材料和试剂

PCR管
培养皿92 x 16毫米（SARSTEDT，目录号：82.1472.001）
注射器过滤器，0.2μm孔径（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
微量离心管1.5 ml（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
移液器吸头（1,000μl：SARSTEDT，目录号：70.762.100; 1-200μl：Corning，目录号：4804; 0.1-10μl：Gilson，目录号：F171103）
分光光度计比色杯（SARSTEDT，目录号：67.742）
3部分一次性HSW SOFT-JECT注射器（5ml：Henke Sass Wolf，目录号：5050.X00V0; 10ml：Henke Sass Wolf，目录号：5100.X00V0）
铝箔
本研究中使用的质粒：
氯化钙感受态大肠杆菌TOP10细胞（Hanahan，1983）
本研究中使用的引物（从Sigma-Aldrich订购）：

a 限制性网站带下划线。
GenElute质粒小量制备试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：PLN350）
无菌蒸馏去离子水（diH 2 O）
Phusion高保真DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：F530S）
dNTP混合物（各10mM）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0192）
琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
用于DNA的SmartLadder：200-10,000bp（Eurogentec，目录号：MW-1700-10）
GelRed TM核酸凝胶染色剂（Biotium，目录号：41003）
不限制酶I（New England Biolabs，目录号：R0189S）
PacI I限制酶（New England Biolabs，目录号：R0547S）
PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
快速DNA连接酶试剂盒（Roche Diagnostics，目录号：10716359001）
Taq DNA聚合酶与标准Taq缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0273S）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
胰蛋白胨（BD，Bacto TM TM，目录号：211705）
酵母提取物（BD，Bacto TM，目录号：212750）
琼脂（BD，Difco TM，产品目录号：281230）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：93350）
冰醋酸（Sigma-Aldrich，目录号：ARK2183）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
硫酸庆大霉素盐（Sigma-Aldrich，目录号：G3632）
L - （+） - 阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3256）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）（Roche Diagnostic，目录号：10703729001）
LB（Luria-Bertani）培养基（见食谱）
LB（Luria-Bertani）琼脂（见食谱）
TAE缓冲液（见食谱）
100毫克/毫升氨苄青霉素储备（见食谱）
30毫克/毫升庆大霉素储备（见食谱）
100 mM IPTG库存（见食谱）
20毫克/毫升X-gal储备（见食谱）

设备

锥形瓶（50毫升/ 100毫升/ 250毫升）
例如PIPETMAN P20（Gilson，目录号：F123600），P200（Gilson，目录号：F123601）或P1000（Gilson，目录号：F123602） ]
SureCycler 8800热循环仪（Agilent Technologies，型号：SureCycler 8800，目录号：G8800A）
Heraeus TM Pico TM 17微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus TM Pico TM 17，目录号：75002410）
Mini-Sub细胞GT水平电泳系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704406）
15孔梳（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704464）
Sub-Cell GT UV-透明微型凝胶托盘（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704436）
电泳电源
Heraeus微生物培养箱（Thermo Fisherer Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus微生物培养箱）。
Multitron标准振动筛（INFORS HT）
Gel Doc TM XR +凝胶文件系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1708195）
生物光度计（Eppendorf，型号：6131）
NanoDrop TM 2000c分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 2000c，目录号：ND-2000C） >
紧凑型Thermomixer（Eppendorf，型号：5350）
数码相机

程序

实际上，工作流程可以分成两部分，如图2所示。第一部分是构建报告菌株，需要大约12-15天（协议的步骤1-3）。第二部分是通过报道菌株来评估DGC和PDE的活性（步骤4-5）。这将需要7-9天。

图2.工作流程概览。该程序分为两部分：1）记者菌株的构建和2）由记者评估c-di-GMP环化酶或磷酸二酯酶活性。构建报告菌株需要大约12-15天，并且需要7-9天来评估目标。

