材料和试剂

0.2ml PCR管（例如，BioExpress，GeneMate，目录号：T-3225-1）。
NucAway Spin Columns（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：AM10070）
1.7ml塑料无菌无RNase微量离心管（例如BioExpress，GeneMate，目录号：C-3262-1）
10cm或15cm的培养皿（例如，Alkali Scientific，产品目录号：TD0100，TD0150）。
无菌丁腈手套
细胞提升器（例如，，BioExpress，GeneMate，目录号：T-2443-4）
无菌，无RNA酶的P10，P20，P100和P1000移液管吸头
用于Bradford测定的塑料一次性比色皿（例如，Fisher Scientific，目录号：14-955-127）
塑料包装（例如，Saran或Stretch-Tite品牌）
纸标签带（，例如，Fisher Scientific，目录号：15-901-20H）
制造商：Nevs，目录号：1590120H。
聚乙烯亚胺（PEI）纤维素TLC板（Macherey-Nagel，目录号：801053;参见注释2）
Immobilon-FL聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Merck，目录号：IPFL00010）
与液体闪烁计数器兼容的闪烁瓶（例如，DWK Life Sciences，WHEATON，目录号：225414）
U2OS细胞（ATCC，目录号：HTB-96）或HEK293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）
P1核酸酶（美国生物公司，目录号：N7000），重悬于无RNase的水中至0.625U /μl
Cap类似物GpppG（New England Biolabs，目录号：S1407），重悬于无RNA酶的水中至10mM。
Cap类似物7GpppG（New England Biolabs，目录号：S1404），重悬浮于无RNA酶的水中至10mM。
无RNase的水（例如，来自Millipore Synergy水纯化系统，18.2MΩcm）。
单链DNA正义寡核苷酸
单链DNA反义寡核苷酸
5'CATGCAAATTAACCCTCACTAAA GGGAGA CCGGAATTCGAGCTCGCCCGGGGATC 3'用于T3转录模板，重悬于无RNA酶的水中至100μM（例如，由Integrated DNA Technologies（IDT）合成;加下划线的是T3启动子序列，粗体序列与转录的32个核苷酸（nt）pppRNA相匹配）
5'GATCCCCGGGCGAGCTCGAATTCCGGTCTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTGCATG 3'用于T3转录模板，重悬浮于无RNA酶的水中至100μM（例如，由IDT合成）。
MEGAscript T3转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Ambion，目录号：AM1138）
用于尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳的预制聚丙烯酰胺微型凝胶（尿素-PAGE;例如，Bio-Rad Laboratories，目录号：4566053）
用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的预制聚丙烯酰胺微型凝胶（SDS-PAGE;例如，Bio-Rad Laboratories，目录号：4568094）
2个Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610737）
SYBR Gold核酸凝胶染色（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：S11494）
RNA大小标记（例如，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM7778）。
2x RNA加载染料（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0641）
40U /μlRNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10777019）
重组三磷酸酶 - 鸟苷酸转移酶加帽酶（见注1）
[α-32P] GTP（3000Ci / mmol，PerkinElmer，目录号：BLU506H250UC）
RNA Clean＆amp; Concentrator-5试剂盒（Zymo Research，目录号：R1016）
ScintiSafe Econo 1闪烁液（Fisher Scientific，目录号：SX20-5）
注意：此产品已停产。
McCoy的5A培养基（用于U2OS细胞; Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：16600082）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM;用于HEK293细胞; Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：21013024）
胎牛血清（FBS; Atlanta Biologicals，目录号：S10350）
磷酸盐缓冲盐水（PBS;例如，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010049）
Bio-Rad蛋白分析染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
预染的蛋白质标记物（例如，Bio-Rad Laboratories，目录号：1610393）
将牛血清白蛋白（BSA;例如，Fisher Scientific，目录号：BP1600-100）溶于水中至1μg/μl
用于蛋白质印迹的核蛋白抗体（例如，兔多克隆抗核仁抗体，1：5,000工作稀释度，Sigma-Aldrich，目录号：N2662）。
用于蛋白质印迹的抗细胞质蛋白抗体（例如，小鼠单克隆抗α-微管蛋白，1：10,000工作稀释度，Sigma-Aldrich，目录号：T6199）
用于红外成像的适当二级抗体（例如，用于红外成像的Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-21109和A-21058，以1:10,000的工作稀释度）。
（可选）痘苗加帽酶（新英格兰生物实验室，目录号：M2080S）
二硫苏糖醇（DTT，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0861）
无RNase的10x Tris /硼酸盐/ EDTA（TBE）缓冲液（例如，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15581）。
苯基甲基磺酰氟（PMSF; Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：36978）
异丙醇
Tris（例如，VWR，AMRESCO，目录号：0497）
甘氨酸（例如，VWR，AMRESCO，目录号：0167）
SDS
甲醇（例如，Fisher Scientific，目录号：A452SK-4）
氯化钠（NaCl;例如，Fisher Scientific，目录号：BP358）
5M NaCl（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9759）。
浓缩HCl
吐温20（例如，Fisher Scientific，目录号：BP337）
32mM S-腺苷甲硫氨酸（SAM; New England Biolabs，目录号：B9003）
pH5.2的3M乙酸钠（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R1181）。
硫酸铵（例如，Sigma-Aldrich，目录号：A4418）
IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
1M Tris-HCl，pH 7.5（例如，AMRESCO，目录号：E691）。
1M氯化镁（MgCl 2，例如，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9530G）。
500mM乙二胺四乙酸，pH8.0（EDTA;例如，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15575020）。
甘油（例如，Fisher Scientific，目录号：BP229-1）
1M HEPES pH 7.3（例如，AMRESCO，目录号：J848）
2M氯化钾（KCl;例如，Alfa Aesar，目录号：J75896）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
磷酸酶抑制剂混合物2（Sigma-Aldrich，目录号：P5726）
磷酸酶抑制剂混合物3（Sigma-Aldrich，目录号：P0044）
1 M DTT（见食谱）
1x Tris缓冲盐水（TBS;见食谱）
1×TBE（尿素-PAGE的运行缓冲液）（见食谱）
20 mM DTT（见食谱）
在异丙醇中的100mM PMSF（见食谱）
10倍Tris /甘氨酸（见食谱）
10％（w / v）SDS（见食谱）
用于SDS-PAGE的Tris /甘氨酸/ SDS运行缓冲液（见配方）
Tris /甘氨酸/甲醇/ SDS转移缓冲液（见食谱）
20倍Tris缓冲盐水（TBS）（见食谱）
3％BSA在TBS（见食谱）
40％（v / v）吐温20（见食谱）
TBS-T（见食谱）
1μMSAM（见食谱）
500 mM乙酸钠，pH 5.2（见食谱）
0.4 M硫酸铵
10％IGEPAL CA-630（v / v）在水中（见食谱）
10倍退火缓冲液（见食谱）
4倍加盖缓冲液（见食谱）
YO裂解缓冲液（见食谱）
YO缓冲区A（请参阅食谱）
10倍帽甲基化缓冲液（见食谱）

