。高粱意欲用于鸟类，也称为米罗，是理想的。
Difco马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（BD，Difco TM，目录号：213400）
少量的70％乙醇在带盖玻璃容器中
Tween-20
V8果汁
琼脂
CaCO 3
V8-琼脂培养基（见食谱）

设备

层流工作台（NuAire，型号：AireGard TM ES NU-301，目录号：301-630）
孵化器（Percival Scientific，型号：I-35LL）
夹钳或大镊子
手术刀（EISCO，目录号：BIO182A）
1升锥形瓶（Corning，PYREX ®，目录号：5100-1L）
高压灭菌器
酒精灯（如C＆amp; A Scientific，目录号：97-5313）填充乙醇
塑料桶
通风盘（Buckhorn，目录号：BT28220522）
摆动风扇（Air King，目录号：9119）
冷却器
桶

程序

在马铃薯葡萄糖琼脂上繁殖真菌培养物（工作应在层流罩内进行）
1. 根据包装说明制作PDA平板，准备培养基和高压灭菌。高压灭菌后，应将熔化的PDA冷却至约60℃，然后向每个培养皿中倒入约18至20ml。
2. 对微刮刀进行火焰消毒，并用它来舀取一小块50至100μl的冷冻的C。 heterostrophus 霉菌原液加入平板;重复每个期望的C. heterostrophus分离物。用Parafilm密封平板并置于恒温25°C，12小时光照/黑暗的培养箱中。允许增长10到14天。
3. 传播真菌培养物：为了从最初的平板上产生几块平板，使用火焰消毒的手术刀从殖民地的前缘切下1厘米的正方形，并将其贴在新鲜平板的表面上。像以前一样孵育（步骤A2）。这些辅助板将用于接种谷物。
4. 如果需要，可以再次将培养物转移到新鲜的PDA平板上几代。接种后至少10至14天应使用平板，但可使用较旧的平板。我们已经使用了3个月的旧版。已知真菌病原体在长时间生长和在平板上重复转移后有时变得不那么侵略性的病原体。虽然我们没有观察到这种现象，但是我们从冷冻原料开始新鲜培养，每个季节都能生产接种物。
在谷物上传播真菌培养物
1. 在接种真菌培养物之前三或四天开始准备谷物。用高粱（或大麦或小麦）填满大约一半的塑料桶，然后加入温水至四分之三满。让谷物浸泡三天。
2. 通过在水桶边缘放置一个筛子来清除水分，以清除水中的杂物并将水倒掉。将谷物铲入1升烧瓶中，装入700毫升。当每个烧瓶装满谷物时，向烧瓶中加水，旋转冲洗谷物，并通过筛网将水分滤出。
3. 用Identi-plug盖住每个烧瓶并用一个方形箔覆盖顶部。在121℃高压灭菌1小时。允许冷却。
4. 准备用于生产真菌悬浮液的无菌试管：在每个50ml锥形管中加入约4个金属珠和35ml水。在121℃高压灭菌15分钟。允许冷却。
5. 使用生长在PDA平板上的无菌管和真菌培养物制备真菌悬浮液：在使用火焰消毒的手术刀的层流罩中，将真菌垫和下面的介质切成细条。将材料从一块板分成两个管（图1）。紧紧盖住试管并大力摇动以进一步分解真菌培养物。这将产生含有真菌孢子和菌丝碎片悬浮液的浆液。
  
  图1.制造真菌悬浮
6. 接种谷物：在层流罩中，可将一管真菌悬浮液分散到三或四个灭菌谷物瓶中。收集烧瓶和真菌悬液管。摇动烧瓶以放松粮食。取下铝箔盖。对大镊子进行火焰消毒，摇动真菌悬液并取下盖子，然后迅速用钳子取出泡沫塞，倒入10-15ml真菌悬液，并替换每个瓶子的泡沫塞（图2）。更换箔盖。轻轻摇动每个烧瓶分发真菌。
  
  图2.将真菌悬浮液倒入无菌高粱谷物
7. 在室温下（图3）在实验台上孵育约10天，或者直到谷物被真菌均匀覆盖（图4），每2至3天摇动培养瓶以分布真菌并允许均匀生长。
  有时需要剧烈晃动才能分解团块。
  
