材料和试剂

24孔板（Corning，Costar ®，产品目录号：3524）
12孔板（Corning，目录号：3512）
10厘米板（Corning，目录号：353003）
移液器（康宁，目录号：4100）
15或50毫升锥形离心管（Corning，目录号：430052,430828）
人类骨髓来源的MSC（Lonza，目录号：PT-2501）
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（Lonza，目录号：CC-2517）
人肺微血管内皮细胞（HMVECs-L）（Lonza，目录号：CC-2527）
达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：41966052）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270106）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
EGM-2 MV SingleQuot套件补充＆amp;生长因子（Lonza，目录号：CC-4147）
EGM TM -2 MV BulletKit TM Medium（Lonza，目录号：CC-3202）
内皮基础培养基-2（EBM-2）（Lonza，目录号：CC-3156）
纤连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：F0556）
无菌磷酸缓冲盐水（PBS），pH7.2（赛默飞世尔科技公司，目录号：20012068）
Hank平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14025092）
玻连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：V8379）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
亲脂性荧光团1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）（Sigma-Aldrich，目录号：468495）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
小鼠抗人整合素β1抗体（Merck，目录号：MAB1987）
小鼠抗人整合素β1激活的抗体（Merck，目录号：MAB2079Z）
抗人整合素α5（Merck，目录号：MAB1956Z）
纯化的抗人CD51 / CD61（整联蛋白αVβ3）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，目录号：14-0519）
小鼠同种型IgG（Sigma-Aldrich，目录号：M6898）
肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（PeproTech，目录号：300-01A）
Medium 199（Sigma-Aldrich，目录号：M4530）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
Ficoll-paque Plus解决方案（GE Healthcare，目录号：17-1440-02）
具有膜联蛋白V Alexa Fluor TM 488＆amp;碘化丙锭（PI）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：V13241）
人类白细胞（见食谱）

设备

可溯源纳米计时器（Fisher Scientific，目录号：14-649-83）
离心机（Eppendorf，目录号：5810 R）
血球计（Hirschmann Instruments，目录号：8100103）
CO 2培养箱（Panasonic，型号：MCO-19AIC（UV））
荧光显微镜（Leica Microsystems，目录号：Leica DMI6000 B）

