材料和试剂

微量离心管（Corning，Costar ，目录号：3621）
50ml锥形管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：339652）
橡树脊管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：3119-0050）
15ml锥形管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：339650）
（可选）Amicon超浓缩器（Merck，目录号：UFC901024）
透析管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：88242）
NAP-5色谱柱（GE Healthcare，产品目录号：17085301）
铝箔
384孔微孔板（Greiner Bio One International，目录号：784076）
（可选）96孔微孔板（Corning，目录号：3686）
0.2μm一次性瓶顶过滤器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：597-4520）
0.22μm注射器过滤器（Merck，产品目录号：SLGV033RS）
一次性比色皿（Fisher Scientific，目录号：14-955-127）
多道移液管吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：7421）
Rosetta2细菌细胞（Merck，EMD Millipore，目录号：71403） - 在-80°C储存
重组GTPase
注：理想情况下，浓度应为100μM或更高。关于重组GTP酶的表达和纯化，参见下面的方案。存放在-80°C。
网关克隆兼容pGEX6p载体
4×LDS样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：NP0008）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148） - 在4℃储存
GppNHp（Abcam，目录号：ab146659）
注意：用Milli-Q水溶解以制备50mM储备溶液。在-20°C储存。
Nu-PAGE凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：NP0321BOX）
考马斯亮蓝R-250（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：20278）
（可选）经典Laemmli十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液/ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶
谷胱甘肽琼脂糖4B培养基（GE Healthcare，产品目录号：17075605） - 在4°C储存
GST-PreScission（10毫克/毫升）
注：我们自己编写了GST标记的PreScission。 1μl我们的蛋白酶切割约1mg的测试蛋白质GST-ARL3。或者，您可以购买GE Healthcare的蛋白酶，产品目录号为27084301. -80°C储存。
Bradford试剂浓缩液（Bio-Rad Laboratories，产品目录号：5000006） - 在4°C储存
液氮
BSA标准，2 mg / ml（赛默飞世尔科技，产品目录号：23209） - 在4°C储存。
TritonX-100（Acros Organics，目录号：215682500）
Milli-Q水
蛋白酶抑制剂片剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：A32965） - 在4℃储存
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
MANT-GDP三乙基铵盐溶液（Sigma-Aldrich，目录号：69244） - 储存于-20℃避光保存
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
浓HCl（Aqua Solutions，目录号：H2505-500ML）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A490-212）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A412-4）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氢氧化钠（Fisher Scientific，目录号：BP359-500）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014-500G）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
二硫苏糖醇（DTT）（Promega，目录号：V3155）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher Scientific，目录号：S311）
LB肉汤（Fisher Scientific，目录号：BP9723）
LB琼脂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：22700）
棒极了肉汤（Fisher Scientific，目录号：BP24682）
羧苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C3416）
氨苄西林（Fisher Scientific，目录号：BP1760）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
IPTG（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：15529019） - 储存于-20℃。
LB媒体（请参阅食谱）
结核病媒体（见食谱）
100毫克/毫升氨苄青霉素（见食谱）
50毫克/毫升羧苄青霉素（见食谱）
34毫克/毫升氯霉素（见食谱）
含有50μg/ ml羧苄青霉素和34μg/ ml氯霉素的LB琼脂平板（参见食谱）
1 M IPTG（见食谱）
1M Tris-HCl（pH 7.5）（见食谱）
1 M HEPES-NaOH（pH 7.5）（见食谱）
5 M NaCl（见食谱）
1 M MgCl 2（见食谱）
1 M DTT（见食谱）
0.25 M EDTA（pH 8）（见食谱）
10 M NaOH（见食谱）
考马斯亮蓝染色液（见食谱）
考马斯亮蓝脱色液（见食谱）
裂解缓冲液（见食谱）
PreScission分裂缓冲液（见食谱）
存储缓冲区（请参阅食谱）
低镁缓冲液（见食谱）
2个MANT-GDP加载缓冲区（请参阅食谱）
核苷酸交换缓冲液（见食谱）
注：除非另有说明，否则材料在室温下储存。如果纯净的话，冷冻蛋白质和核苷酸可以保存至少一年。

