材料和试剂

10μl移液器吸头（Fisher Scientific，Fisherbrand TM TM，目录号：02-707-438）
200μl移液器吸头（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，产品目录号：02-707-417）
1,000μl移液器吸头（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，产品目录号：02-707-403）
1.5ml微量离心管（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：05-408-129）
0.2ml PCR管（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：14-230-215）
100×15mm培养皿（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：FB0875712）
14毫升培养管（Corning，Falcon ，产品目录号：352057）
主要的DH5α大肠杆菌（New England Biolabs，目录号：C2987I）
解脂耶氏酵母属菌株Po1f（ATCC，目录号：MYA-2613）
pCRISPRyl（Addgene，目录号：70007）或Episomal Cas9质粒（见注）
Q5 HF聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0491L）
YeaStar TM基因组DNA试剂盒（Zymo Research，目录号：D2002）
DNA Clean＆amp;浓缩器TM（Zymo Research，目录号：D4004）
Gibson Assembly Master mix（新英格兰生物实验室，目录号：E2611L）
Zyppy TM质粒小量制备试剂盒（Zymo Research，目录号：D4037）
CutSmart缓冲液（新英格兰生物实验室，目录号：B7204S）
Avr II限制酶（New England Biolabs，目录号：R0174S）
Taq DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0273L）
酵母提取物（BD，Difco TM，目录号：212750）
蛋白胨（BD，Difco TM，产品目录号：211677）
葡萄糖（Fisher Scientific，Fisherbrand TM，目录号：D16-10）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7002-1KG）
不含氨基酸的酵母氮碱（BD，Difco TM，目录号：291940）
完全没有亮氨酸的补充混合物（CSM-leu）（Sunrise Science，目录号：1005-010）
完全补充混合物（CSM）（SunriseScience，目录号：1001-010）
油酸（MP Biomedicals，目录号：0215178125）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416-50ML）
LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3022-1KG）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A0166）
YPD媒体/琼脂（见食谱）
SD-leu媒体/琼脂（见食谱）
SD油酸琼脂（见食谱）
LB琼脂（见食谱）

设备

移液器（Gilson，型号：PIPETMAN TM可变容量，目录号：F167370）
台式微量离心机（Eppendorf，型号：5424，目录号：022620401）
PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：T100 TM，目录号：1861096）。
培养摇床（Infors，型号：Multitron标准）
培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heratherm TM TM IGS60，目录号：51028063）
凝胶电泳槽（Bio-Rad Laboratories，型号：Wide Mini-Sub，目录号：1704468）
凝胶电泳电源（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac TM Basic，目录号：1645050）
凝胶成像仪（Bio-Rad Laboratories，型号：Gel Doc TM TM XR +，目录号：1708195）

程序

促销员选择标准
我们的实验室先前开发了用于酵母菌Y的CRISPR-Cas9系统。（Kluyveromyces marxianus）（Schwartz等人，2016; Lobs等人，2017a）。在这些作品中，我们将CRISPR-Cas9活性与来自天然Pol III启动子，tRNAs和将天然Pol III启动子与tRNA组合的杂种Pol III启动子的sgRNA表达进行比较。在这两种生物体中，杂种Pol III启动子优于天然Pol III启动子和tRNA;然而，用于最佳杂交启动子的天然Pol III启动子在每种生物体中都不同。迄今为止，只有II类RNA Pol III启动子（tRNA样启动子）已在本协议中描述的杂合启动子中得到证实。可以尝试的II类启动子包括：SNR52，SNR6，RPR1和SCR1（Marck et al。，2006）。这些可以在生物体的注释基因组中被鉴定，或者通过使用密切相关的生物体作为输入的BLAST搜索来发现。在植物和哺乳动物系统中，Pol III U3和U6启动子已广泛用于sgRNA表达，因此可适用于杂合启动子方法（Cong等人，2013; Mali等人，，2013; Shan et。，2013）。