设备

眼睛保护
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher，型号：NanoDrop TM 1000，目录号：ND-1000）
用于处理32P（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：6700-2418）的璐彩特/有机玻璃丙烯酸台面屏蔽 br />
盖革计数器
公制（厘米）标尺
剪刀（，Westcott，目录号：ACM44217）
石墨铅笔
长的（至少18厘米）镊子或夹钳（例如，Fisher Scientific，产品目录号：15-186）
P10，P20，P100和P1000移液管
热循环仪（例如，MJ Research，型号：PTC-200）
加热块（例如，Bioer，型号：MB 101）
-80°C冷冻机
手持式254nm紫外光（例如，UVP，型号：95-0016-14）
液体闪烁计数器（例如，Beckman Coulter，型号：LS 6000IC）
水套培养箱（Thermo Fisher Scientific Thermo Scientific TM ，型号：Forma II系列）设置为37°C，5 ％CO 2
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5415 R）
可编程旋转混合器（Grant Instruments，型号：PTR-30）在4°C下设置为10 rpm轨道旋转
紫外可见分光光度计（例如，Beckman Coulter，型号：DU 640）设置为595nm。
用于PAGE和膜转移的电泳系统（例如，Bio-Rad Laboratories，目录号：1660828EDU）
不透明的蛋白质印迹孵育盒（例如，LI-COR，目录号：929-97205）
蛋白质印迹成像系统（例如，LI-COR，模型：奥德赛成像系统）
矩形玻璃TLC腔室（例如，Miles Scientific，型号：A70-22，以前为Analtech）
电吹风机（可选）
存储荧光屏（例如，GE / Amersham Biosciences）
用于存储荧光屏（例如，分子动力学图像擦除器）的轻擦。
台风成像系统（例如，GE Healthcare，Amersham Biosciences，型号：Typhoon 9200）