设备

Milli-Q发生器（Merck，型号：Milli-Q Advantage A10，目录号：Z00Q0V0WW）
250ml培养瓶（Corning，PYREX®，目录号：4980-250）
2800ml培养瓶（Corning，PYREX®，目录号：4424-2XL）
培养箱振荡器（Eppendorf，New Brunswick TM，型号：Excella E25，目录号：M1353-0002）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5424 R）
500ml离心瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：3141-0500）
JA-10转子（Beckman Coulter，型号：JA-10，目录号：369687）
Avanti J-25I冷冻离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-25I，目录号：363106）
JA-17转子（Beckman Coulter，型号：JA-17，目录号：369691）
Allegra X-15R冷冻离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R，目录号：392932）
BioSpectrometer（Eppendorf，目录号：6136000010）
Thermomixer（Fisher Scientific，目录号：05-412-401）
注：此设备已停产。 Thermomixer C（Fisher Scientific，目录号：05-412-503;制造商：Eppendorf，目录号：5382000023）可作为替代品。任何类型的具有冷却功能的温度控制混合器都应该适用于本实验。
TECAN Infinite M1000微孔板读数器（TECAN，部件号：30034301）
注：有许多平板或基于比色皿的荧光计可以适应这一程序。其中包括FluoroMax-4（Horiba）（Price等，2012），Synergy H4 Hybrid Microplate reader（Bio Tek）（Ivanova等，2017）和Envision（Perkin-Elmer）（Maurer等，2012）
布兰森数字声波器（布兰森）
注：此设备已停产。 Branson Ultrasonics Sonifier SFX250 / SFX550（Fisher Scientific，目录号：15-345-141;制造商：EMERSON，Branson，目录号：101063969R）可作为替代品。
360°垂直旋转器（Grant Instruments，型号：PTR-30）
注：此设备已停产。格兰特生物360°垂直旋转器PTR-35（Grant Instruments，型号：PTR-35）可作为替代品。
实验室支架（Humboldt，目录号：H-21207）
涡旋混合器（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
多道电子移液管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：2069MTRX）
注：此设备已停产。更新的型号（赛默飞世尔科技Thermo Scientific TM TM，产品目录号：4671020BT）可作为替代产品。
高压灭菌器

