材料和试剂

移液器吸头
注意：除非您在处理您选择的病毒时经常使用，否则过滤器提示不是必需的。
150毫米细胞培养皿（Greiner Bio One International，目录号：639160，或同等学历）
无菌聚丙烯50毫升锥形管（Corning，目录号：430921，或同等产品）
血清学移液管，5和10毫升（DWK生命科学公司，KIMBLE，目录号：56900-5110和56900-10110，或同等学历）
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34155，或同等学历）
棉签（Ted Pella，产品目录号：80907，或同等产品）
pH试纸（Hach，目录号：2601300）
EM网格Formvar / Carbon 300目（Ted Pella，目录号：01753-F）
BHK-21细胞（ATCC，目录号：CCL-10）
C6 / 36细胞（ATCC，目录号：CRL-1660）
1x无菌PBS（Corning，目录号：21-040-CM或同等产品）
考马斯蓝
Page Ruler Prestained Protein Ladder（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：22616）
MEM培养基（Corning，产品目录号：15-010-CV或同等产品）
100x L-谷氨酰胺（康宁公司，产品目录号：25-005-CV或同等产品）
100x MEM非必需氨基酸（Corning，目录号：25-025-Cl或同等产品）
100x抗生素 - 抗霉菌剂（康宁，目录号：30-004-Cl或同等产品）
FBS（Corning，产品目录号：35-010-CV或同等产品）
无菌病毒产生无血清培养基（VP-SFM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11681020或等同物）
HEPES（Fisher Scientific，产品目录号：BP310-1，或同等产品）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP358-10，或同等产品）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G，或同等产品）
盐酸（HCl）
乙酸铀酰（电子显微镜科学，目录号：22400，或同等学历）
MEM完整媒体（见食谱）
补充的VP-SFM（见食谱）
HES EPES-N aCl-E DTA（HNE）重悬缓冲液（参见食谱）
1％醋酸铀（见食谱）

设备

移液器
组织培养孵育器，温度和CO 2调节（赛默飞世尔科技，Thermo Scientific TM，型号：Forma 3130，或同等产品）
具有固定角度转子的冷冻台式离心机（Eppendorf，型号：5804 R，带有F34-6-38转子或同等产品）
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：1300系列Class II，Type A2，目录号：1323TS或同等产品）
可调倾斜摇杆（可靠的科学，型号：摇摆摇床）

程序

在15ml完全MEM中种植具有8-9×10 6 BHK或C6 / 36细胞的150mm培养皿。对于野生型α病毒纯化，在我们的实验室中常常使用2-3个150毫米培养皿。
在37℃，5％CO 2和C6 / 36细胞中于28℃，在5％CO 2 2中培养BHK细胞2-4天，直至细胞> 95％融合。
使用血清移液管移除介质。
以感染复数（MOI）=每个细胞5个噬菌斑形成单位感染具有α病毒原种的细胞。
补充VP-SFM使最终体积达到5毫升
在室温下摇动速度控制在25（在Reliable 55型摇床上）1小时，以便病毒有时间粘附并进入细胞。
一小时吸附时间对BHK和C6 / 36细胞都是足够的
移除含有病毒的媒体。
加入5-10 ml PBS（平衡至室温）并手动来回倾斜以清洗细胞。
吸取PBS。
重复PBS洗涤2次。我们的目标是尽可能多地去除MEM完整的培养基，以避免残留FBS与纯化的干扰。
在每个150毫米的平板上加入15毫升室温辅助VP-SFM
在适当的生长温度下孵育细胞。来自BHK感染细胞的培养基将在感染后18-22小时准备好收获。您应该观察到细胞病变效应和细胞四舍五入，但最小的细胞死亡（图1）。细胞病变效应开始后的长时间孵育会增加细胞死亡并降低病毒产量。 C6 / 36细胞中的感染孵育5天，但细胞病变效应不发展。感染后2.5天后，向细胞中加入5毫升补充的VP-SFM培养基以提供额外的营养。在第5天，收集媒体并继续下一步。