软件

Microsoft Excel软件
ImageQuant TL软件

程序

图1给出了该方案的示意图。简而言之，使用[α-32 P] GTP将体外转录的短RNA进行鸟苷酸化以产生Gp * ppRNA底物，放射性标记的磷酸盐用星号表示。将该GpppRNA底物与核或细胞质提取物（或其他生物样品）和SAM短暂温育。每种提取物中不同水平的帽甲基转移酶活性将导致GpppRNA底物产生差异N7-甲基化以产生mβ7GpppRNA。然后用P1核酸酶将GpppRNA和mt7 GpppRNA的混合物消化为单个核苷酸，保留放射性标记的帽二核苷酸结构完整，最终通过TLC和磷成像分析。

图1.帽甲基转移酶活性测定的示意图

用于帽甲基转移酶活性测定的放射性标记的GpppRNA底物的制备（参见注释3）
1. 准备一个30毫升混合物在一个0.2毫升的PCR管结合以下内容：15微升无RNase的水，3微升10x退火缓冲液（见食谱），6微升100μMssDNA有义寡核苷酸，6微升100微米ssDNA反义寡核苷酸。
2. 为了使两种寡聚物变性然后缓慢退火以产生用于T3转录的双链DNA模板，将混合物置于98℃的热循环仪中2分钟，并在60分钟内将温度从98℃升至20℃（1.3 °C每分钟，降至20°C）。将此dsDNA管转移到冰上，并在另一个试管中，用无RNase的水稀释20倍，制备1μM（1pmol/μl）工作物。
3. 使用MEGAscript T3转录试剂盒中提供的组分，通过按以下顺序组合，在0.2 ml PCR管中制备20μl反应：6μl无RNA酶的水，2μl75 mM ATP，2μl75 mM CTP ，2μl75mM GTP，2μl75mM UTP，2μl10×T3反应缓冲液，2μl1μMdsDNA模板，2μlT3 RNA聚合酶混合物。轻轻混合，并在37°C孵育16-24小时。这种延长的反应时间可以转录高产量的32 nt 5'三磷酸RNA（pppRNA）。
4. 通过加入30μl无RNase的水将T3转录反应产物混合物加至50μl，并根据制造商的说明使用NucAway Spin Column进行纯化。
5. 使用NanoDrop测量纯化的pppRNA的浓度。根据我们的经验，在24小时的转录反应后应该回收至少7-8微克的pppRNA。计算假设分子量为10,830.3 g / mol的pppRNA摩尔浓度。
6. 通过15％聚丙烯酰胺尿素-PAGE进一步评估pppRNA的纯度。在1x TBE中以1：20,000的稀释度用SYBR Gold进行后染色后，在紫外光下低至150fmol（1.6ng）的pppRNA /泳道应足以可见。
  pppRNA应该以预期的大小运行
7. pppRNA应储存在-20℃或-80℃的小等分试样中以避免多次冻融循环。
8. 为了制备40μl封端（鸟苷酸化）反应，将以下组分在冰上的1.7ml试管中：RNase-free水（总共40μl），10μl4x加帽缓冲液（参见食谱），1μl （参见注释1），24 pmol（总GTP）[α-32 P] GTP（参见注释4）。轻轻混合并在30°C孵育3 h，然后通过在65°C孵育10 min进行加热灭活。
9. 将1.33μl（1/30）封端反应产物转移至冰上的新管中以作为闪烁计数的“输入”。通过加入11.33μl无RNase的水使加盖反应物达到50μl。使用Zymo RNA Clean＆amp; Purification TM纯化RNA。 Concentrator-5试剂盒按照制造商的说明使用30μl无RNase的水进行最终洗脱步骤。将纯化的RNA返回到冰上，并将1μl（1/30）转移至冰上的新试管用于闪烁计数。
10. 将预留的1/30封盖反应“输入”和纯化的RNA样品各自与1.5ml ScintiSafe Econo 1闪烁液混合并转移至闪烁瓶中。通过闪烁计数测量每种混合物的放射性。根据下式确定纯化的[32 P] G加帽的RNA的浓度：[GpppRNA]（单位μM）=（24pmol）×（纯化计数/输入计数）/（30μl ）。
