材料和试剂

有线环路或一次性接种环（SARSTEDT，目录号：86.1562.050）
15毫升试管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
比色杯（SARSTEDT，目录号：67.742）
150毫升Stericup过滤装置，0.22微米孔径（Merck，目录号：SCGPU01RE）
胶带
Parafilm（Sigma-Aldrich，目录号：P7793-1EA）
针（BD，目录号：302200）
注射器1毫升，10毫升（BD，产品目录号：303172,307736）
1.5毫升微管（Eppendorf，目录号：0030120086）
无菌透明平底96孔盖板（Corning，Falcon ®，产品目录号：353072）
无菌玻璃珠3毫米（Merck，产品目录号：1040150500）
培养皿（SARSTEDT，目录号：82.1473）
过滤器单元，0.22μm孔径（Merck，目录号：SLGS033SB）
一次性移液管吸头（VWR，产品目录号：613-1083,613-1079,613-1077）
细菌菌株：霍乱弧菌 N16961
Trigonopsis variabilis DAAO（Jose M. Guisan赠送，西班牙ICP-CSIC催化部门）（Komarova et al。，2012）
L-精氨酸（L-Arg）（Sigma-Aldrich，目录号：A5006-100G）
D-精氨酸（D-Arg）（Sigma-Aldrich，目录号：A2646-5G）
蒸馏水
MilliQ水
盐酸发烟37％（HCl）（Merck，目录号：1003171000）
胰蛋白胨（来自酪蛋白的蛋白胨）（VWR，目录号：84610.0500）
酵母提取物（VWR，目录号：84601.0500）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：71376-1KG）
氢氧化钠丸（NaOH）（Merck，目录号：1064821000）
蛋白胨，肉（动物组织的酶解）（VWR，目录号：84620.0500）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M2643-500G）
氯化钙（CaCl 2 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670-500G）
细菌琼脂（VWR，目录号：84609.0500）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：71507-250G） >
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：431478-250G） >
正磷酸85％（Merck，目录号：1005731000）
黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物（FAD）（Sigma-Aldrich，目录号：F6625-100MG）
- 苯二胺（OPD）（Sigma-Aldrich，目录号：P23938-5G）
甲醇（VWR，目录号：20847.307）
辣根过氧化物酶（Sigma-Aldrich，目录号：77332-100MG）
LB培养基（见食谱）
PYE培养基（见食谱）
琼脂平板（见食谱）
L-和D-氨基酸储备液（见食谱）
磷酸钠缓冲液500 mM pH 7.5（见食谱）
DAAO反应缓冲液（见食谱）

设备

层流柜
本生燃烧器
移液器（Gilson，产品目录号：F144563，F144565，F144566）
多道移液器（Gilson，目录号：F14403）
玻璃器皿：瓶子，量筒，烧杯
pH计（VWR，目录号：662-1422）
高压灭菌器（CertoClav，目录号：8510174）
孵化器（Memmert，目录号：IN55）
摇床培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：MaxQ TM 5000，目录号：SHKE5000）
带多孔板适配器的Thermomixer（Eppendorf，产品目录号：5355000011,5363000012）
分光光度计（GE Healthcare，目录号：29003605）
酶标仪（Biotek，型号：EON TM，目录号：EONC）