软件

Microsoft Excel（微软）
GraphPad Prism 7软件（GraphPad软件）

程序

来自大肠杆菌的重组GTP酶的表达和纯化
重组GTP酶可以从大肠杆菌产生和纯化，因为核苷酸交换测定通常不需要GTP酶的翻译后修饰。需要确定每种GTP酶的实验条件，例如诱导蛋白质表达的温度和培养时间以及异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）浓度，以获得可溶性重组蛋白的最大产量。可以对条件进行小规模优化（我们通常使用2毫升LB培养基进行试验性实验）。我们通常在18℃下用0.1mM IPTG诱导蛋白质表达过夜。 1L培养物的典型产量是10mg蛋白质。
1. 用含有感兴趣基因的载体转化Rosetta2细菌细胞。将细胞铺在含有50μg/ ml羧苄青霉素（或100μg/ ml氨苄青霉素）和34μg/ ml氯霉素的LB琼脂平板上。
  在37°C孵育过夜。
  注意：我们通常使用Gateway-cloning兼容的pGEX6p载体（Wright et al。，2011），其产生具有GST和目的蛋白之间的PreScission蛋白酶识别位点的N-末端谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记蛋白。含有CDC42（一种GEF依赖性GTP酶）和IIGP1和CrRabl2（不依赖GEF的GTP酶）的载体作为实验的阳性对照，由作者根据要求提供。氯霉素被添加到琼脂平板中，因为稀有密码子的tRNA被Rossetta2细菌细胞中的氯霉素抗性质粒维持。根据使用的细菌细胞，可能需要使用其他抗生素。
2. 用250ml烧瓶中的单个菌落的转化细胞接种50ml含有100μg/ ml氨苄青霉素和34μg/ ml氯霉素的LB培养基。
  在37℃以250转/分钟培养起始培养基
3. 在启动大规模培养之前，在2,800ml烧瓶中预热1升无抗生素的高压灭菌TB培养基，37℃培养箱振荡器中过夜。
4. 用25ml发酵剂培养物接种1L预热的TB培养基。在37℃以250rpm摇动烧瓶直至OD 600达到0.6-0.7。大约需要2小时。
5. 当OD <600>达到0.6-0.7时，将烧瓶置于冰上并冷冻培养15分钟。
6. 加入100μl1 M IPTG（终浓度为0.1 mM）以诱导蛋白质表达
7. 在培养箱振荡器中以180转/分的速度摇动培养瓶
8. 。收集细菌细胞之前，将烧瓶置于冰上
9. 为了确认蛋白质的表达水平和溶解度，将1ml细菌悬浮液转移到微量离心管中。使用冷冻离心机以8,000rpm（6,010×g克）在4℃离心1分钟收集细胞沉淀。将细胞沉淀重新悬浮于300μl预冷的裂解缓冲液中，并通过在冰上超声处理1分钟（以30％振幅进行0.6秒/ 0.4秒开/关循环）裂解细胞，接着以15,000rpm（21,130 xg ）在4℃下10分钟。将上清液转移到微量离心管中，加入100μl4×LDS样品缓冲液和10μl2-巯基乙醇以制备可溶性级分。为了制备不溶级分，将290μl裂解缓冲液，100μl4×LDS样品缓冲液和10μl2-巯基乙醇加入到沉淀中。将样品在70°C孵育10分钟，然后在200 V的Nu-PAGE凝胶上运行，直到染料前端到达凝胶底部。在室温下，在温和搅拌下将凝胶在考马斯亮蓝染色溶液中染色1小时，随后在考马斯亮兰染色脱水溶液中在室温下轻微脱色并温和搅拌。您感兴趣的蛋白质应该出现在可溶性部分。
  注意：可以使用经典的Laemmli十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液/ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）代替4×LDS样品缓冲液/ Nu-PAGE系统。
10. 通过使用Avanti J-25I冷冻离心机在4℃下在JA-10转子中以6,000rpm（6,371gxg）在四个500ml离心瓶中离心10分钟来收获细菌。