通过PCR扩增Vc2和 lacZY ：
1. 用于PCR的模板是Vc2-pRS414（由耶鲁大学RR Breaker教授接收），其中将含有核糖开关的片段及其天然启动子与框架内报道基因克隆在一起（
  。Sudarsan et。，2008）。
2. 使用的引物是：
  Vc2 lacZY _F_ Pac I：GCG TTAATTAA ATAACGCCTATATTTGAAAGCTTG
  Vc2 lacZY _R_ 不是 I：GATCA GCGGCCGC TTAAGCGACTTCATTCACCTG
  限制性网站 Pac I和 Not I加下划线。
3. 准备PCR反应混合物：
4. 热循环条件：
5. 通过使用1％TAE琼脂糖凝胶的凝胶电泳检查PCR产物。预计大小为4,733 bp。
克隆Vc2 lacZY 插入pGRG25载体：
1. 在37℃下，用Pac＆lt; em-I和＆lt; em＆gt; I双重消化PCR产物Vc2 lacZY和质粒pGRG25过夜。为了减少星形活动，建议使用尽可能少的单位来达到消化。消化后，有必要使用琼脂糖凝胶电泳检查产物的大小。
  酶在65°C灭活20分钟
2. 使用PCR纯化试剂盒去除限制酶。消化的Vc2 lacZY和pGRG25的浓度由NanoDrop测量。
3. 按照制造商的说明书，使用T4 DNA连接酶在12°C过夜连接摩尔比为1：1的pGRG25和Vc2 lacZY 。为了验证载体是完全切割的，只需连接消化的载体。如果载体不能被两种限制酶有效切割，则会发生再循环，转化后会出现菌落。
4. 将连接产物转化为化学感受态TOP10细胞，并在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择重组质粒。 pGRG25载体对温度敏感，因此培养板应在32°C或更低的温度下培养。
5. 通过菌落PCR验证回收的菌落。首先，按照制造商的说明书，用标准Taq缓冲液（来自New England Biolabs）为Taq DNA聚合酶制备主混合物。然后将25μl等分试样加入到PCR管中。使用无菌移液器吸头挑取单个菌落并与反应缓冲液混合。使用Taq DNA聚合酶进行菌落PCR时，建议在95°C预变性5 min。预期大小为518 bp。使用的引物是：
  pGRG25control_F：CACTTATCTGGTTGGTCGACACT
  Vc2 lacZY _R：CTGCAAGGCGATTAAGTTGG
  有关菌落PCR的细节可以在Azevedo等人的协议中找到（2017）。
6. 使用相同的引物进行菌落PCR，通过DNA测序确认阳性克隆中核糖开关的序列完整性。
将Vc2 lacZY 集成到 E的Tn 7 附件网站中。大肠杆菌染色体（注1）：
1. 在补充有100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上条斑阳性菌落并在32℃孵育细胞。
2. 在32℃，200rpm下将大约10个菌落接种到3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中。加入0.1％L-阿拉伯糖（w / v）以促进Vc2 lacZY掺入大肠杆菌Tn 7 7附着位点。整合产生新的菌株E.coli TOP10 attTn7 :: Vc2 lacZY 。
3. 将过夜培养物稀释10倍，并将50μl稀释的培养物平板接种于LB平板上以获得单菌落。在42°C孵育板以阻止温度敏感型pGRG25载体的复制。
4. 在LB平板上条纹单个菌落并在42°C下重复孵育以确保质粒丢失。
5. 使用Taq DNA聚合酶通过菌落PCR确认Vc2 lacZY 整合到染色体中。使用的引物是：
  pGRGcontrol_F：GATGCTGGTGGCGAAGCTGT
  pGRGcontrol_R：GATGACGGTTTGTCACATGGA
  
