材料和试剂

玻璃毛细管（Drummond Scientific，目录号：3-000-203-G / X）
幻灯片
Parafilm M（LMS，目录号：94-2542-5）
培养皿（直径：3.5厘米和9.0厘米，LMS，日本）
移液器吸头
2毫升Eppendorf管（Eppendorf，目录号：022363344）
Eppendorf安全锁管1.5 ml（Eppendorf，产品目录号：0030120086）
无盖金属管（DigiTUBEs，GL Sciences，目录号：8520-50112）
针头注射器
聚丙烯网（0.8毫米，光谱，目录号：146492）
DigiFILTER 0.45μm（SCP SCIENCE，目录号：010-500-070）
用胶原酶处理的非洲爪蟾卵母细胞（Kitagawa Institute，hita，日本）
注意：女性非洲爪蟾卵巢的采集方案可用（Shi和Carattino，2017）。
pXBG-ev1载体（Preston et al。，1992;图2）
凝胶提取试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：NA1111）
TE缓冲区
使用MILLI-Q ADVANTAGE A10净化系统（Millipore）生产超纯水
注意：为了准备ICP-MS的样品，不要使用硼硅酸盐制成的玻璃器皿来避免B的污染。
mMESSAGE mMACHINE T3转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM1348）
矿物油（NACALAI TESQUE，CAS号：8020-83-5）
硼酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-02191）
硝酸（HNO 3）（用于硼测定，Wako Pure Chemical Industries，目录号：140-05415）
硼标准溶液（B 1,000，Wako Pure Chemical Industries，目录号：025-16581）
有或没有Ca 2 +的改良Barth's盐水（MBS）缓冲液（见食谱）
1. 氯化钠（NaCl，Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
2. 氯化钾（KCl，Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
3. 碳酸氢钠（NaHCO 3，NACALAI TESQUE，目录号：31212-25）
4. Tris-HCl（pH7.6，Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：10708976001）
5. 硝酸钙四水合物（Ca（NO 3）2•4H 2 O，和光纯药工业公司）
6. 氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O，Wako Pure Chemical Industries，目录号：039-00431）
7. 硫酸镁七水合物（MgSO 4•7H 2 O，Wako Pure Chemical Industries，目录号：131-00405）
8. 青霉素钠（Wako Pure Chemical Industries，目录号：168-23191）
9. 硫酸链霉素（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-08511）

设备

双级玻璃微管（NARISHIGE，型号：PC-10）
共聚焦激光扫描显微镜（徕卡显微系统，型号：徕卡TCS SP8）
荧光显微镜（奥林巴斯，型号：MVX-10）
Nanoliter注射器（Drummond Scientific，型号：Nanoject II）
立体显微镜（尼康，型号：SMZ-2T）
孵化器（Advantec，型号：THS030PA）
热消化系统（GL Sciences，型号：DigiPREP Jr）
ICP-MS（PerkinElmer，型号：ELAN DRC-e）
自动进样器（PerkinElmer，型号：ESI）
超纯水系统（Merck，型号：MILLI-Q ADVENTAGE A10）

程序

图1说明了在卵母细胞中表达硼酸通道的程序。

图1.在卵母细胞中表达硼酸通道的程序。使用BglII位点将GFP-NIP5; 1 ORF序列亚克隆到pXBG-ev1载体中。载体通过BamHI线性化并用于体外cRNA转录。将GFP-NIP5; 1cRNA注射到卵母细胞中用于表达并随后硼转运测定。

NIP5的cRNA合成; 1
1. 使用Bgl II位点在pXBG-ev1载体（图2）中 GFP-NIP5; 1 的亚克隆ORF序列。
  注：GFP用于在后面的步骤（步骤C）中选择表达NIP5; 1的卵母细胞。
  