11. 纯化的[32 P] G加帽RNA可以保存在-20°C，但应在几天内使用以限制放射性衰变。确定在甲基转移酶活性测定中使用的适当量时，请务必考虑放射性衰变。
哺乳动物细胞的核和细胞质提取物的制备
1. 提前2至3天，将含有U2OS，HEK293或其他类型的贴壁哺乳动物细胞的10-cm或15-cm种子播种，使得收集时皿将达到〜80-90％汇合。 U2OS细胞应该在含有10％（v / v）FBS的McCoy's 5A培养基中生长; HEK293细胞应该在含有10％（v / v）FBS的DMEM中生长。细胞应在培养箱中培养，温度设定为37℃，5％CO 2。
2. 在收获细胞的当天，在冰上制备YO裂解缓冲液和YO缓冲液A（参见食谱），留下DTT，PMSF，蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，直至使用缓冲液之前。
3. 从贴壁细胞中取出培养基，用PBS冲洗并除去，然后通过刮入1ml PBS收集并转移到1.7ml离心管中。轻轻沉淀细胞（70℃×g，10分钟，4℃），然后通过抽吸小心取出上清液PBS。记下细胞团的大致体积，并将管置于冰上。
4. 为了制备细胞质提取物，立即加入相当于每个细胞沉淀体积4-5倍的YO裂解缓冲液。使用P1000移液器的10个上下笔划轻轻地重悬细胞。将细胞在冰上孵育10分钟，然后与P1000移液器的另外5个上下冲程混合。沉淀细胞核（16,100×g，4℃10分钟），然后将细胞质提取物上清液转移到新的预先冷冻的1.7ml冰上。
5. 使用P10移液器小心地去除核颗粒中残留的细胞质提取物。为了制备核提取物，加入4-5个原始细胞沉淀体积的YO缓冲液A，并用P200移液管的15个上下冲程重新悬浮每个核沉淀。将试管在4℃下颠倒孵育20分钟，然后沉淀核碎片（4,100℃下16,100μg×g 5分钟）。
  将核提取物上清液转移至新的预先冷冻的1.7ml冰管中。
6. 使用Bio-Rad蛋白质测定染料试剂浓缩物，根据制造商的说明书并使用牛血清白蛋白（BSA）在0,1,2,4,6和6的标准曲线，通过Bradford测定法测量每种提取物中的蛋白质浓度8微克/毫升。在1x染料试剂中稀释250倍至500倍的提取物通常在测定的线性范围内进行测量。使用Microsoft Excel等程序，使用BSA标准曲线的最佳拟合线计算蛋白质浓度。
7. 对于帽甲基转移酶活性测定，准备15-20μL每个提取物样品在新的，预先冷却的管冰上。如果比较核提取物和细胞质提取物，确保这些提取物处于相同的缓冲液组成中是至关重要的。这可以通过首先将所有提取物与相同的蛋白质浓度（通常为0.5-1.0μg/μl;这样的计算可以通过诸如Microsoft Excel的软件极大地辅助）与使用相同的缓冲液之前（即，用于细胞质提取物的YO裂解缓冲液和用于核提取物的YO缓冲液A），然后将每个样品与等体积的其他缓冲液（即，YO缓冲液A用于细胞质提取物和YO裂解缓冲液核提取物）。
  在-80°C下将这些提取物样品以小份储存。
8. 通过在SDS-PAGE上运行核和细胞质提取物然后进行蛋白质印迹分析来评估亚细胞分级的质量。使用核和细胞质对照抗体（例如针对核仁素和微管蛋白）可以确定在分离过程期间是否发生交叉污染。有关预期的Western印迹结果的例子，请参见2017年Trotman等人图1C。
制备用于帽甲基转移酶活性测定的TLC板
1. 戴上干净的手套，用干净的尺子和剪刀将20×20厘米的PEI纤维素薄层板切成四块10×10厘米的方块。我们建议使用清洁镊子来处理印版，以限制与手套上可能存在的任何污染物接触。将所有未使用的培养板储存在4°C。请参阅关于TLC性能的注释2。
2. 用尺子和铅笔从10×10厘米板的底部边缘轻轻画出距离底部边缘1.5厘米的微弱直线（原点）。在相距1厘米的原点上绘制微弱的刻度标记，以指示样品将被点样的位置。图2显示了一个薄层色谱板的例子。
  