  。阳性克隆和对照的预期大小分别为6,328bp和678bp。
通过基于Vc2的筛选评估diguanylate环化酶的活性：以建立的DGC AdrA，YdeH和STM4551为例
1. 准备氯化钙主管E。大肠杆菌 TOP10 attTn7 :: Vc2 lacZY 细胞。
2. 通过在42处的热休克将含有DGC（AdrA，YdeH和STM4551）和催化失活突变体（STM4551E267A和YdeH-mut）的pBAD载体（注2）以及空载体转化到化学感受态细胞中°C持续40秒。将1ml不含抗生素的LB培养基加入微量离心管中，并在37℃，200rpm孵育1小时以使细胞恢复。
3. 在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养200μl细胞并在37℃培养平板过夜。
4. 在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上划线单菌落。
5. 为每种菌株挑选一个菌落，并在37℃，200rpm过夜培养5 ml含100μg/ ml氨苄青霉素的LB培养基。
6. 测量过夜培养物的OD 600，并将OD 600调至0.1。
7. 在37℃，200转/分钟培养细胞。当OD 600达到0.6-1.0时，在加入100μg/ ml氨苄青霉素，80μg/ ml X-gal，0.1％（w / v）L-阿拉伯糖的LB平板上点3μl培养物（注3）。具有DGC，相应突变体和载体对照的细胞具有类似的OD 600是很重要的。
8. 在28°C孵育板并监测集落颜色达72小时。 DGC活性将导致指示高c-di-GMP水平的白色菌落。使用数码相机拍摄照片。
研究PDE的活动：以已建立的PDE STM3611为例
1. 细胞内c-di-GMP的浓度在TOP10细胞中低，因此Vc2 lacZY-harboring细胞具有β-半乳糖苷酶活性的基础水平，导致蓝色菌落，这使得不可能区分颜色由磷酸二酯酶进一步增强。然而，通过DGC的共表达可以可靠地研究PDE的活性。因此，将pWJB30（DGC AdrA克隆到pBAD30中）和pSTM3611（克隆到pSRKGm中的PDE STM3611）（注2和4）共转化到化学感受态TOP10 :: Vc2 lacZY细胞中。作为对照，空载体共转化或与DGC / PDE组合。表1列出了这些组合。
  
  表1.共转化到化学感受态TOP10 :: Vc2 lacZY细胞中的质粒组合
2. 在含有氨苄青霉素（100μg/ ml）和庆大霉素（30μg/ ml）的LB琼脂平板上平板细胞。
  在37℃培养平板过夜
3. 将含有抗生素的LB琼脂平板上的阳性菌落划线。
4. 在含有氨苄青霉素和庆大霉素的5ml LB培养基中接种每菌株至少三个单独的菌落。
  在37°C，200转/分钟培养细胞过夜
5. 测量过夜培养物的OD 600，并用含有抗生素的LB培养基将培养物稀释至0.1的OD 600。让细胞生长至指数期（OD 600〜0.6）。所有样品具有相似的OD <600>值是至关重要的。
6. 在含有氨苄青霉素（100μg/ ml），庆大霉素（30μg/ ml），IPTG（0.75mM），L-阿拉伯糖（0.003％，w / v）和X-Gal（80μg/ ml）的LB琼脂平板上点出3μl培养物μg/ ml）（注3）。
7. 在28°C孵育板并记录集落颜色达72小时。尽管单独的DGC表达导致白色菌落，但活性PDE的共表达会导致蓝色菌落。
8. 使用数码相机拍摄照片。

数据分析

通过基于Vc2的测定来评估DGC的活性：在含有X-gal的平板上点样后，定期监测菌落的颜色。图3显示了在28℃下孵育24小时后的颜色。显然，与相应的突变体和载体对照相比，由于在高c-di-GMP水平下β-半乳糖苷酶表达的核糖开关抑制，表达DGC的细胞具有更白的颜色。

图3.通过基于Vc2的测定检测已建立的diguanylate环化酶。分别将DGC AdrA，STM4551和无催化活性的STM4551E267A克隆到pBAD30中，分别产生pWJB30，p4551和p4551E267A。将另一个DGC YdeH及其突变体YdeH G206AG207A克隆到pBAD28中，产生pBAD28ydeH和pBAD28ydeH-mut。表达功能性DGC的细胞（AdrA / STM4551 / YdeH）是白色的，而具有载体对照或催化失活突变体（STM4551E267A / YdeH G206AG207A）的细胞是蓝色的。在补充有100μg/ ml氨苄青霉素，80μg/ ml X-gal和0.1％阿拉伯糖（w / v）的LB琼脂平板上28℃生长24小时。
通过基于Vc2的测定来评估PDE的酶活性：图4显示在28℃孵育48小时后菌落的颜色。（第2行）或共表达AdrA和催化失活的PDE STM3611E136A（第5行）的细胞是白色的。然而，当野生型STM3611与AdrA（第4行）共表达时，细胞呈蓝色，说明STM3611的酶活性和细胞内c-di-GMP浓度对表达的降低。