  图2.用于体外转录的pXBG-ev1载体图谱（Preston等人，1992）。。基因的ORF序列可以使用BglII位点在5'非翻译区（UTR）和3'UTR之间进行亚克隆。
2. 通过核酸内切酶如BamHI HI线性化质粒。用凝胶提取试剂盒（Sigma-Aldrich）纯化DNA片段，稀释至TE缓冲液或无核酸酶水中的浓度为500 ng /μl。
3. 运行加帽转录反应并按照制造商的说明恢复cRNA。我们使用mMESSAGE mMACHINE T3转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）。
  注：有关cRNA合成的制造商指南可在 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1348 。
NIP5的cRNA注射; 1
1. 用双级玻璃微管拉拔器PC-10准备尖锐的玻璃毛细管（图3）。
  注意：固定一个毛细管并按如下方式在PC-10中设置参数：No.1加热器等级：60，No.2加热器等级：58.按下'开始'按钮自动处理。 br />
  
  图3.拉拔器PC-10制备玻璃毛细管在PC-10上固定（A），加热和拉伸玻璃毛细管（B）。尖端锋利的玻璃毛细管（C）。
2. 通过立体显微镜下的载玻片切割表面将尖端断开，并在立体显微镜下检查玻璃尖端的清晰度（图4A-4C）。
  注意：使用MilliQ水检查尖端。通常PC-10制成的玻璃毛细管由于密封的尖端不能直接使用（图4D）。
  
  图4.检查玻璃毛细管。：一种。通过载玻片的切割表面破坏末端的过程; B.用立体显微镜观察玻璃毛细管的尖端; C.白色箭头所示的滑块和尖端界面的特写视图; D.通过取水检查玻璃毛细管末端的孔。
3. 使用带注射器的注射器将毛细管注入毛细管，并将毛细管安装在注射器NANOJECT II上（图5A-5C）。
  
  图5.用矿物油填充玻璃毛细管。用注射器（A）向玻璃毛细管中注入矿物油并将其置于NANOJECT II（B，C）上。 B中的白色圆圈表示NANOJECT II上玻璃毛细管的位置。
4. 在18°C下用Ca2 +缓冲液孵育MBS中的卵母细胞6小时（参见食谱）。
  注意：选择健康的卵母细胞，注射用黑色和黄色一半（Sigel，2010）。
5. 对于每个cRNA样品，准备35个卵母细胞并通过NANOJECT II为一个卵母细胞注射50 nl的cRNA溶液（图6）。
  注：按'空'按钮将金属针头推出玻璃毛细管尖端约0.5厘米的位置。将4μlcRNA置于石蜡膜上（图6B），然后按下“填充”按钮（图6A）。通过1ml末端切口移液器吸头将几个卵母细胞转移到置于新培养皿中的聚丙烯网上（图6C）。将显微注射器靠近卵母细胞并轻轻插入玻璃毛细管。按下NANOJECT II的'注射'按钮进行注射。从卵母细胞上分离玻璃毛细管，然后依次注入下一个。
  
  当您处理不同的cRNA时，改变毛细管。
  
  图6.通过NANOJECT II向卵母细胞注射cRNA。：一种。 NANOJECT II的控制面板; B.用cRNA填充玻璃毛细管; C. NANOJECT II将cRNA注入卵母细胞。
用硼酸孵育卵母细胞
1. 在18℃用Ca 2+ 2+缓冲液（参见配方）在MBS中孵育1-2天后荧光立体显微镜下观察注射卵母细胞中GFP融合蛋白的表达（图7A-7C）。
2. 通过共聚焦激光扫描显微镜对GFP融合蛋白在卵母细胞中的图像定位（图7D-7F）。
  