程序

细菌共培养
注意：所有步骤都需要在无菌条件下进行，通过火焰或层流柜内进行。
1. 将来自冷冻库的Streak霍乱弧菌细胞加入到LB琼脂平板上并在37℃倒置孵育16小时。诉霍乱 lacZ + 野生型和 V。 cholerae lacZ- bsrV 可用于评估BsrV在D-氨基酸生产中的作用。
2. Streak C。将新鲜的crescentus细胞从冷冻库储存到PYE琼脂平板上并在28℃下倒置孵育48小时。
  注：任何细菌组合（理想情况下，其中一个D-氨基酸生产者）可用于本协议，只要两者都能在兼容条件下生长即可。
3. 用无菌线圈从琼脂平板挑选每个菌株的单菌落，并在15ml试管中接种2ml液体PYE培养基。 28°C过夜培养液体细菌培养物（16-18小时），并以150转/分振荡。
  注意：温度和摇动可能因竞争测定中使用的细菌种类而异。
4. 确定培养物的OD 600：在900μl新鲜PYE培养基中稀释100μl过夜培养物，转移至比色杯中，并使用分光光度计读取600nm处的吸光度。使用装满1毫升新鲜PYE的比色杯作为空白。
5. 在10mlPYE培养基中稀释细菌悬浮液至起始浓度OD 600 = 0.01。取决于所使用的细菌菌株，OD 600到CFU ml -1比率将不同并且需要为每个菌株确定：例如，对于V 。霍乱弧菌野生型菌株，OD 600 = 0.01-10×10 7细胞ml -1。
6. Stericup过滤装置用作共培养室。用100毫升新鲜的PYE培养基填充我们称为隔室A的上部。用200毫升新鲜的PYE培养基填充我们称为隔室B的下部。紧紧地连接两个隔间。使用Parafilm和胶带牢牢密封隔室A的盖子，避免渗漏，并将共培养室水平放置。用热针，在每个隔间顶部打一个小孔，以便接种和收集样品;这个孔可以用胶带密封（图1A）。
  注意：确保共培养室水平放置，孔朝上，以尽量减少样品溢出。在这里，我们使用100ml培养基在隔室A和200ml培养基隔室B中，因为两部分的大小不同;理想情况下，两个隔间应具有相同的尺寸，形状和中等体积。
7. L-氨基酸补充：用10ml注射器和针头，分别向隔室A和B加入2.5ml和5ml L-精氨酸（200mM无菌原液）（最终L-氨基酸浓度分别为5mM隔间）。
  使用未补充的共培养室来评估不含L-或D-氨基酸的生长情况（图1B）。
8. 用1ml注射器和针头将细菌接种到共培养室中：将100μl霍乱弧菌（OD 600 = 0.01）接种到隔室A中;将500μl新月香（OD 600 = 0.01）接种到隔室B中。使用未接种的室作为在没有竞争细菌的情况下污染和生长的对照（图1B）。
  注：事先评估竞争细菌的生长速率，包括生长条件（中和温度）相容性。我们使用2.5倍C. crescentus接种物来补偿PYE培养基中霍乱弧菌和C. crescentus的非常不同的生长速率。使用霍乱弧菌lacZ +野生型作为D-氨基酸生产菌。霍乱弧菌lacZ-ΔbsrV用作D-氨基酸非生产者。霍乱弧菌lacZ +野生型和霍乱弧菌lacZ-ΔbsrV的1：1混合物用于证明生产者和非生产者之间的代谢协作能够胜过其他细菌。
9. 温和搅拌（100 rpm）在28°C温育共培养室。将用于接种的孔放在顶部以最小化样品溢出（图1C）。
  来自两个车厢的样品将在不同的时间点收集：0,24,48和72小时。
  
  图1.共培养室的制备。：一种。用适当的介质填充Stericup过滤装置的两个隔室。连接并密封两个部分并添加L-氨基酸至终浓度为5mM。最后用竞争细菌接种隔室。 B.完全竞争实验的培养基和细菌组合，包括对照（C）和测试样品（测试）。 Vc：V。霍乱。抄送： C。新月柄。 C.共培养室。
10. 在所需的时间点，使用1 ml注射器和针头从每个隔室和共培养室中收集500μl培养样品，并转移至以前标记的微管。
11. 活细胞计数立即执行（见程序B）。将200μl新鲜收集的样品从隔室A（霍乱弧菌 em>）和B C. crescentus 转移至无菌96孔板。
12. 在整个实验结束时进行D-氨基酸浓度的测定（参见程序C）。使用微型离心机在室温下将剩余的300μl样品在21,000×gg下离心5分钟。小心地将上清液（300μl）转移到新的微管中，并将样品储存在-20°C直到实验结束。确保没有细胞颗粒转移到新管中。
活细胞数
注意：所有步骤都需要在无菌条件下进行，通过火焰或层流柜内进行。
1. 确定 V的活细胞计数。霍乱和 C。 crescentus ，连续稀释细胞1:10。从先前的稀释液中转移20μl到一个新的孔中并加入180μl新鲜培养基（LB用于 V。cholerae ，PYE用于 C.crescentus ），混合物均匀。按照此程序，稀释培养物9次。确保在每个稀释步骤中更改提示。
2. 在琼脂平板上（每种稀释液100μl）（对于霍乱弧菌，对于新月体为PYE），用于CFU计数。首先，将6-10个无菌玻璃珠添加到每个平板上，然后小心吸取细菌培养物。然后，关上盖子并搅拌平板以使细胞培养物均匀分布并使其干燥。仔细倾斜平板，取下玻璃珠。玻璃珠可以在去污染，洗涤和消毒后重新使用。对于em-V，在37°C下将CFU计数板颠倒孵育16小时。霍乱弧菌和在28℃下48小时的 C。 crescentus 。
3. 一旦生长，在琼脂平板上计数菌落并基于所应用的稀释因子计算每毫升存活的CFU（图2）。
  