  注意：每个试管中最多放置300ml，以防止离心过程中溢出。
11. 弃去上清液并在-20°C冷冻细胞团块，直到您确认蛋白质在步骤A9中的表达和溶解度。
  注意：细菌沉淀可以在-20°C储存至少一周。或者，您可以将细菌沉淀物保存在冰上以确认表达/溶解度，然后立即进行下一步操作。
12. 将1L细胞沉淀重新悬浮在30ml预冷的裂解缓冲液中，并将悬浮液转移到50ml锥形管中。
13. 在冰上超声处理细胞，直到悬浮液变成水样（大约2分钟;在80％幅度下0.6秒/ 0.4秒开/关循环）。
14. 将溶胞产物转移到橡木脊管中，并通过使用Avanti J-25I冷冻离心机在JA-17转子中在4℃以15,000rpm（30,996×gg）离心30分钟来澄清裂解物。
15. 在离心过程中，将2ml床体积的谷胱甘肽琼脂糖4B培养基在50ml锥形管中的20ml冰冷的裂解缓冲液中洗涤两次。为了洗涤珠子，使用Allegra X-15R冷冻离心机在4℃以1,466rpm（500×g）离心5分钟使珠粒沉淀并吸出上清液。加入20ml的裂解缓冲液并颠倒管混合。以下步骤中的所有洗涤都将以相同的方式完成。
  注意：1毫升床体积的珠粒约束5毫克GST。
16. 将澄清的裂解液加入洗过的谷胱甘肽琼脂糖珠中，并在4°C的360°垂直旋转器上旋转50ml锥形管2小时。
17. 用40ml（20树脂体积）不含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液洗珠3次。
18. 用40毫升（20树脂体积）的PreScission裂解缓冲液洗两次珠。
19. 加入4 ml（2树脂体积）的PreScission裂解缓冲液，并将它们转移到15 ml锥形管中。
20. 加入10μl10 mg / ml GST-PreScission洗脱蛋白质。
  在4°C的360°垂直旋转器上旋转15 ml锥形管16小时。
  注意：加入10μl10mg / ml GST-PreScission，因为我们预计最终产量10mg和1μl我们的GST-PreScission切割1mg GST标记的蛋白质。应该添加的GST-PreScission的量取决于蛋白质的表达水平和/或需要多少蛋白质。根据步骤A9中获取的测试样品中的蛋白质量，可以估计裂解物中包含的蛋白质的量。
21. 通过使用Allegra X-15R冷冻离心机在4℃以1,466rpm（500×g）离心5分钟使珠粒团粒化并将上清液收集到15ml锥形管中。
22. 用2ml（一种树脂体积）的PreScission切割缓冲液洗涤珠粒，并在4℃以1,466rpm（500×g）离心5分钟后收集上清液。重复洗一次，并结合之前的上清液。
23. 使用Bradford检测法测量蛋白质浓度（详见步骤B8）。
  注意：如果浓度小于100μM，使用Amicon超浓缩器（Merck，目录号：UFC901024）浓缩洗脱的蛋白质。
24. 通过Nu-PAGE和考马斯亮蓝染色检查蛋白质的质量。
  注意：可以使用经典的Laemmli SDS样品缓冲液/ SDS-PAGE代替4x LDS样品缓冲液/ Nu-PAGE系统。
25. 使用透析管在至少100倍蛋白体积的储存缓冲液中透析4°C过夜
26. 准备200微升纯化蛋白质的等分试样（浓度应为100μM或更高），并在液氮中快速冻结等分试样。存放在-80°C。
缓冲液交换到低镁缓冲液
在5mM EDTA存在下，在含有0.5mM MgCl 2的缓冲液中进行GTP酶载荷MANT-GDP。由于我们的储存缓冲液含有5mM MgCl 2（参见食谱）以确保GTPase的稳定性，我们首先使用凝胶过滤柱将缓冲液换成低镁缓冲液（参见食谱）。
1. 解冻200μl纯化的GTPase（100μM或更高）注意：100μM的GTP酶通常是一个很好的起点。
2. 将NAP-5柱夹在实验室支架上。
3. 移除NAP-5色谱柱的顶部和底部盖子，让多余的制造商储存缓冲液流过。