杂交启动子结构
杂合启动子系统将选择的Pol III启动子和tRNA序列结合起来，如图1所示。可以通过计算方法（Marck and Grosjean，2002）或从公共数据库（ http://gtrnadb.ucsc.edu/ ）。通常，这样的数据库提供了成熟的tRNA序列，其可以通过BLAST搜索或类似的局部比对工具用于鉴定基因组中的全长序列。在成熟序列被预测或不知道的情况下，可能需要实验验证。 tRNA的添加允许sgRNA成熟并从初级转录物中切除。另外，tRNA是自我包含的RNA Pol III启动子，其可以导致改善的sgRNA表达。由选择的RNA Pol III启动子和tRNA组成的杂合启动子位于具有polyT序列的sgRNA编码序列的上游用于终止。这形成了完整的杂合启动子构建体。

图1.合成的杂合启动子构建A.通过Gibson装配组装Pol III启动子，tRNA和含有Avr II的sgRNA的示意图。类似的彩色框表示重叠序列和Avr II网站。 B.将特定的20bp sgRNA靶序列克隆到消化的AvrII位点的示意图。

所需的Pol III启动子在与Q5 DNA聚合酶的PCR反应中从基因组DNA扩增。基因组DNA可以使用有机体特异性试剂盒（对于解脂耶氏酵母和马克斯克鲁维酵母我们已经使用YeaStar TM试剂盒）进行提取。引物应设计为与'A-box'上游约200-300bp和Pol III启动子的'B-box'下游约25bp结合。 'B盒'可以通过其推定的共有序列（来自酿酒酵母）'GWTCRAnnC'和通过其在'A盒'（共有序列'TRGYnnAnnnG'）下游的位置来识别（ Marck等人，2006）。图2A显示了从基因组DNA扩增的Pol III启动子的一个例子。用于PCR反应的引物含有〜20-30bp重叠序列，以通过Gibson Assembly将截短的Pol III连接到Cas9质粒骨架和tRNA序列。骨架同源序列应包含选定的限制性位点突出。示例引物如下所示。加下划线的序列对应于感兴趣的启动子序列，而非加下划线的序列是骨架和tRNA重叠。
正向引物：
CACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGT CCCCAGTTGCAAAAGTTGACAC
反向引物：
AAACCATCGGCGCATTAGAGGTATTTTTC AAAGTAGCCCAGTGCAGAGTCC

图2. Pol III启动子和tRNA设计A.从基因组DNA扩增的Pol III启动子的示意图。斜体大小是推荐值，但在生物体和启动子之间会有所不同。 B.从基因组DNA扩增的tRNA序列的示意图。与A相似，不同tRNA之间的斜体大小会有所不同。 A框上游侧和B框下游侧的序列对于RNA酶P和RNA酶Z的结合和tRNA的切除是必不可少的。
用Q5 DNA聚合酶从基因组DNA中类似地扩增tRNA序列。引物设计为A盒上游约20-30bp和B盒下游约20bp，以分别允许RNase P和RNase Z结合。保存这些侧翼序列确保切除成熟的tRNA。图2B显示了一个例子。正向引物含有与截短的启动子序列重叠。反向引物含有具有AvrII限制性位点的突出端，随后是sgRNA序列的重叠。 Avr II限制性消化位点允许容易地添加N sub 20 sgRNA靶向序列。下面显示了一组示例性引物。加下划线的序列含有tRNA序列，正向和反向引物上的非下划线序列分别对应截短的启动子和AvrII（下壳）-sgRNA重叠。
正向引物：
CGAGTTCTGGACTCTGCACTGGGCTACTT TGAAAAATACCTCTAATGCGCCG
反向引物：
AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAcctaggTC AACCTGCGCCGACCC
使用含有Avr II-tRNA和Cas9骨架重叠的引物从质粒pCRISPRyl（Addgene＃70007）扩增含有sgRNA序列的最终片段。加下划线的序列含有sgRNA序列，而未加下划线的序列含有AvrII（下套）-tRNA重叠，质粒骨架与限制性位点突出重叠。
正向引物：
CCGGTTCGATTCCGGGTCGGCGCAGGTTGAcctagg TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
反向引物：
GTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGT AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG

一旦Pol III，tRNA和sgRNA序列已经使用PCR清洁试剂盒如DNA Clean＆amp;如下所述，它们与骨架质粒在单一吉布森组装反应中以1:3的骨架与插入的比例结合。骨架质粒在Cas9序列的远端位点用限制性酶切割。在pCRISPRyl中，使用了 Aat II网站。

吉布森装配条件（10μl）

吉布森大师混音

5微升

骨干质粒

0.5 pmol

插入1：Pol III片段

1.5 pmol

插入2：tRNA片段

1.5 pmol

插入3：sgRNA片段

1.5 pmol

H 2 0直至

10微升
在50°C孵育1小时。

然后可以将产物直接转化到DH5α感受态细胞中进行复制，并使用Zyppy TM Plasmid Miniprep Kit进行提取。

sgRNA靶序列设计
可以将选定的sgRNA序列设计到用于克隆的引物中，按照以下格式。加下划线的片段是所需的N sub 20 sgRNA序列，小写序列与Avr II限制性位点同源，而该序列的其余部分与tRNA序列和sgRNA重叠。重叠使得sgRNA靶序列能够通过Gibson组合进入AvrII II消化的CRISPR质粒中，如图1所示。
正向引物：
GGGTCGGCGCAGGTTgacgt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
反向引物：
GCTATTTCTAGCTCTAAAAC NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN acgtcAACCTGCGCCGACCC

正向和反向引物使用以下方案在热循环仪中退火以获得线性片段。

退火条件（25微升）

CutSmart缓冲区

2.5微升

正向引物（10μM）

5微升

反向引物（10μM）

5微升

H 2 O

12.5微升

热循环仪方案（7分钟）

95°C＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp; ＆NBSP;