  图2.活细胞计数。：一种。 ℃。 crescentus 生长表示为CFU ml-1 。 B.使用与对照相比的相对增长的替代表示。 - ： C。 crescentus 控制，WT：竞争 C。 crescentus vs。诉霍乱 lacZ + 野生型，Δ bsrV ：竞争 C。 crescentus vs. V。霍乱 lacZ- Δ bsrV ，MIX：competition C。 crescentus 与1：1的V混合物。霍乱 lacZ + 野生型和 V。 cholerae lacZ - Δ bsrV 。
总D-氨基酸浓度的测定：DAAO分析
注意：不需要无菌条件。在这两步测定中，DAAO产生α-酮酸，NH 3和H 2，从D-氨基酸中分离出来的氨基酸;过氧化物酶减少H 2 0 2 释放自由与OPD反应，导致产生2,3-二氨基吩嗪，这是一种可用分光光度计检测的比色产物（图2）。 Alvarez等，2018; Espaillat等，2014）。
1. D-氨基酸标准曲线：在MilliQ水中以0.05,0.1,0.25,0.5,1,1.5和2mM浓度制备D-精氨酸稀释液。将20μl的每种稀释液转移至透明的平底96孔板中。转移20μLMilliQ水到另一口井作为空白。为了重复性，准备三重标准曲线和空白。
2. 上清液样品：将保存在-20℃的上清液样品完全融化（让它们在冰上放置20分钟）。使用MilliQ水在新的微管中制备1：2,1：5和1:10稀释液。将20μl各样品（未稀释，1：2,1：5和1:10）转移至透明平底96孔板。为了重复性，准备三重反应。
3. 准备DAAO反应缓冲液（见食谱），并使用多道移液器将60μl加入到每个孔中。最终反应体积为80μl。
4. 关闭96孔板盖以避免蒸发，并在37℃剧烈摇动（400rpm）下孵育1小时。积极的反应会变成黄色。
5. 使用多道移液器，向每个孔中加入2体积（160μl）的2N HCl以使反应失活。黄色将变成橙色。
6. 使用酶标仪在492 nm处读取吸光度。

数据分析

为了重现性，生物样本应该一式三份测试。
为了测试细胞活力，计算平板上生长的菌落数并基于所应用的稀释因子和培养物铺板体积（100μl）计算每ml的活CFU（图2）。
例如：用稀释度4（1:10 4 ）的平板中的153个新月须菌的菌落 /> （稀释因子）×10（体积校正）= 1.53×10 7 CFU ml -1
相对生长可通过将每个样品和条件的CFU ml -1除以不含L-氨基酸或竞争细菌的对照中的CFU ml -1 -1来计算。
为了确定D-氨基酸的总浓度：