图1.在BHK单元中显示CPE。左侧的细胞（A）未感染且健康，而右侧的细胞（B）已经感染辛德比斯病毒20小时。请注意细胞四舍五入，但最小的细胞死亡。图像的放大倍数相同（4,000倍）。
将所有培养基收集在50毫升锥形管中，并通过在4,000×g <4：5的条件下离心5分钟进行澄清。这一步消除细胞碎片和死细胞。将上清液转移到新的50 ml锥形管中。
在这一步，样品可以保持在4°C。在我们的实验室中，我们不会将样品存储超过2天。
不要冻结样品，因为没有血清存在，并且有包膜的病毒颗粒会被损坏。
为了纯化病毒，在15℃下以5,300×g 离心16小时。在冷藏台式离心机中使用固定角度的转子。
不要停止离心，除非您准备好立即继续后续步骤。
停止离心机，当您从转子上取下管子时，将管子一侧的颗粒收集位置圈起来。颗粒最好是半透明的，通常在50ml圆锥形管的侧面和圆锥体相遇处形成（图2）。
这可以帮助标记管的壁以进行以下步骤

图2. LSC后离心管中沉淀病毒的位置。使用固定角度的转子时，沉淀的病毒在圆锥形管上壁显示为透明，透明的颗粒（蓝色圆点）。
仔细倾析上清液而不会干扰颗粒。
。将锥形管倒置在纸巾上，让剩余的介质排出。
使用Kimwipe和棉签，擦干圆锥管的侧面和底部，注意不要弄乱颗粒。
加入20-50μl的选择的缓冲液。 PBS适用于生化分析和冷冻电镜成像，但会干扰阴性染色透射电镜。 HNE缓冲液对于冷冻EM和阴性染色TEM成像都是有利的。挥发性缓冲液如醋酸铵（100 mM，pH 7.5）是质谱应用的理想选择。
将重新悬浮的病毒样品保存在4°C;不要冻结。请注意，随着时间的推移，颗粒可能从溶液中沉淀出我们已经存储了长达1年的病毒，并没有发现通过SDS-PAGE或TEM分析的降解。

数据分析

SDS-PAGE
颗粒纯度可以通过SDS-PAGE评估（图3）。为了获得最佳分离效果，我们运行标准条件下制备的10％凝胶。凝胶在200V电泳40-50分钟，可用考马斯蓝或其他常规染色剂染色。

图3.通过SDS-PAGE显示的LSC方案制备的病毒粒子的纯度。使用LSC方案纯化来自BHK感染的细胞的辛德毕斯病毒颗粒。如所述感染三个150mm细胞细胞。将LSC沉淀物重新悬浮于35μl中，并将2μl重悬浮的沉淀物加载到SDS-PAGE凝胶上。梯子是来自Invitrogen的PageRuler Prestained Protein Ladder。在凝胶上看到的条带对应于外部糖蛋白和内部衣壳蛋白，并相应地进行标记。请注意，只有病毒蛋白被观察到。
TEM
透射电子显微镜（TEM）评估颗粒形态（图4）。将悬浮的病毒样品（3-5μl）施加到碳涂层和formvar涂覆的铜网格上1分钟，然后通过将Kimwipe固定在格栅的侧面进行干燥。在吸墨时，将纸张垂直放置在网格边缘。较薄的纸（或Kimwipes）比较厚的材料更彻底地吸湿。在电网干燥之前（几秒钟内），加入5μl1％醋酸铀酰5分钟。通过将格栅侧面对Kimwipe进行印迹来除去乙酸双氧铀。用这种方法制备的样品可以通过任何电压TEM成像。

图4.纯化野生型和装配突变病毒。来自BHK感染和C6 / 36感染的细胞的辛德毕斯病毒体（野生型和装配突变体）使用两种方案纯化，然后通过TEM成像。最上面一行显示了病毒粒子纯化，使用三个连续的步骤：通过蔗糖垫片造粒，在蔗糖梯度上施加沉淀，以及使用离心过滤进行缓冲液交换和病毒带的浓缩。最下面一行显示了使用LSC方案进行的一步病毒体纯化的病毒样品。除了在网格上具有更多的粒子之外，LSC纯化的粒子显示了易碎的粒子，如粒子中间的凹痕所示（箭头）。在严酷的纯化方法中，这些颗粒很可能会降解或进一步受损。结果，组装突变体的多样性未在上图中示出。比例尺（右下图所示）为200 nm，适用于所有EM图像。