4. 用三次完全填充色谱柱，用低镁缓冲液平衡NAP-5凝胶过滤柱。
  。用于平衡的缓冲液总量大约为10毫升。
5. 将200μl纯化的GTPase加到平衡的NAP-5柱的中心，让样品通过重力流动完全进入凝胶床。
6. 将500μl低镁缓冲液加到柱子上，收集微量离心管中的流量。
  注意：该部分不应含有任何蛋白质。
7. 用1毫升低镁缓冲液洗脱蛋白质。
  在微量离心管中收集100μl洗脱液注意：大部分蛋白质应该在前4个部分洗脱。
8. 通过Bradford分析测量每个部分的浓度，包括流量。
  1. 简言之，用4份Milli-Q水稀释Bradford试剂浓缩物的一部分，并将1ml稀释的Bradford试剂加入到一次性比色杯中。加入10μlMilli-Q水或BSA标准品（0.1,0.2,0.4和0.8 mg / ml）或1-2μl缓冲液交换GTP酶到每个比色杯中。通过涡旋混合比色杯并在室温下孵育5分钟。测量BioSpectrometer上每个部分的浓度。
  2. 从测量的浓度计算摩尔浓度。使用含有最高浓度蛋白质的部分进一步实验。缓冲液交换后的蛋白质浓度通常是起始浓度的一半。
  注意：Bio-Rad的详细使用说明可以在网上找到。有不同的方法可用于测量蛋白质浓度，包括Bradford测定法，bicinchoninic酸（BCA）测定法和分光光度法。我们更喜欢Bradford测定法，因为它是一种快速简便的方法，此协议中使用的所有缓冲液组分都可与Bradford试剂（Bio-Rad的试剂兼容性图表可在线查找）兼容。 BCA分析可能受到核苷酸交换缓冲液中所含还原剂的影响。我们不推荐使用分光光度法，因为GTP酶通常用鸟嘌呤核苷酸纯化，鸟嘌呤核苷酸在用于测量的波长处吸收。我们通常在峰值分数中获得起始浓度的一半以上。
在GTPase上加载MANT-GDP
1. 在微量离心管中将100μl缓冲液交换的GTPase与100μl2x MANT-GDP上样缓冲液混合（见配方）。最终的反应物含有20mM HEPES-NaOH（pH7.5），50mM NaCl，0.5mM MgCl 2，5mM EDTA，1mM二硫苏糖醇（DTT），GTP酶和20倍摩尔过量的MANT-GDP。
  注：MANT-GDP的浓度取决于蛋白质浓度，必须在每次实验中计算。
2. 在温度不超过20分钟的条件下，将反应液置于恒温混匀器中90分钟。用铝箔保护光线下的反应。
3. 通过加入2μl1M MgCl 2（终浓度为10mM）终止反应。
  混匀反应管倒置，然后离心，然后在20°C孵育管30分钟。
4. 在孵育过程中，用三次完整的核苷酸交换缓冲液补充平衡NAP-5凝胶过滤柱（见配方）。
  。用于平衡的缓冲液总量大约为10毫升。
5. 为了去除未结合的MANT-GDP，将整个体积（200μl）MANT-GDP加载的GTP酶加到NAP-5色谱柱上。
  允许样品通过重力流动完全进入凝胶床。
6. 应用500μl核苷酸交换缓冲液并收集流过。
  注意：该部分不应含有任何蛋白质。
7. 应用1毫升核苷酸交换缓冲液洗脱蛋白质。在微量离心管中一次收集100μl。将MANT-GDP加载的GTP酶保存在冰上，避光（通过铝箔）。
  注意：大部分蛋白质应该在前4个部分洗脱。
8. 如上所述，通过Bradford检测来测量每个部分的浓度。
测量荧光计上的加载效率
1. 通过在核苷酸交换缓冲液中将自由MANT-GDP从40μM到0.15625μM的两倍连续稀释制备MANT-GDP标准。
  注：TECAN Infinite M1000微孔板读板器上可检测到的最低自由MANT-GDP浓度约为0.1μM。
2. 吸取15μl核苷酸交换缓冲液，免费的MANT-GDP标准或MANT-GDP加载的GTP酶到384孔微量培养板中。
  注：此测量也适用于96孔格式。如果您使用96孔板，请将50μl每个样品吸入96孔微孔板（Corning）中。
3. 在室温（25°C）下，每15秒读取一次荧光信号，共10次。列出了用于检测的参数（表1）。
  