  图3.接种后1天PDA菌体生长的菌丝
  
  图4.成熟的高粱谷物培养
8. 干燥谷物接种物：将烧瓶中的接种物倒入装有塑料袋的桶中。无菌铲可以用来分解大块。运输到干燥，有盖的位置，如车库或谷仓。用报纸将通风的托盘放在一起，并将其撒在不超过3厘米的层中。使用风扇进行空气循环，让接种物盘子干燥;每隔几天用手套手搅动并打碎丛块。由于易于成型，因此谷物接种物很快干燥很重要。
  干燥过程通常需要两周左右
9. 当接种物完全干燥时，将其储存在2-7℃的封闭塑料袋中， 50％的相对湿度。
  如果干燥并保持凉爽，接种物可保持数年
接种玉米
1. 田间试验应在试验区块的两侧设置一排或两排边界玉米，以便实验地块不会遇到“边缘效应”。可能是由于疾病压力和湿度降低，疾病的症状通常在野外的边缘稍低。我们通常为每个实验设置两到三个重复，并尝试尽可能多地物理分离复制，以便如果一个复制在种子的“坏”部分种植，另一个复制不太可能在同一个区域。一般来说，大多数实验是在两年或三年内进行的，或者是每个环境/年有两到三次重复的环境。
2. 理想情况下，田间种植的玉米植株应在田间大部分植株形成螺纹后尽早接种。这通常在植物处于7至9叶阶段后约5至6周的生长之后，但是当处理不同的系时，一些可能会越来越小。该领域内的一些变化是可以接受的。如果一些植物太小而不能接种，那也是可以的，因为它们会被所产生的二次接种物感染。
3. 在接种当天，将所需真菌分离物的干燥高粱粒接种物在冷却器中结合。
  约10加仑的接种物用于接种约3英亩的实验或约40,000株植物。
4. 如果要接种一个大型实验（比方说2英亩以上），最好组装一个由几个志愿者组成的团队，每英亩1-2人接种。这是因为接种需要一些时间并且很费劲，因为涉及很多弯曲。给每个志愿者一桶接种物，并让他们将大约10到20粒接种物滴入每个玉米植株的螺纹中（图5，视频1）。逐行移动场，直到每行被接种。注：虽然目标是接种每个植物等量的接种物，但这不是现实可行的，也不是必需的。初始接种的目标是产生二次接种物，该接种物将在整个田间扩散，产生高度均匀的疾病压力。出于同样的原因，同一个人接种整个实验并不重要。
  
  图5.现场接种的细节。：一种。在田间施用接种物; B.接种后马上接种玉米。
  
  视频1
5. 接种物由引发真菌生长的水分“活化”。如果可以使用高架灌溉，则应该简单应用。否则，雨水或露水会积聚在螺纹中，使真菌生长繁殖。初始SLB症状应在4-7天内明显（图6），但不应根据此早期感染评估疾病严重程度。
  
  图6.接种2周后的玉米植株，显示直接接种叶子的疾病症状。随后的生长最初没有任何症状，尽管季节后期会在这些叶子上出现症状。
评分疾病
1. 一般来说，由主要接种物引起的疾病的最初症状非常严重，但玉米迅速长大，最初在随后的生长中明显更温和（或没有）症状。开花后症状会变得更加严重。开花后不久，当耳朵明显时，植物应评为疾病，然后以约10-14天的间隔进行1-3次。通过观察上面的耳叶和叶子来评级疾病，然后以1至9的等级评分症状，其中最高评分9表示无疾病症状，最低评分1表示植物完全死亡（图7，转载来自Kump 等人（2011））。一般情况下，每个地块的几个植物进行简单的检查，每个地块记录一个代表性得分，除非植物对植物的疾病严重程度明显不同。一般来说，经验丰富的得分手可以在大约15至20秒内对情节进行评分。
  
  图8. SLB疾病症状评分指南。 SLB评分标准：9-没有叶枯病的证据; 8-下部叶子上的几个点; 7 - 耳叶上的几个点; 6-叶上有更多的斑点，但病斑不结合;耳叶上的5-病斑已经一起生长，特别是在叶尖处，以产生相当大的坏死区域;穗上叶上的4个病斑也一起生长;耳叶上方的3叶几乎完全死亡; 2-几乎植物上的所有组织都死亡; 1-Everything brown（转载自Kump et al。，2011）。
2. 一旦植物开始衰老，使得由于衰老的坏死在耳叶上可见，则不再可能准确评分疾病。一般来说，在开花后五周左右可以进行评分，但异常炎热干燥的天气可能会缩短这段时间。
3. 在比较炎热的环境中，例如在美国南部，树叶会在下午卷曲，使得评分困难。在这些情况下，尽早在冰壶发生前尽早开始评分是有利的。
4. 平板电脑上的Field Book应用程序（Rife and Poland，2014）对于录制现场大量人群的分数非常有用。
5. 由于疾病进展迅速，并且分数可能每天都在变化，所以整个实验复制在同一天由同一个人评定是很重要的。我们发现不同得分者之间的得分有些变化，但是情节之间的相对得分差异并没有显着变化。这已在其他地方提到过（波兰和尼尔森，2011）。＆nbsp;
6. 在某些情况下，由于各种原因，单个植物或行或一组行可能不会生长，因为它们应该或可能被昆虫或动物害虫破坏。根据我们的经验，最好将这些行的分数记录为缺失数据，而不是试图将分数归于可能不准确的行或植物。我们发现，由于植物源 - 汇关系显着影响症状的发展，因此不会产生具有正常发育种子的健康耳朵的植物可能得不准确的分数。一般来说，整个地区的疾病压力是均匀的，因此土壤类型和局部地形等多种因素可能会导致疾病压力有所变化。因此，应该直接比较的行应尽可能地彼此靠近。