标准曲线样品的吸光度应符合线性回归模型（图3A）。
适合度的好处由R 2值表示。
使用线性回归模型的公式计算每个样品和复制品的总D-氨基酸浓度。考虑稀释因素，如果适用。
丢弃吸光度值高于1.2单位的所有测量值：在该值以上，模型失去线性，并且D-氨基酸浓度的外推是错误的。
使用1：2，1：5或1:10稀释度的值。
总D-氨基酸浓度可以如图3B所示。如果需要，可以从样品值中减去PYE培养基中的基础D-氨基酸浓度。

图3.D-氨基酸浓度的测定A.代表性D-精氨酸标准曲线; B.共培养室48小时培养基中的总D-氨基酸浓度。 - ： C。 crescentus 控制，WT：竞争 C。 crescentus vs. V。霍乱 lacZ + 野生型，Δ bsrV ：竞争 crescentus 与 V。霍乱 l acZ - Δ bsrV ，MIX：competition C。 crescentus 与1：1的V混合物。霍乱弧菌lacZ + 野生型和 V。 cholerae lacZ- Δ bsrV 。

食谱

LB媒介
10.0克L-1胰蛋白胨
5.0克L -1酵母提取物
10.0克L -1 NaCl。
将组分溶于蒸馏水
使用2 N NaOH调节pH至7.0
调整最终体积并通过高压灭菌（在121°C和1个大气压下15分钟）
灭菌在室温下储存
PYE媒介
2克L-1蛋白胨
1.0克L -1酵母提取物
1毫升的L -1 MgSO 4 4水溶液 0.5毫升L -1 M CaCl 2 2/2 将组分溶于蒸馏水
调整最终体积并通过高压灭菌（在121°C和1个大气压下15分钟）
灭菌在室温下储存
琼脂平板
1. 为了制备琼脂平板，将培养基组分溶解在蒸馏水中，加入15g L -1细菌琼脂，然后根据需要调节pH，并且最终体积并且通过高压灭菌（121℃下15分钟灭菌C和1个大气压）
2. 让培养基冷却至50°C，并在无菌条件下倒入无菌培养皿（每个培养皿约20 ml）。让板在室温下固化。将盘子存放在4°C
L-和D-氨基酸储备液
将相应量的L-精氨酸或D-精氨酸溶解在MilliQ水中至终浓度为200mM
使用0.22微米孔径的过滤单元消毒
在室温下储存
磷酸钠缓冲液500mM pH 7.5
12.9克L -1 NaH 2 PO 4 4 H 2 O
109.1克L -1 Na 2 HPO 4·7H 2 O
将组分溶于蒸馏水
用正磷酸25％（v / v）或2N NaOH调节pH值至7.5，并调节最终体积
在室温下储存
DAAO反应缓冲液
每次反应，制备60μl含有磷酸钠缓冲液33.3mMpH7.5，FAD8.3μgml -1，新鲜制备的OPD83.3μgml -1的最终体积缓冲液（参见下表），辣根过氧化物酶41.7μgml -1和三角酵母DAAO（Komarova等人，2012）33.3μgml-1 1 。
除非另有说明，所有储备溶液均在MilliQ水中制备。
在-20°C分装并储存FAD，辣根过氧化物酶和DAAO储液

致谢

这项工作详细报道了以前用于证明霍乱弧菌使用D-精氨酸以使其他细菌失效的细菌竞争测定法（Alvarez et al。，2018）。这项工作由Knut和Alice Wallenberg基金会（KAW），瑞典分子感染医学实验室（MIMS），瑞典研究委员会和Kempe基金会资助。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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Espaillat，A.，Carrasco-Lopez，C.，Bernardo-Garcia，N.，Pietrosemoli，N.，Otero，LH，Alvarez，L.，de Pedro，MA，Pazos，F.，Davis，BM，Waldor，MK ，Hermoso，JA和Cava，F。（2014）。氨基酸消旋体新家族广泛特异性的结构基础。 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 70（Pt 1）：79-90。
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Komarova，N.V.，Golubev，I.V.，Khoronenkova，S.V.，Chubar，T.A。和Tishkov，V.I。（2012）。从酵母中制备D-氨基酸氧化酶的底物特异性三角酵变：定向诱变Phe258残基。生物化学（Mosc） 77（10）：1181-1189。
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