  表1.用于检测MANT荧光的参数
4. 为了计算加载效率，对来自所有10个时间点的每个样品的荧光强度进行平均，然后通过减去仅对缓冲液对照测量的背景荧光值来计算标准化平均值。
5. 绘制免费的MANT-GDP浓度与测量的荧光的关系，并使用Microsoft Excel将标准曲线拟合成线性函数。使用标准曲线从其测量的荧光中确定MANT-GDP加载的GTP酶的浓度;由于MANT-GDP信号在与蛋白质结合后通常增加约两倍，因此首先将荧光信号除以二，然后使用标准曲线函数估计负载的GTP酶的浓度。这个数据的一个代表性例子（表2）和从数据中创建的免费MANT-GDP的标准曲线（图1）被显示出来。
注意：这里计算的加载效率可能不准确，因为与GTPase结合后MANT-GDP的信号强度的增加在GTP酶之间不同。装载效率的例子可以在原稿中找到。（Kanie等人，2017中的图S4E）。

表2.以GTPase加载MANT-GDP获得的数据示例

图1.使用表2中显示的数据创建的免费MANT-GDP的标准曲线
核苷酸交换测定
1. 加入14μl核苷酸交换缓冲液或装载MANT-GDP的GTP酶至适当数量（条件数×4个技术重复）384孔微孔板的孔中。
  注意：添加到孔中的蛋白质浓度取决于上面计算的加载效率，因为样品的起始荧光强度应足够高以检测荧光的动态变化。如果加载效率很高（超过50％），则可以使用1μM或更少的GTP酶。如果装载效率低（小于10％），则应添加最高浓度的GTPase。
2. 在测量荧光之前，用核苷酸交换缓冲液制备GppNHp的工作溶液，其浓度比GTP酶高15倍。如果您使用1μMGTP酶，请准备1.5 mM GppNHp。
3. 在室温（25°C）下读取荧光150秒，确认荧光信号稳定。
  注意：在步骤D3中使用的相同检测参数（参见表1）可用于核苷酸交换测定。
4. 按下显示器上的“Pause”按钮弹出平板，然后向各孔中加入1μl核苷酸交换缓冲液或GppNHp工作溶液（终浓度比GTPase高100倍）。如果要测量GEF介导的核苷酸交换，除了GppNHp之外，还要添加纯化的GEF。
  注意：应使用多通道移液管同时添加缓冲液或GppNHp以同时开始所有反应。为了确保缓冲液或GppNHp的快速添加，我们在排出分析板之前用另一个384孔板中的1μl缓冲液/ GppNHp溶液预先填充多通道移液管，然后在射出后立即将试剂吸入分析板中碟子。为避免产生任何气泡，我们将填充体积设定为1.5μl，分配体积设定为1μl。
5. 按下“继续”按钮插入板，并在室温（25°C）下每隔15秒继续读荧光至少30分钟。＆nbsp;

数据分析

将荧光计数据导出到Microsoft Excel电子表格。
每个荧光强度减去核苷酸交换缓冲液的背景强度。
在添加缓冲液或GppNHp至1之后的第一时间点设置荧光强度，并计算每个后续时间点的相对荧光。
由于反应含有比GTPase大100倍或更多的GppNHp，因此可以从数据中计算出一级假定速率常数（观察到的速率常数或K obs）。
由于MANT结合GTP酶的荧光随着时间呈指数下降，所以能够用非线性回归拟合数据的软件程序可用于计算K obs。这些程序包括但不限于GraphPad Prism，KaleidaGraph和Grafit。我们在这里描述如何使用GraphPad Prism 7作为例子进行分析。
1. 打开GraphPad Prism 7并创建一个新的XY表格。
2. 在每列中输入数值，单击“分析”按钮并从XY分析列表中选择“非线性回归”。
3. 选择'Dissociation-One phase exponential decay'来获得K obs 值。
注意：数据应至少通过三次独立实验进行确认。

笔记

在我们的手中，具有低鸟嘌呤核苷酸亲和力的GTP酶的加载效率远低于对鸟嘌呤核苷酸具有高亲和力的典型小GTP酶的加载效率。推测这反映了低亲和力GTP酶的更高的动力学。在前一种情况下，荧光信号很大程度上受到蛋白质稀释的影响，可能是因为稀释本身会改变平衡。

食谱

LB媒体（1升）
将25克LB肉汤溶解在900毫升Milli-Q水中
用10 M NaOH将pH调节至7.2，并用Milli-Q水将体积调至1 L

高压灭菌器灭菌并在室温下储存
TB媒体（1升）
将50.8克极好的肉汤溶于900毫升Milli-Q水中，用Milli-Q水将体积调至1升
转移到一个2.8L烧瓶中，并在培养箱振荡器中于28℃以250rpm旋转烧瓶，直到粉末完全溶解。
注：可能需要不到30分钟
通过高压灭菌器消毒
100毫克/毫升氨苄青霉素（10毫升）将1克氨苄青霉素溶于8毫升Milli-Q水中，用Milli-Q水定容至10毫升。
用0.22μm注射器过滤器消毒
分装成1毫升等分试样，并储存在-20°C。
50毫克/毫升羧苄青霉素（10毫升）将500毫克羧苄青霉素溶于8毫升Milli-Q水中，用Milli-Q水定容至10毫升。
用0.22μm注射器过滤器消毒
分装成1毫升等分试样。
在-20°C储存
34毫克/毫升氯霉素（10毫升）将340毫克氯霉素溶于8毫升100％乙醇中，并用100％乙醇将体积加至10毫升。
用0.22μm注射器过滤器消毒
分装成1毫升等分试样。
在-20°C储存
含有50μg/ ml羧苄青霉素和34μg/ ml氯霉素的LB琼脂平板
将32克LB琼脂溶解于900毫升Milli-Q水中，并将Milli-Q水定容至1升。