  图2.薄层色谱板制备示例
3. 用无RNase水预先运行TLC板。为此，用足够的水填充矩形玻璃TLC室以覆盖底部（上述模型中大约60毫升），使得水深不超过0.75厘米。使用长镊子，轻轻地将TLC板直立放入水中。注意确保左右边缘同时进入水中，因为这将促进水向TLC板上的均匀迁移。该预运行步骤将污染物强制到TLC板的顶部，并极大地提高了对甲基转移酶活性测定样品进行后续色谱分析的性能。
4. 一旦水已经到达TLC板的顶部，从室中取出TLC板并使其风干。
  。用手摇动板子或使用商用吹风机（不加热）可以加速这一过程。
5. 预润滑的TLC板可以在4°C下储存至少2周。
Cap甲基转移酶活性测定
1. 在冰上解冻组分后，按照下列顺序合并下列物质，在冰上1.7ml试管中制备10μl帽甲基转移酶反应：无RNA酶的水（总体积10μl），1μl10x帽甲基化缓冲液（参见食谱），1 μl1μMSAM，1μl20mM DTT，1μlRNaseOUT，1μg总蛋白的核或胞质提取物，5fmol [32 P] G-加帽的RNA。如果使用大量提取物样品，建议使用反应组分的主混合物（省略提取物）。轻轻混合，在37°C孵育30分钟，然后立即回到冰上。
2. 向每个管中加入40μl无RNA酶的水，并使用Zymo Clean＆amp; Concentrator-5试剂盒按照制造商的说明使用7μl无RNase的水进行最终洗脱步骤。将纯化的RNA置于冰上。
3. 通过依次组合以下步骤，在1.7ml管中的冰上制备7μlP1核酸酶消化反应：将5.0μl来自帽甲基转移酶反应的纯化RNA，0.6μl不含RNase的水，0.7μl500mM乙酸钠pH5.2,0.7μl的0.625U /μlP1核酸酶。轻轻混合并在37°C孵育30分钟。样品现在可以储存在-20°C或立即分析。
4. 在预先运行的PEI纤维素薄层色谱板的原点上的1厘米刻度线上，使用P10移液管仔细检测1μlP1核酸酶消化产物。让斑点完全空气干燥，然后在与之前相同的位置上再添加1μlP1消化产物。作为对照，还在单独的刻度标记或标记上点出2μl（每次1μl）10mMGpppG和10mMm7GpppG标准（参见注释5）。
5. 使斑点完全空气干燥后，使用长镊子将TLC平板直立放置在包含约60ml 0.4M硫酸铵流动相的矩形TLC室中。让流动相向上发展，离原点约6-7厘米，然后从腔室中取出TLC板。让TLC板完全空气干燥，可以通过手摇或使用吹风机加热而不加热。
6. 佩戴适当的眼睛和皮肤保护，在手持254nm紫外光下观察TLC板以确定GpppG和mpp7GpppG标准的位置。这些可以通过用铅笔标记位置或用手持相机拍摄照片来指出。
7. 用薄膜包裹TLC板，使正面覆盖一层。将TLC板放入存储荧光屏幕盒中，将磁带的顶部边缘贴在磁带上以保持其位置。将最近清除光的存储荧光屏置于TLC板上，关闭盒子，并在室温下暴露至少16小时以获得最大信号。
8. 从盒中取出薄层色谱板，并将Typhoon成像仪设置为荧光模式，对存储荧光屏进行成像。典型的结果如图3所示。
  