程序

细胞培养和单细胞悬液
1. hMSCs培养
  人骨髓来源的MSC（hMSC）购自Lonza。在由DMEM，10％FBS和1％青霉素和链霉素组成的生长培养基中培养hMSC 72小时。
2. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人肺微血管内皮细胞（HMVECs-L）
  1. 在内皮生长培养基（EGM）-2加2％FBS培养HUVEC并补充72小时。
  2. 在EGM TM-2 MV BulletKit TM培养基中培养HMVECs-L 72小时。
    注：EGM TM -2 MV BulletKit TM
阻断抗体浓度和细胞粘附分析的优化
1. 在室温下用10μg/ ml纤连蛋白（在无菌HBSS或PBS溶液中稀释）或0.4-1μg/ ml玻连蛋白（在无菌水中稀释）包被24孔板1小时。
2. 除去纤维连接蛋白或玻连蛋白缓冲液，不用清洗，在通风橱中风干1-2小时。
3. 用含3％BSA的PBS在37℃封闭平板1小时。
4. 用PBS缓缓冲洗平板，在通风橱中风干。
5. 在PBS单独涂层的孔中使用3％BSA作为阴性对照。
6. 用荧光标记物DiI（亲脂性荧光团1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）预先标记hMSC和新鲜分离的人外周血白细胞（Wu等人，2006）。
  1. 对于悬浮的细胞，用PBS洗涤并且在DMEM基础培养基（无血清）中以2μg/ ml的浓度与DiI在37℃孵育20-30分钟。然后与新鲜生长培养基（补充有10％FBS的DMEM）孵育30分钟。用PBS（400×g，5分钟）洗涤两次后，将细胞重新悬浮于新鲜生长培养基中。
  2. 对于粘附细胞，用PBS洗涤并在DMEM基础培养基（无血清）中与浓度为2μg/ ml的DiI在37℃孵育20-30分钟。然后用新鲜生长培养基替换培养基并孵育30分钟。用0.25％胰蛋白酶-EDTA将细胞胰蛋白酶消化2分钟，并将细胞悬浮于补充有10％FBS的DMEM中。
7. 用不同浓度的整联蛋白β1，整联蛋白α5或整联蛋白αVβ3阻断物预孵育悬浮的hMSC以确定对hMSC附着达到最大抑制的阻断抗体的最低浓度（Wang等人，2015）。
  1. 在含有2％FBS的DMEM中，在0,2,4,6,8,10和20μg/ ml的浓度下，在37℃下用抗整联蛋白β1阻断mAb孵育hMSC 30分钟。
  2. 在含有2％FBS的DMEM中，在0,2.5,5,10,20和40μg/ ml的浓度下，在37℃下用抗整联蛋白α5阻断mAb孵育hMSC 30分钟。
  3. 在0,2.5,5,10和20μg/ ml的浓度下，用抗整合素αVβ3阻断性mAb在37°C孵育hMSC 30分钟。
  4. 用同种型IgG抗体孵育hMSCs作为对照。
  5. 孵化后用PBS清洗一次。
8. 在用整联蛋白β1，整联蛋白α5或同种型对照IgG或每孔5×10 4个新鲜分离的人外周血白细胞阻断后，将hMSC的每孔5×10 4个种子接种纤连蛋白包被的平板。
9. 在用玻连蛋白包被的平板上的整联蛋白αVβ3或同种型对照IgG阻断后，每孔种植5×10 4个hMSCs。
10. 将细胞在37°C孵育30分钟，60分钟，90分钟和120分钟的DMEM加10％FBS。
11. 每30分钟收集一次非粘附细胞（用PBS洗一次）
12. 在400 g x g离心非贴壁细胞5分钟
13. 用血细胞计数器计数非贴壁细胞。
14. 通过荧光显微镜拍摄DiI标记的hMSC。
15. 必须对每个变量一式四份进行实验。
hMSCs附着于内皮细胞
1. 在分别具有内皮生长培养基（EGM）-2和EGM TM -2 MV BulletKit TM TM Medium的12孔板中培养HUVEC和HMVECs-L以汇合。合流密度约为80％-90％。在加入hMSC或白细胞之前立即用或不用10ng / ml TNF-α处理细胞24小时。能够激活内皮细胞的TNF-α治疗（Ko等人，2009）增加了hMSC和白细胞对内皮细胞的附着。
2. 从新鲜的人外周血分离白细胞（Boyum，1976; Chacko等人，2013）。
3. 准备hMSCs：从80％-90％汇合的10cm平板胰蛋白酶消化hMSC。
4. 用荧光DiI标记hMSCs和白细胞。
5. 在M199加0.1％BSA中以1×10 6的密度悬浮DiI标记的白细胞。
6. 在含有0.1％BSA的DMEM中以0.5×10 6的密度悬浮DiI标记的hMSC。
7. 找出适当的时间点来检测hMSCs与内皮细胞的附着。
  1. 将DiI标记的hMSC加入到12孔板中80％-90％汇合的单层HUVEC和HMVECs-L中，并在37℃和5％CO 2下孵育细胞。
  2. 每15分钟检测附着于内皮细胞的hMSC 60分钟
  3. 孵育30分钟通常足以使hMSCs对内皮细胞产生强烈的粘附。
8. 温育已经用4μg/ ml的整联蛋白β1，10μg/ ml的整联蛋白α5，5μg/ ml的整联蛋白αVβ3或10μg/ ml的对照IgG的封闭抗体在37℃处理30分钟的hMSC 30分钟。
9. 用PBS清洗样品一次
10. 用新鲜生长培养基重新悬浮样品并在37°C孵育30分钟。
11. 将细胞添加到12孔板中的80％-90％HUVECs或HMVECs-L单层细胞中。
12. 培养接种白细胞1小时的培养物，培养接种hMSCs 30分钟。
13. 用HBSS洗涤培养物两次以去除非贴壁细胞。
14. 用血细胞计数器计数非贴壁细胞。
15. 用1％PFA固定贴壁细胞。
16. 在荧光显微镜下（200x）获取贴壁细胞的图像，并对每个孔中的10个图像进行成像（图1）。
17. 计算每个字段的单元格数量。
  每个条件使用六个复制井
  