数据分析

分析方法将取决于实验设计。通常情况下，当本季节记录了三组或更多组疾病等级时，每个小区的疾病等级计算为疾病进展曲线下面积（AUDPC）或标准化AUDPC（sAUDPC）。 sAUDPC是通过取两个连续评级的平均值并乘以评级之间的天数来计算的。然后将所有间隔的数值相加，然后除以评估的天数进行调整，以便sAUDPC评分与初始评分相似（Campbell和Madden，1990）。在其他情况下，可以分别分析不同评分日期的得分，以确定在季节不同时间显而易见的抗性（例如Balint-Kurti等人，2006）。

笔记

北方叶枯病菌的接种和评级
灰叶斑点接种和评级。 Cercospora zeae-maydis （灰叶斑病的致病因子）比生长得更慢。在PDA上生长时，它会产生一种皮革状的，致密的真菌垫，这种垫不容易分布在无菌高粱中。为了产生 C的接种物。在PDA上初始生长后，通过在含有7.5ml 0.05％Tween-20和几个金属球的15ml无菌试管中摇动几片真菌培养物来制备悬浮液。吸取1到2毫升悬浮液到V8-琼脂（10％V8汁，15克/升琼脂，1克/升碳酸钙，高压灭菌30分钟）上，倾斜以均匀分布，稍微干燥，然后封口膜并孵育约2周。使用V8-琼脂培养物接种无菌高粱。 GLS的得分方式与SLB基本相同。

食谱

V8-琼脂培养基
10％V8果汁

15克/升琼脂 1g / L CaCO 3
在121°C高压灭菌30分钟

致谢

我们要感谢多年来我们所有的乐队为了科学而牺牲自己的背部，特别是Greg Marshall。我们感谢Cathy Herring和她在克莱顿北卡罗莱纳州中央作物研究站的工作人员，他们在那里进行了大部分接种和评级。 Martin Carson博士提供了建立该协议的重要指导和建议。我们非常感谢Brent McCraven在视频编辑方面的帮助。 Luis Lopez-Zuniga拍摄了一些图中所示的照片。这项工作由USDA-ARS和NSF资助＃1127076资助。作者声明没有利益冲突或利益冲突。