  图7.观察卵母细胞中的GFP。 A-C。通过荧光显微镜观察注射了cRNA的卵母细胞中的GFP信号。用TE缓冲液（B）和GFP-NIP5; 1cRNA（C）分别注射卵母细胞。 D.通过共焦激光扫描显微镜观察卵母细胞; E和F.卵母细胞（白色箭头）（E）的表面图像和注射有GFP-NIP5; 1cRNA的卵母细胞（F）的内侧 - 光学切片。比例尺= 1.0毫米（7B，7C，7E），0.5毫米（7F）。
3. 收集7-8个卵母细胞作为一个池在2毫升Eppendorf管使用1毫升端切枪头。建议准备4个或更多副本。
4. 除去MBS缓冲液并向每个管中加入1ml含有5mM硼酸的MBS。
  在18°C孵育30分钟
5. 取出MBS缓冲液，用1 ml新鲜MBS缓冲液（无硼酸）冲洗卵母细胞5次。
B通过ICP-MS测量
1. 将一个卵母细胞池转移到一个没有盖子的新金属管中（我们使用DigiTUBEs，GL Sciences）。加入500μl浓缩的HNO 3 3消化20分钟，然后在DigiPREP Jr设备（GL Sciences，Tokyo）中于100℃温育。每2分钟摇动DigiTUBE以彻底干燥溶液。用165μl浓HNO3溶液重悬样品，然后加入超纯水至5ml，制成2％HNO3溶液。
2. 加入适当体积的2％HNO 3 3稀释样品进行ICP-MS测量。我们准备含2％硝酸的溶液并测量硼浓度。
  注：有时，DigiTUBE中仍有未溶解的物质。 DigiFILTER 0.45μm（GL Sciences）可以消除它们。可根据ICP-MS仪器使用1至5％HNO 3 。
3. 使用0-100ppb总B（天然丰度）作为ICP-MS（图8）的标准测量11 B。我们使用配备ESI自动进样器和软件套装（PerkinElmer，Waltham，Massachusetts，USA）的ICP-MS ELAN DRC-e。假设在运输过程中没有同位素鉴别，我们计算了总B浓度（<10> B：B = 20:80）。
  注意：ICP-MS操作指南可以在 http://helpwiki.evergreen.edu/wiki/index.php/PerkinElmer_ELAN_DRC-E_ICP-MS_Manuals 。
  
  图8.通过ICP-MS测量的B标准和强度的线性方程。 Pre：在测量样品前测量标样。邮政：测量样本后的标准测量。

数据分析

我们计算每个卵母细胞中的总B含量为nmol /卵母细胞（表1）。 GFP-NIP5; 1表达卵母细胞中的B含量显着高于TE注射的对照，表明GFP-NIP5; 1具有硼转运活性（图9）。

表1.数据分析示例

图9.用5mM硼酸孵育30分钟后卵母细胞中的硼含量

食谱

有或没有Ca 2+的改良Barth's盐水（MBS）缓冲液（表2）
1. 高盐股票
  64克NaCl
  1克KCl
  2.5克NaHCO 3 3/2
  22.5克Tris-碱用浓盐酸调pH7.6
  用MilliQ水填充至500毫升，并储存于4°C
2. Ca <2> 股票
  0.95克Ca（NO 3）2•4H 2 O
  0.755克CaCl 2•2H 2 O 0
  用MilliQ水补充至100毫升，并储存在4°C
3. 镁2 +股票
  2.5克MgSO 4•7H 2 O
  
  用MilliQ水补充至100毫升，并储存在4°C
4. 青霉素库存
  青霉素钠10毫克/毫升（0.1克/ 10毫升）
5. 链霉素库存
  硫酸链霉素10mg / ml（0.1g / 10ml）
  
  表2.含或不含Ca 2+的MBS缓冲液的制备

致谢

我们感谢马建峰，Naoki Yamaji（冈山大学），Toshihiro Watanabe和Tomoko Shimizu（北海道大学）在荧光共焦显微镜和ICP-MS测量方面的帮助。这项工作得到日本社会科学促进会下属计划（GS001）和青年科学家资助（A）（26712007），人类前沿科学计划青年研究者资助（RGY0090 / 2011）以及内藤基金会向JT的研究经费作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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