3分钟

90°C

30秒

85°C

30秒
继续以5°C的增量降低，直到最终温度达到60°C。

如下所述用Avr II消化的骨架质粒：

限制消化条件（50μl）

CutSmart缓冲区＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp ;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;	5微升
Avr II	1微升
骨干质粒	1微克
H 2 O	多达50μl＆nbsp;＆nbsp; 在37°C孵育至少1小时使用DNA清理试剂盒进行纯化。最后，将退火的片段与通过如上所述的Gibson组件消化的AvrII以1:3的骨架与插入物的比率结合的骨架组合。测量基因中断效率在这里，我们描述了一种使用PCR验证转化菌落中基因破坏的有效筛选方法。该方法可用于同时筛选数十个菌落。使用YeaStar Genomic DNA Kit从转化后的随机菌落中分离基因组DNA 设计将用于扩增的sgRNA靶序列上游和下游200个碱基对的引物。用Taq聚合酶通过PCR扩增区域侧翼目标位点并纯化。 Sanger对纯化的片段进行测序并与相应的野生型序列进行比对以鉴定任何indel或移码突变。或者，可以用易于选择的生长相关表型进行基因破坏的定量。在这里，我们使用解脂耶氏酵母作为一个例子。在 Y中。解脂基因PEX10阻止过氧化物酶体的生物合成并导致不能使用长链脂肪酸作为能源（Blazeck等人， 2014; Schwartz et al。，2017a）。这意味着具有这种表型的菌落不能在以油酸作为唯一碳源的基本培养基上生长。因此，含有靶向PEX10的sgRNA靶序列的CRISPR质粒可用于筛选遗传中断，允许同时筛选数百个菌落。 Y的野生型菌株。在设计的CRISPR质粒在固定相中转化解脂耶氏酵母PO1f（Schwartz等人，2016）。在液体SD-leu培养基或SD-leu琼脂平板上选择成功的转化体通过生长。 SD-leu培养基中的选择可确保所有测试菌落含有CRISPR质粒。生长可以在筛选之前表达CRISPR系统和基因中断。随机选择转化的菌落并在YPD和SD油酸琼脂平板上划线并在30℃温育。在YPD培养基但不是SD油酸平板上生长的菌落证明了PEX10的基因破坏，如图3所示。图3. PEX10中断体的表型在YPD和SD油酸培养基上筛选PEX10 的实例平板破坏了表型。 PO1f表示为对照，浅蓝色表示RPR1'-tRNA gly，橙色表示SNR52'-tRNA gly，SCR1'-tRNA gly >以深蓝色显示。根据Schwartz等人的许可修改2016年版权所有©美国化学学会2015年。数据分析确定序列对齐中断扩增的基因组序列与野生型的比对可以使用多序列比对程序来完成，例如MUSCLE（ https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ ）。这个特定的程序允许同时对齐多达500个序列。对齐跨越目标站点的至少50bp序列可以识别插入。 1，2，4和5 bp的indels（或任何不能被3整除的数字）表示移码突变和成功的基因中断。中断效率每个样品由30个随机选择的菌落组成，一式三份测量破坏效率。计算每个样品中破坏菌落的百分比，并确定并报告平均破坏效率和标准偏差。例如，在生长2天后，合成的杂合启动子SCR1'-tRNA ^ gly破坏了15 / 30,14 / 30和20/30个菌落，其破坏效率为54±11％（Schwartz等人，2016年）。笔记附加型Cas9主链质粒的选择和设计高度依赖于生物体。例如，我们实验室中使用的pCRISPRyl含有已经针对解脂耶罗维亚酵母Y进行密码子优化的Cas9序列。解脂亚种CEN序列和亮氨酸选择标记。该质粒还含有氨苄青霉素抗性盒和用于在E中繁殖的复制起点。大肠杆菌。感兴趣的生物体需要类似的载体。选定的tRNA的功效可以在生物体之间有所不同，因此可能需要在每种情况下测试多种不同的tRNA序列。选择标准包括天然丰度高和长度短。在解脂耶氏酵母中，根据Y中的密码子选择，基于其高天然丰度选择tRNA gly。解脂耶氏酵母基因组。我们特定的tRNA序列是最短的tRNA gly 。中的 PEX10 基因。解脂耶氏酵母允许容易筛选的表型。然而，尽管不是所有的生物体都可以与油酸一起作为唯一碳源生长，但其他生物体可能具有相似的生长相关基因，允许直接筛选方法。例如，酿酒酵母中的ADE2基因导致细胞在没有腺嘌呤的情况下显示为红色（Jones和Fink，1982），而破坏XYL2 中的基因。 marxianus 消除了它在木糖醇上生长的能力（Lobs et al。，2017a）。食谱 YPD媒体/琼脂 10克/升酵母提取物 20克/升蛋白胨 20克/升葡萄糖对于琼脂平板，加入20克/升琼脂注意：葡萄糖必须在高压灭菌并冷却至50°C后加入。 SD-leu媒体/琼脂不含氨基酸的酵母氮碱7克/升 0.69克/升CSM-leu 20克/升葡萄糖对于琼脂平板，加入20克/升琼脂注意：葡萄糖必须在高压灭菌并冷却至50°C后加入。 SD油酸琼脂不含氨基酸的酵母氮碱7克/升 0.69克/升CSM 20克/升琼脂 0.3％油酸 0.2％吐温20 注意：必须在高压灭菌并冷却至50℃后加入油酸和吐温20。 LB琼脂 20克/升LB肉汤 15克/升琼脂注意：对于选择性平板，在高压灭菌并冷却至50℃后加入50μg/ ml氨苄青霉素。致谢该协议改编自以前发表的作品（Schwartz等人，2016年），并得到NSF CBET-1403264和-1403099以及加州大学河滨校长研究奖学金的支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。参考 Barrangou，R。（2013）。 CRISPR-Cas系统和RNA引导干扰。 Wiley Interdiscip Rev RNA 4（3）：267-278。 Blazeck，J.，Hill，A.，Liu，L.，Knight，R.，Miller，J.，Pan，A.，Otoupal，P。和Alper，H.S。（2014）。利用解脂耶氏酵母脂肪生成为脂质和生物燃料生产创造平台。 Nat Commun 5：3131. 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