参考

Balint-Kurti，P.J.，Krakowsky，M.D.，Jines，M.P.，Robertson，L.A.，Molnar，T.L.，Goodman，M.M。和Holland，J.B。（2006）。在玉米重组自交系中鉴定抵抗南方叶枯病和开花天数的数量性状基因座人口。 Phytopathology 96（10）：1067-1071。
Balint-Kurti，P.J.，Wisser，R。和Zwonitzer，J.C。（2008a）。作物科学 48：1696-1704。
Balint-Kurti，P.J.，Yang，J.，Van Esbroeck，G.，Jung，J.and Smith，M.E。（2010）。使用玉米高级杂交系进行定位QTL对北方叶枯病抗性和多重抗病性的作用。作物科学 50：458-466。
Balint-Kurti，P.J.，Zwonitzer，J.C.，Pe，M.E.，Pea，G.，Lee，M.and Cardinal，A.J。（2008b）。鉴定两个玉米重组自交系抗南方叶枯病和开花天数的数量性状位点植物病理学98（3）：315-320。
Balint-Kurti，P.J.，Zwonitzer，J.C。，Wisser，R.J.，Carson，M.L.，Oropeza-Rosas，M.A.，Holland，J.B。和Szalma，S.J。（2007）。数量性状基因座对南方叶枯病的抗性的精确作图，由 Genetics 176（1）：645-657。
Belcher，A.R.，Zwonitzer，J.C.，Santa Cruz，J.，Krakowsky，M.D.，Chung，C.L.，Nelson，R.，Arellano，C.和Balint-Kurti，P.J。（2012）。使用近等基因分析玉米中南方叶枯病和多重抗病性的定量疾病抗性行 Theor Appl Genet 124（3）：433-445。
Byrnes，K.J.和Pataky，J.K。（1989）。三种玉米杂交种的产量与由Bipolaris maydis种群O引起的南方叶枯病的严重性之间的关系。植物病 73：834-840。
Campbell，C.L。和Madden，L.V。（1990）。植物病害流行病学简介 John Wiley和儿子 pp：P192-194。
Carson，M. L.，Stuber，C. W.和Senior，M. L.（2004）。数量性状的鉴定和制图对由Cochliobolus引起的玉米南部叶枯病的抗性调节抗性异型动物 race O. Phytopathology 94（8）：862-867。
Chung，C.L.，Longfellow，J.M。，Walsh，E.K。，Kerdieh，Z.，Van Esbroeck，G.，Balint-Kurti，P.and Nelson，R.J。（2010）。影响真菌发病机制不同阶段的抗性基因座：使用渐渗系进行玉米中的QTL定位和表征 - Setosphaeria turcica 病理系统。 BMC Plant Biol 10：103。
Fisher，D.E.，Hooker，A.L.，Lim，S.M。和Smith，D.R。（1976）。玉米四种长蠕孢叶病引起的叶片感染和产量损失植物病理学 66：942-944。
Holley，R.N。和Goodman，M.M。（1989）。来自热带杂交玉米衍生物的南方玉米叶枯病抗性的新来源。 a> Plant Dis 73：562-564。
Kump，KL，Bradbury，PJ，Wisser，RJ，Buckler，ES，Belcher，AR，Oropeza-Rosas，MA，Zwonitzer，JC，Kresovich，S.，McMullen，MD，Ware，D.，Balint-Kurti，PJ和荷兰，JB（2011）。玉米巢式结合作图群体中南方叶枯病定量抗性的全基因组关联研究< / a> Nat Genet 43（2）：163-168。
Mueller，DS，Wise，KA，Sisson，AJ，Allen，TW，Bergstrom，GC，Bosley，B.，Bradley，CA，Byamukama，EC，Chilvers，MI，Collins，A.，Faske，T.，Friskop，AJ ，Hollier，CA，Isakeit，T.，Jackson-Ziems，TA，Jardine，DJ，Kinzer，K.，Koenning，SR，Malvick，DK，Meyer，RF，McMullen，M.，Mostrom，MS，Paul，P. ，Robertson，AE，Roth，GW，Smith，DL，Tande，CA，Tenuta，A.，Vincelli，P.和Warner，F。（2016）。 2012年至2015年美国和加拿大安大略省的玉米疾病损失估计值。 Plant健康进步。
Negeri，A.T.，Coles，N.D.，Holland，J.B。和Balint-Kurti，P.J。（2011）。通过联合分析三个相关的重组自交系群体，绘制控制南方叶枯病抗性的QTL 。 <作物科学 51：1571-1579。
波兰，J.A。和Nelson，R.J。（2011）。在观察者眼中：评估者变异性和不同评估量表对QTL作图的影响。 / a> Phytopathology 101（2）：290-298。
Rife，T. W.和Poland，J. A.（2014）。实地书：一个开源应用程序现场数据收集在Android上。作物科学 54：1624-1627。
Santa-Cruz，J.H.，Kump，K.L.，Arellano，C.，Goodman，M.M.，Krakowsky，M.D.，Holland，J.B。和Balint-Kurti，P.J。（2014）。产量效应二玉米杂交种中的南方叶枯病抗性基因座。作物科学 54：882-894。
Ullstrup，A.J。（1972）。 1970-1971年南方玉米叶枯病流行的影响。< / a> Annu Revi Phytopathol 10：37-50。
Wang，M.，Wang，S.，Ma，J.，Yu，C.，Gao，J。和Chen，J。（2017）。在华南地区检测 Cochliobolus heterostrophus 种族 J Phytopathology 165：681-691。
Yang，Q.，He，Y.，Kabahuma，M.，Chaya，T.，Kelly，A.，Borrego，E.，Bian，Y.，El Kasmi，F.，Yang，L.，Teixeira，P. ，Kolkman，J.，Nelson，R.，Kolomiets，M.，J，LD，Wisser，R.，Caplan，J.，Li，X.，Lauter，N.and Balint-Kurti，P.（2017）。编码玉米咖啡酰辅酶A甲基转移酶的基因赋予对多种病原体的定量抗性。 Nat Genet 49（9）：1364-1372。
Zwonitzer，J.C.，Bubeck，D.M。，Bhattramakki，D.，Goodman，M.M.，Arellano，C。和Balint-Kurti，P.J。（2009）。使用反复回交和QTL定位的选择来鉴定高度高度影响南方叶枯病抗性的位点（Theor Appl Genet） 118（5）：911-925。
Zwonitzer，J.C.，Coles，N.D。，Krakowsky，M.D。，Arellano，C.，Holland，J.B.，McMullen，M.D.，Pratt，R.C。和Balint-Kurti，P.J。（2010）。玉米重组自交系群体中三种叶面疾病的抗性数量性状基因座的映射 - 多种疾病的证据抵抗？植物病理学 100（1）：72-79。