图4.通过基于Vc2的测定检测PDE STM3611的磷酸二酯酶活性将磷酸二酯酶STM3611和无催化活性的STM3611E136A克隆到pSRKGm中，产生pSTM3611和pSTM3611E136A ，分别。将Diguanylate环化酶AdrA克隆到pBAD30中，产生pWJB30。单独表达DGC AdrA的细胞具有白色。在用AdrA共表达PDE STM3611时，颜色变成蓝色，表明低c-di-GMP水平。然而，表达具有催化失活的PDE STM3611E136A的DGC AdrA的细胞是白色的。在补充有100μg/ ml氨苄青霉素，30μg/ ml庆大霉素，80μg/ ml X-gal，0.003％阿拉伯糖（wt / vol）和0.75mM IPTG（经改编）的LB琼脂平板上28℃生长48小时来自El Mouali et al。，2017）。

笔记

将目标基因整合进入 E的协议。大肠杆菌染色体Tn73附着位点由G.J.McKenzie和N.L.Craig（McKenzie和Craig，2006）描述。
我们将diguanylate环化酶克隆到pBAD28 / pBAD30载体中，并将磷酸二酯酶克隆到pSRKGm载体中。其他表达载体也可以使用，这取决于可用性。
不同的L - （+） - 阿拉伯糖和IPTG浓度需要进行测试，以获得diguanylate环化酶，磷酸二酯酶和对照之间最明显的颜色差异。
将diguanylate环化酶和磷酸二酯酶克隆到含有不同抗生素抗性标记和相容性复制起点的相容性载体中很重要。
基于Vc2的核糖开关对其他环状二核苷酸的特异性尚未在本文中进行测试。

食谱

LB（Luria-Bertani）培养基400毫升
4克NaCl
4克胰蛋白胨
2克酵母提取物
将dH <2> O添加到400毫升
中
在121°C高压灭菌15分钟
LB（Luria-Bertani）琼脂400毫升
4克NaCl
4克胰蛋白胨
2克酵母提取物
6克琼脂
将dH <2> O添加到400毫升
中
在121°C高压灭菌15分钟倒入培养皿（如果需要，加入抗生素，X-gal，L-阿拉伯糖或IPTG）
让它完全冷却并在4°C储存。
TAE缓冲液（50x储备液）
将242克Tris碱溶于水中
加入57.1毫升冰醋酸
加100ml 0.5M EDTA（pH8.0）

加水至1升
100毫克/毫升氨苄青霉素储备
溶解5毫升去离子水中的500毫克氨苄青霉素钠盐
用0.2μm无菌注射器过滤器过滤溶液将1毫升等分试样溶液装入无菌离心管中。
在-20°C储存
30毫克/毫升庆大霉素储备

溶解150毫克硫酸庆大霉素盐溶于5毫升去离子水中
用0.2μm无菌注射器过滤器过滤溶液将1毫升等分试样溶液装入无菌离心管中。
在-20°C储存
100 mM IPTG stock
将1.191克IPTG溶于5毫升去离子水中

用0.2μm无菌注射器过滤器过滤溶液将1毫升等分试样溶液装入无菌离心管中。
在-20°C储存
20毫克/毫升X-gal库存
溶解5毫升DMSO中的100毫克X-gal
用铝箔包裹管子避光在-20°C储存

该溶液在-20°C稳定6-12个月

致谢

作者想感谢Ronald R. Breaker博士教授共享Vc2-pRS414核糖开关结构。 UteRömling教授构思了这项研究。刘颖开发了该测定并评估了DGC活性。 Hyunhee Kim开发了测定来评估PDE活性。这项工作得到了瑞典自然科学和工程研究委员会（621-2013-4809）和卡罗林斯卡研究所的支持。此修改后的协议基于以前发表的作品（El Mouali等人，2017年）。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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