材料和试剂

黑色组织培养板96孔平底（Greiner Bio One International，目录号：655090）
Parafilm
铝箔
+ 和 pks - 大肠杆菌菌株（储存在-80℃的LB 20％甘油中）
注：在作者的实验室中通常用作阳性对照的菌株是益生菌菌株Nissle 1917或共生菌株M1 / 5。用作阴性对照的菌株是K-12菌株MG1655。我们的实验室可提供这些菌株。
HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2），最多20代传代
Lennox L肉汤培养基（LB培养基; Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：12780029）
带有25mM HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：42430）的Dulbecco's改良伊格尔培养基（DMEM）
Hanks平衡盐溶液（HBSS; Sigma-Aldrich，目录号：H8264）
庆大霉素溶液50mg / ml（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS; Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖，GlutaMax补充物，丙酮酸盐（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：31966021）
胎牛血清（FBS; Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270106）
非必需氨基酸溶液（NEAA）100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：11140035）
多聚甲醛（PFA）20％（Electron Microscopy Sciences，目录号：15713）
10x PBS（Sigma-Aldrich，目录号：D1408）
氯化铵（NH4Cl; BioUltra，Sigma-Aldrich，目录号：09718-250G）
Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-500ML）
MAXblock阻塞介质（Active Motif，目录号：15252）
磷酸酶抑制剂PHOSTOP（10倍，Roche Diagnostics，目录号：04906837001）
RNase（Sigma-Aldrich，目录号：R6513）
氯化钠（NaCl; Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8032）
兔单克隆抗γ-em2AX抗体（Cell Signaling Technology，目录号：9718）
IRDye TM 800CW缀合的山羊抗兔二抗（2mg / ml，Biotium（经销商Interchim），目录号：20078）
RedDot TM 2（200x在DMSO中，Biotium（分销商Interchim），目录号：40061）
HeLa细胞培养基（见食谱）
固定解决方案（请参阅食谱）
中和解决方案（请参阅食谱）
10％Triton X-100（见食谱）
透化溶液（见食谱）
阻止解决方案（请参阅食谱）
透化溶液（见食谱）
PST缓冲区（请参阅食谱）
100倍叠氮化物（见食谱）
Anti-em -H2AX解决方案（请参阅食谱）
二抗（见配方）

设备

37°C，5％CO 2培养箱用于细胞培养
37°C培养箱用于细菌培养
具有680和800 nm通道的酶标仪（这里是Odyssey红外成像扫描仪，Li-Cor ScienceTec，法国Les Ulis）
用于600 nm吸光度测量的酶标仪（TECAN Infinite Pro）
用于测量细菌培养物在600nm处的吸光度的比色计（Biochrom，型号：WPA CO7500）
变速摇臂（VWR，目录号：75832-308）
化学安全罩
洁净工作台
倒置显微镜（奥林巴斯，型号：CKX31）
移液器和多通道微量移液器30-300微升

软件

GraphPad Prism 6.0

程序

第1天

将细菌在3ml LB中从-80℃甘油贮存液中或在LB琼脂平板上的菌落在37℃下振荡（220rpm）培养过夜。
将HeLa细胞分配在具有透明底部（1.5×10 4个细胞/孔）的黑色96孔组织培养板中并在37℃在200μlHeLa细胞培养基中生长24小时（参见食谱） °C在CO 2培养箱中培养。
注意：重要的是，不要在左下两个孔中分配任何细胞（见图1：平板感染方案）。

图1.平板感染实例的示意图。细菌以两份第一行接种（一式两份，以200μl/孔的DMEM-HEPES培养基），MOI为50，然后2倍连续稀释（通过连续转移100μl到下面的行）。最终体积为100μl。
左栏保存为控件（红色的井栏）。