  图1. hMSC与HMVEC-L的粘附。：一种。将来自单层（2D）的DiI标记的单个hMSC与用于整联蛋白α5，整联蛋白β1或整联蛋白αVβ3的阻断抗体预温育，接种在HMVECs-L单层上并温育30分钟。使用与同种型IgG预孵育的hMSC和白细胞作为对照。比例尺= 250μm。 B.去除非贴壁细胞并计数，并贴壁的DiI-hMSC被拍照。对于每种条件使用六个重复孔，并且将该实验重复三次，* P < 0.05; ** P ＆lt; 0.01。缩写：MSC，间充质干细胞。

数据分析

贴壁细胞（％）=（贴壁细胞数量）/ [总细胞数量]×100％。
选择实现对hMSC附着最大抑制的最低浓度的阻断性抗体用于实验：4μg/ ml的整联蛋白β1，10μg/ ml的整联蛋白α5和5μg/ ml的整联蛋白αVβ3。

笔记

孵育30分钟是检测hMSC与内皮细胞粘附的最佳时间点。孵育时间越短，hMSCs的附着数量越少，但培养时间越长，hMSCs附着于内皮细胞的数量越少。
用针对整联蛋白β1，整联蛋白α5或整联蛋白αVβ3的阻断性抗体预温育显着降低了与内皮细胞连接的hMSC的数量（ P <0.05），其中整联蛋白β1阻断导致最明显的减少（减少约40％）。
使用死亡细胞凋亡试剂盒通过流式细胞术分析非贴壁细胞。在上述浓度下，整合素β1（而不是整合素α5）和整联蛋白αVβ3的阻断引起hMSC凋亡的适度增加（2-3％）（ p <0.05）。
我们的体外实验显示hMSCs中这些整联蛋白的功能性阻断显着减少了它们与内皮单层的附着，但是与白细胞相比，更多的hMSC与内皮细胞相连。这些结果表明，更多的粘附分子可能参与hMSC与内皮细胞的连接（Schenkel等人，2004; Wang等人，2015）。
我们检测了整合素α5β1的主要配体纤连蛋白和整合素αVβ3的主要配体玻连蛋白对培养的HMVECs-L和肺内正常内皮的作用。

食谱

人类白细胞
注：使用Ficoll-paque Plus溶液从全部外周血中分离白细胞。
1. 将新鲜血液放入15或50毫升锥形离心管中。
2. 使用无菌吸管加入等体积的室温PBS并充分混合
3. 将移液管的尖端放在含有血液/ PBS混合液的样品管底部，慢慢移取Ficoll-paque Plus溶液。
  每10 ml血液/ PBS混合液使用5 ml Ficoll-paque溶液
4. 在400×g，4℃下离心30分钟
5. 使用无菌吸管，去除含有血浆和大部分血小板的上层。
6. 使用另一支移液管将单核细胞层转移到另一个离心管
7. 通过加入过量的HBSS（约3倍体积的单核细胞层）来洗涤细胞，并在4℃以400×g（1,300rpm）离心5分钟。
8. 去除上清液，重新悬浮在HBSS中的细胞，并重复洗一次，以删除大部分血小板

致谢

该协议改编自以前发表的论文（Luu et al。，2013; Wang等人，2015; Wu等人，2006，2006 ）。这项工作得到了中国国家自然科学基金委（31371404,31571429），广东省自然科学基金（2015A030311041）和深圳市科学技术创新委员会（JCY20160301150838144）的资助。
披露潜在的利益冲突：作者表示没有潜在的利益冲突。

参考

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