  图3.典型的荧光图像结果为了证明重现性，用U2OS细胞核和细胞质提取物进行所述活性测定的四个技术重复。

数据分析

在帽甲基转移酶反应过程中（并且通过延伸，存在于相应生物样品中的帽甲基转移酶活性），GpppRNA向mβ7GpppRNA的转化程度由mβ7 GpppG斑点强度与TLC板荧光图像上的GpppG和m7GpppG斑点强度的总和。斑点强度可以使用任何包括密度测定分析的图像软件来确定，例如ImageQuant TL。为了确保对多个样品的斑点强度进行一致的计算，请使用尺寸相同的通道或箱子，以便适合整个光斑进行密度测定分析。同时确保减去任何背景信号;在ImageQuant TL中，我们使用“橡皮筋”设置来确定峰值信号积分的基线。为了在比较多种条件时解释样品之间的生物变异性，最好使用至少三个生物学重复实施该测定以便进行适当的统计测试。

笔记

我们用于产生放射性标记的GpppRNA的重组人类加帽酶如Trotman等人所述在室内生产。（2017）。尽管这种酶库与非放射性标记的GTP具有强大的封闭活性，放射性标记的GpppRNA的产生效率相当低。如果重组加帽酶不可用，我们推荐使用商业上可获得的酶，如牛痘加帽酶（NEB，目录号M2080S），以产生如先前报道中所用的GpppRNA（Pillutla等人， 1998年; Cowling，2010年）。如果使用痘苗加帽酶来产生GpppRNA，请确保从此反应中省略SAM，因为此酶也含有帽甲基转移酶活性。
与大多数类型的色谱系统不同，TLC的流速是可变的并且不能根据van Deemter方程式（van Deemter等人，1956; Guiochon等人。，1979）。在TLC中，毛细管流速取决于诸如TLC板的粒度之类的性质，其可以从制造商到制造商显着变化。因此，我们发现一些生产商的PEI纤维素板比其他生产商的纤维板分辨率更糟糕，分辨率更差，这里列出的Macherey-Nagel板可以给出我们在给定条件下测试的最佳性能。
任何短的体外转录RNA（带有5'三磷酸）应该适合于产生放射性标记的GpppRNA底物，并且如果需要，可以修改该方案以产生其他GpppRNA底物。这里提出的方案简单地描述了一种简单的方法来生成用于人RNMT（Pillutla等，，1998）和我们最近的研究（Trotman等，1998）的初始表征中的相同的32nt底物RNA。 et al。，2017）。
使用新鲜的[α-32 P] GTP以最大化原料中放射性与非放射性GTP的比例，这将允许在成像过程中获得更大的信号强度。为了考虑[α-32 P] GTP库存的放射性衰减，我们推荐使用PerkinElmer放射性计算器（ https://www.perkinelmer.com/tools/calculatorrad ）来确定使用当天的总GTP浓度。
作为用于显现mGpppG位置并确保检测成功的额外对照，我们建议使用重组帽甲基转移酶（例如来自NEB的痘苗加帽酶）制备平行帽甲基转移酶活性反应。
放射性同位素32 P发射β粒子，如果处理不当，可能有害。为确保在处理 32 P时的安全性，请始终佩戴护目镜和皮肤保护装置，在丙烯酸屏蔽罩后工作，并使用盖革计数器经常检查表面是否有污染。我们建议使用一套专用的移液管以防放射性物质被污染。将所有放射性样品在4°C或-20°C储存在二级压克力储存盒中。清理溢出物，无论多小，并在泄漏量足够大的情况下通知实验室人员和相应的安全官员。所有放射性废物应放置在丙烯酸废物箱中至少10个半衰期（大约143天）以使其储存衰变。
请联系您所在机构的辐射安全办公室