第2天

细菌制剂
通过在5ml DMEM-HEPES培养基（即1:100稀释）中稀释50μl过夜培养物来细菌培养，并在37℃搅拌（220rpm）下培养直至平均OD 600nm = 0.6。通过测量1ml培养物的OD 600nm来确定每ml细菌的数量。
注意：大肠杆菌的典型值是1单位的OD 600nm对应于5×10 8 8×10 6个细胞。 /细菌/ ml。
HeLa细胞制备
1. 在感染之前，用预热（37℃）HBSS仔细洗涤真核细胞一次。
2. 在所有孔中加入100μlDMEM-HEPES培养基，除了第2行外，对应于每孔加入200μlDMEM-HEPES培养基的最高细菌数量（最大感染复数或MOI）（图1 ）。
感染测定
1. 确定感染复数（MOI =感染开始时每HeLa细胞的细菌数量）后，将适当数量的细菌加入平板的前2行（含有200μlDMEM-HEPES培养基）中。 br />
2. 进行2倍系列稀释以产生感染剂量效应，在100μl的最终DMEM-HEPES培养基体积中（图1）。
  注：例如，对于50的MOI，添加50 x 1.5 x 10 4 = 75 x 10 对于含有1.5×10 4 HeLa的孔的细菌来说，细胞。 MOI计算中会考虑分配的单元格数量。
3. 将培养板在细胞培养箱中培养4小时。
感染结束和感染后孵化
1. 感染4小时后，用酶标仪测量600nm处的吸光度，以监测细菌生长。 MOI 50的典型值为0.2-0.3。
2. 然后，用增加体积的预热（37℃）HBSS（100μl，150μl，最后200μl）仔细洗涤细胞至少3次。在倒置显微镜下观察平板以检查大部分细菌是否被除去。如果需要，可以执行额外的清洗。
3. 最后，将细胞在200μl细胞培养基（参见配方）中用200mg / ml庆大霉素在细胞培养箱中孵育3小时。
细胞固定
1. 细胞在冷的PBS（100μl）中仔细洗涤三次。
2. 在化学安全罩下加入100μl固定溶液（参见食谱）20分钟。
多聚甲醛中和
1. 固定步骤后，在快速搅拌（变速振荡器，20-25rpm）下用PBS（每孔100μl）洗涤细胞5分钟。该洗涤步骤重复3次。
2. 然后，通过在缓慢搅拌（3-5rpm）下加入50μl中和溶液（参见配方）2分钟来中和多聚甲醛。
细胞透化
1. 如前所述（步骤6），在快速搅拌（20-25rpm）下用PBS，每孔100μl洗涤细胞3次，每次5分钟。
2. 然后在缓慢搅拌下用冷透化溶液使细胞透化（参见食谱），每孔50μl，5分钟。
阻止步骤
1. 在搅拌下（20-25rpm），用PST缓冲液（参见食谱）将细胞洗涤3次，每孔100μl。
2. 然后，加入50μl/孔的封闭溶液（参见配方），并将板在搅拌（3-5rpm）下在室温下温育60分钟。
抗-γ-H2AX免疫染色步骤
1. 在免疫染色之前，用PST缓冲液洗涤细胞3次，100μl在搅拌（20-25rpm）下5分钟。
2. 每孔加入25μl抗-γH2-H2AX溶液（参见配方）并将板在室温下温育2小时或在4℃下过夜（在这种情况下，板必须小心地用Parafilm密封以避免干燥），在搅拌下（3-5rpm）。
  注意：这个解决方案并不添加到对照A和C（图1）中，而是在孵育时间内添加25μl的PST缓冲液。
次要检测步骤
1. 首先用PST缓冲液将细胞洗涤3次，每孔100μl在搅拌（20-25rpm）下5分钟。
2. 使用在PST缓冲液中吸收800nm（1 / 1,000）的红外荧光染料缀合的IRDye TM 800CW缀合的山羊抗兔抗体进行二次检测。对于DNA标记，将PST中的1 / 1,000稀释的RedDot TM TM2与二抗一起使用（参见配方中的二抗溶液），在每个孔中每孔25μl。
3. 在搅拌下（3-5rpm）将板在黑暗中孵育1小时
平板扫描步骤
1. 将板在PST缓冲液中洗涤3次，每孔100μl，在搅拌下（20-25rpm）在模糊（用铝箔覆盖）下处理5分钟。
2. 然后，通过在组织上微调并轻轻拍打来干燥平板。
3. 使用具有680nm荧光团（红色）和800nm荧光团（绿色染料）的奥德赛红外成像扫描仪分别使DNA和γ-H2AX可视化（图3A）。
注意：一旦板干燥（步骤11b），它可以保存好几个月，在4°C避光，颠倒，在可视化之前。

数据分析

可以使用从扫描获得的荧光值（以RFU计）进行DNA双链断裂频率的定量分析（图2和3B）。首先，每个细胞的平均γ-H2AX荧光通过将测量的每孔（在800nm处）的γ-H2AX荧光除以相应的测量的RedDot-标记的荧光每孔DNA（680nm）（图2）。将每个细胞的γ-H2AX荧光值除以用作媒介物对照的两个孔（在此对应于图1和2中标记为'C'的孔获得的800nm处的平均荧光值）以确定相对于媒介物对照的H2AX水平的磷酸化百分比变化。所获得的数字被定义为遗传毒性指数（或γ-γ2AX倍数诱导），并且在完全健康的细胞中通常为0-2，在用产生colibactin的细胞感染的细胞中为5-7，大肠杆菌MOI 25（图2和图3B）。

图2. γ -H2AX量化的数据分析。我们如何处理来自原始数据的数据到计算 -H2AX倍数诱导（基因毒性指数）的代表性图像。

图3.用感染的HeLa细胞对来自感染的HeLa细胞的磷酸化的H2AX（γ -H2AX）进行定量分析 + 电子。大肠杆菌或与 pks - 大肠杆菌：一种。合并检测总DNA（红色，680nm）和γ-em -H2AX（绿色，800nm）的In-Cell Western板图像的实例。在感染E的细胞的高MOI下可以观察到高水平的γ-H2AX。大肠杆菌pks + 。 B.相对于对照（未感染的细胞）计算的γ-γ2AX倍数诱导（与每孔细胞量标准化的γ-H2AX荧光）显示出与由非产生colibactin的细菌感染的细胞相比，取决于产生colibactin的细菌（大肠杆菌pks + +）感染的细胞中的MOI的基因毒性剂量反应（<大肠杆菌菌株 - ）。图中表示的数据来自两个生物学重复和两个独立实验。数据使用GraphPad Prism 6.0进行绘图。显示标准偏差（sd）的平均值。