高压灭菌器消毒并冷却至50°C 加入1毫升50毫克/毫升羧苄青霉素和1毫升34毫克/毫升氯霉素
倒入盘子并在4°C储存
1个IPTG（10毫升）
将2.383克IPTG溶解在8毫升Milli-Q水中，并将Milli-Q水定容到10毫升。
用0.22μm注射器过滤器消毒
分装成1毫升等分试样。
在-20°C储存
1M Tris-HCl（pH 7.5,1L）

溶解800毫升Milli-Q水中的Trizma碱用浓盐酸调节pH至7.5，用Milli-Q水将体积调至1升
高压灭菌器或过滤器来消毒
1M HEPES-NaOH（pH 7.5,1L）

将238.30克HEPES碱溶于800毫升Milli-Q水中用10 M NaOH调节pH至7.5，用Milli-Q水将体积调至1 L
过滤通过一个0.2微米的一次性瓶顶过滤器消毒
在4°C储存
5 M NaCl（1 L）
将292.2克NaCl溶于700毫升Milli-Q水中，并用Milli-Q水将体积加至1升。

高压灭菌器灭菌并在室温下储存
1 M MgCl 2（100毫升）
将20.33克MgCl 2·6H 2 O溶于70毫升Milli-Q水中，用Milli-Q水定容到100毫升。

高压灭菌器灭菌并在室温下储存
1 M DTT（30毫升）
将4.63克DTT溶于20毫升Milli-Q中，用Milli-Q水将体积加至30毫升。
分装成1毫升等分试样。
在-20°C储存
0.25M EDTA（pH 8.0,1L）

在800毫升Milli-Q水中溶解93.06克EDTA·2H2O 用NaOH调节pH至8.0
注意：除非pH值大于8，否则EDTA不会溶解。
用Milli-Q水将体积调至1升

高压灭菌器灭菌并在室温下储存
10 M NaOH（500毫升）

在不断搅拌下，将200克氢氧化钠缓慢加入400毫升Milli-Q水中用Milli-Q水将容量调至500毫升
考马斯亮蓝染色液（1 L）
在500毫升甲醇中溶解2.5克考马斯亮蓝R-250

加400ml Milli-Q水和100ml冰醋酸
过滤0.2μm一次性瓶顶过滤器
考马斯亮蓝去污溶液（1 L）
将500ml Milli-Q H 2 O和400ml甲醇加入到1L瓶中。

缓慢加入100 ml冰醋酸
裂解缓冲液（500毫升）

立即在使用前将一片蛋白酶抑制剂加入到50ml裂解缓冲液中

每次都要新鲜
PreScission分裂缓冲液

每次都要新鲜
储存缓冲液（500毫升）

每次都要新鲜
低镁缓冲液（200毫升）

在室温下储存
2个MANT-GDP上样缓冲液（100μl）

每次都要新鲜。 MANT-GDP的浓度应该根据GTPase浓度计算
核苷酸交换缓冲液（100毫升）

每次都要新鲜

致谢

该协议是从以前的工作改编的（Kanie et。，2017）。作者要感谢Keene Abbott和Henrietta Bennett仔细阅读手稿。这项工作得到了巴克斯特干细胞研究实验室，斯坦福大学研究部，斯坦福癌症中心，美国国立卫生研究院拨款给PKJ的R01GM114276和R01GM121565以及上原纪念基金会和人类前沿科学计划给TK的博士后支持。作者宣称没有利益冲突。

参考

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