食谱

1 M DTT
将1.54克DTT溶于无RNA酶的水中，使其总体积为10毫升。分装并储存在-20°C
1x TBE（尿素-PAGE的运行缓冲液）
将100毫升不含RNase的10x TBE（试剂＃47）用无RNase的水加至1 L。在室温下储存。
20 mM DTT
将20μl1 M DTT加入1 ml无RNase的水中。分装并储存在-20°C
在异丙醇中的100mM PMSF
将1.74g PMSF溶于异丙醇中至总体积10ml。分装并储存在-20°C
10x Tris /甘氨酸
将30g Tris和144g甘氨酸溶于无RNA酶的水中至总体积1μl。在室温下储存。
10％（w / v）SDS
将10g SDS溶于无RNA酶的水中至总体积100ml。在室温下储存。
用于SDS-PAGE的Tris /甘氨酸/ SDS运行缓冲液 890毫升无RNase水
100毫升10x Tris /甘氨酸
10 ml 10％（w / v）SDS
Tris /甘氨酸/甲醇/ SDS转移缓冲液
向200ml甲醇中加入500ml无RNase的水，然后加入100ml 10x Tris /甘氨酸和1ml 10％（w / v）SDS。
加入无RNase的水至总体积1 L，并储存于4°C
20倍Tris缓冲盐水（TBS）
将48.4克Tris和160克NaCl溶解在800毫升无RNase的水中并用浓HCl将pH调节至7.6。用不含RNase的水将总体积加至1L并储存在室温下。
3％BSA在TBS
向1.5克BSA中加入2.5毫升20×TBS，并溶于无RNA酶的水中至总体积为50毫升。在4°C储存
40％（v / v）吐温20
将20ml吐温20与无RNase水混合至总体积50ml。在室温下储存。
TBS-T

474毫升无RNase水 25毫升20x TBS

1.25毫升40％（V / V）吐温20
1μMSAM
用无RNase的水稀释32 mM SAM 320倍，产生100μM的原液，然后用无RNase的水稀释100μM的原液100倍。分装并储存在-20°C
500mM乙酸钠，pH 5.2
用无RNase的水稀释3M柠檬酸钠，pH5.2 6倍。在室温下储存。
0.4 M硫酸铵

将52.86克硫酸铵溶于无RNA酶的水中溶解至1升。室温下储存
10％IGEPAL CA-630（v / v）加入不含RNase的水至1 ml IGEPAL CA-630至总体积10 ml。在室温下储存。
10倍退火缓冲液
100mM Tris-HCl pH 7.5
500 mM NaCl
4倍加盖缓冲液
40 mM Tris pH 7.5
12mM MgCl 2·/ 2 4 mM DTT
0.4 mM EDTA
80％（v / v）甘油
YO裂解缓冲液
10 mM HEPES pH 7.3
10 mM KCl
10mM MgCl 2 2/2 0.2％（v / v）IGEPAL CA-630
2 mM DTT *
0.5毫米PMSF *
7.5μl/ ml蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）*
7.5μl/ ml磷酸酶抑制剂混合物2（Sigma-Aldrich）*
7.5μl/ ml磷酸酶抑制剂混合物3（Sigma-Aldrich）*
YO缓冲区A
10 mM HEPES pH 7.3
25％（v / v）甘油
420 mM NaCl
1.5mM MgCl 2 2/2 0.2mM EDTA
1 mM DTT *
0.5毫米PMSF *
7.5μl/ ml蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）*
7.5μl/ ml磷酸酶抑制剂混合物2（Sigma-Aldrich）*
7.5μl/ ml磷酸酶抑制剂混合物3（Sigma-Aldrich）*

*注意：在使用缓冲区之前立即添加。

10倍帽甲基化缓冲液
500 mM Tris pH 8
60 mM KCl
12.5mM MgCl2·2/2

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（至D.R.S）R01拨款GM084177的支持。 J.B.T.由美国国立卫生研究院T32培训资助GM08512（俄亥俄州立大学）和俄亥俄州立大学RNA生物学中心的博士后研究员资助。这里介绍的协议是从Pillutla et al。，1998年，Otsuka et al。，2009年和Cowling 2010年的那些改编的，并用于Trotman et al。，2017。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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