笔记

一般注意事项
1. 每种病毒都有不同的感染MOI和收获时间。此外，不同的细胞系也会影响病毒生产的最佳条件。使用感兴趣的病毒和宿主细胞进行生长曲线是建立纯化收获时间的良好起点。
2. 收获培养基后（步骤12），如果培养基收获细胞后出现微酸性（步骤12）（用橙色或用pH纸测量），加入无菌1M HEPES缓冲液（pH7.5）至终浓度为5％ 10 mM有助于维持pH值在7-7.5之间。
3. 当我们想要使用一种纯化的病毒制剂进行多次下游分析时，我们将较低体积的离心沉淀物（最多500μl）重新悬浮，然后取出部分样品进行进一步应用。
4. 在我们的实验室中，该方案已用于在BHK和C6 / 36细胞中繁殖的甲病毒。我们还没有尝试从其他细胞系中纯化病毒。

食谱

MEM完整媒体
500毫升MEM
5毫升100倍L-谷氨酰胺
5毫升100倍非必需氨基酸
5毫升100x抗生素 - 抗真菌剂
50毫升FBS
将所有组分加入500毫升MEM培养瓶中;最终的体积是565毫升

在4°C储存至6个月
补充VP-SFM
1 L VP-SFM
10毫升100倍L-谷氨酰胺
10毫升100倍非必需氨基酸
10毫升100x抗生素 - 抗真菌剂

在4°C储存至6个月将所有组分添加到1L VP-SFM瓶中;最终成交量为1,030毫升
EPES-N aCl-E DTA（HNE）再悬浮缓冲液（pH = 7.5）
20mMHEPES
150毫摩尔氯化钠 0.1毫摩尔DTA
用HCl调节pH值
在室温下储存
1％醋酸铀酰
通过将0.1g乙酸铀酰加入到1ml MilliQ水中来制备10％溶液（Vf = 1ml）。颠倒混合。解决方案将是黄色
要制备1％溶液（Vf = 1 ml），取100μl10％溶液并加入900μlMilliQ水。颠倒混合

在室温下避光存放注意：乙酸铀酰废物应根据机构政策处理。

致谢

该协议改编自以前的出版物Atasheva et al。，2013和Moller-Tank et。，2013。它已被用于Wang et al。，2015年和Ramsey 等人，2017年。我们承认Mukhopadhyay实验室的成员为我们的分析共享纯化的α病毒毒粒。这项工作的资金来自美国国家科学基金会和印第安纳大学研究副校长办公室。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Atasheva，S.，Kim，D.Y.，Akhrymuk，M.，Morgan，D.G.，Frolova，E.I和Frolov，I。（2013）。假感染委内瑞拉马脑炎病毒：α病毒减毒的新手段。 Virol 87（4）：2023-2035。
Moller-Tank，S.，Kondratowicz，A. S.，Davey，R. A.，Rennert，P.D。和Maury，W。（2013）。磷脂酰丝氨酸受体TIM-1在包膜病毒进入中的作用 J Virol 87（15）：8327-8341。
Ramsey，J.，Renzi，E.C.，Arnold，R.J.，Trinidad，J.C。和Mukhopadhyay，S。（2017）。辛德毕斯病毒TF蛋白的棕榈酰化调节其质膜定位和随后掺入病毒粒子。 J Virol 91（3）。
Wang J. C.，Chen，C.，Rayaprolu，V.，Mukhopadhyay，S.和Zlotnick A.（2015）。 α病毒核心样颗粒的自组装通过强烈的亚基间缔合能量和结构缺陷来区分。 ACS Nano 9（9）：8898-8906。