食谱

HeLa细胞培养基
450毫升DMEM高糖与丙酮酸和GlutaMax
50毫升胎牛血清
5毫升NEAA
固定液（1x PBS，4％PFA）
5毫升PFA储备液
5毫升20％10x PBS
40毫升蒸馏水
分装并储存在-20°C

在实验当天解冻一个等份
中和溶液（20mM NH 4 Cl在PBS中）
一个。准备在蒸馏水中的储备溶液（1M NH4Cl），并储存在4°C。
湾将原液溶解在PBS中以达到适当浓度
C。继续冰，直到使用
10％Triton X-100

50μlPBS中的500μlTriton X-100 该解决方案可以在4°C下保存2-3周
透化溶液（1x PBS，0.2％Triton X-100）
200μl10％Triton X-100
10毫升PBS
继续冰，直到使用
阻断液（MAXblock阻断介质，1x PHOSTOP抑制剂，RNase [100μg/ ml]）

4.5 ml MAXblock阻挡介质 500μl10x PHOSTOP抑制剂
50μlRNase储备溶液（PBS中10mg / ml，10mM HEPES pH7.5,15μMNaCl，等分试样储存在-20℃）
继续冰，直到使用
PST缓冲液（PBS，2％胎牛血清，0.2％Triton X-100）
48毫升PBS
1毫升2％胎牛血清

1ml 0.2％Triton X-100 PBS
100倍叠氮化物
将叠氮钠溶于蒸馏水中，终浓度为50 mg / ml（5％w / w），储存于4°C。
抗-γH2AX溶液（在PST缓冲液中的兔单克隆抗-γ2H2AX[1/200]，500μg/ ml叠氮化物）
1.5毫升PST缓冲液
7.5μl抗-γ<-H2AX

15μl100x叠氮化物注意：此解决方案可重复使用2-3次，并在5°C下保存数周。
二级抗体溶液（IRDye TM 800CW山羊抗兔[1 / 1,000]，RedDot TM 2 [1/1000]在PST缓冲液中）。
2.5毫升PST
2.5μlIRDye TM 800CW山羊抗兔
2.5μlRedDot TM 2 2

致谢

该协议改编自以前发表的作品（Audebert等人，2010; Martin等人，2013; Bossuet-Greif等人，，2016; Tronnet等人，2017）。这项工作得到了法国国家法律研究所的资助[ANR-13-BSV3-0015-02，ANR-13-BSV1-0028-01]。作者声明没有利益冲突或利益冲突，关于本议定书的发表。

参考

Audebert，M. Riu，A.，Jacques，C.，Hillenweck，A.，Jamin，E. L.，Zalko，D.，Cravedi，J. P.（2010）。使用γH2AX测定法评估人类细胞系中多环芳烃的基因毒性。 Toxicol Lett 199：182-192。
Bossuet-Greif，N.，Belloy，M.，Boury，M.，Oswald，E。和Nougayrede，J。（2017）。使用产生colibactin的大肠杆菌菌株感染HeLa细胞的方案和定量诱导的DNA-损坏。 Bio-protocol 7（16）：e2520。
Bossuet-Greif，N.，Dubois，D.，Petit，C.，Tronnet，S.，Martin，P.，Bonnet，R.，Oswald，E。和Nougayrede，J.P。（2016）。大肠埃希菌 ClbS是一种colibactin抗性蛋白。 < em Microbiol 99（5）：897-908。
Martin，P.，Marcq，I.，Magistro，G.，Penary，M.，Garcie，C.，Payros，D.，Boury，M.，Olier，M.，Nougayrede，JP，Audebert，M.，Chalut ，C.，Schubert，S.和Oswald，E。（2013）。大肠杆菌中铁载体和colibactin基因毒素生物合成途径之间的相互作用
Nougayrède，JP，Homburg，S.，Taieb，F.，Boury，M.，Brzuszkiewicz，E.，Gottschalk，G.，Buchrieser，C.，Hacker，J.，Dobrindt，U。和Oswald，E。（2006年）。大肠杆菌诱导真核细胞中的DNA双链断裂。科学 313（5788）：848-851。
Taieb，F.，Petit，C.，Nougayrede，J.P。和Oswald，E。（2016）。肠道细菌基因毒素：细胞致密扩张毒素和colibactin EcoSal Plus 7（1）。
Tronnet，S.，Garcie，C.，Brachmann，A.O.，Piel，J.，Oswald，E.和Martin，P.（2017）。高铁供应抑制致病性大肠杆菌合成基因毒素colibactin 通过非规范的Fur / RyhB介导的途径。 Pathog Dis 75（5）。