材料和试剂

100mm，60mm培养皿（Kord-Valmark Labware Products，目录号：2900,2901）
15-ml离心管（Globe Scientific，目录号：6285）
22 x 22毫米盖玻片（Globe Scientific，目录号：1404-10）
玻璃巴斯德吸液管（Krackeler Scientific，目录号：6-72050-900）
真空过滤（GE Healthcare，Whatman，目录号：6722-5001）
1.5 ml微量离心管（CELLTREAT Scientific，目录号：229443）
50毫升锥形管（Corning，目录号：430829）
15 ml锥形管（Corning，目录号：430791）
℃。线虫菌株和明尼苏达大学遗传学中心（CGC）的OP50（）。
去离子水（dH 2 O）
BCA蛋白质测定法（Pierce，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：23227）
氯甲基-2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H 2 DCFDA）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C6827）
Polybead Polystyrene 0.10μmmicrospheres（Polysciences，目录号：00876-15）
琼脂糖（RPI，目录号：A20090-500.0）
清除指甲油（通用）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP358-10）
琼脂（Fisher Scientific，目录号：BP1423-2）
细菌蛋白胨（BD，Bacto TM，产品目录号：211677）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：C79-500）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：BP213-1）
磷酸二氢钾（KH 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：BP363-1）
胆固醇（Fisher Scientific，目录号：C314-500）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P285-500）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：BP366-1）
5-氟-2'-脱氧尿苷（FUDR）（bioWORLD，目录号：40690016-1）
细菌用胰蛋白胨（BD，BactoTM，目录号：211705）
细菌酵母提取物（BD，Bacto TM，目录号：212750）
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：BP359-500）
磷酸二氢钠无水（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：BP332-1）
漂白（普通，普通）
氯化氢（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A144-500）
标准线虫生长培养基（NGM）培养板（见食谱）
无菌解决方案（请参阅食谱）
5-Fluoro-2'-deoxyuridine containing NGM plates（see Recipes）
NGM的无菌库存（见食谱）
1. 1 M CaCl 2 2
2. 1M MgSO 4
3. 1 M K 2 HPO 4
4. 1 M KH 2 PO 4 4
5. 1 M KPO <4>
LB培养基（见食谱）
M9缓冲液（见食谱）
漂白剂解决方案（请参阅食谱）
10 N NaOH（见食谱）
10倍PBS（见食谱）

设备

单通道移液器（Rainin，型号：PR-10，PR-20，PR-200，PR-1000）
Finnpipette II多道移液器（Fisher Scientific，型号：Fisherbrand TM TM Finnpipette TM II，目录号：21377830）
带微尖探针的Fisher Scientific Sonic Dismembrator（Fisher Scientific，型号：Sonic Dismembrator Model 100）
Thermo Electron Corporation IEC Centra CL2离心机（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM，型号：IEC Centra CL2）
Eppendorf 5415D离心机（Eppendorf，型号：5415 D）
城堡蒸汽灭菌器高压灭菌器（Getinge，型号：433 / 533HC-E）
蔡司SteREO发现。带有SCHOTT Ace™I光源的V8显微镜（ZEISS，型号：SteREO Discovery.V8）
Molecular Devices FlexStation 3多功能微孔板读数器（Molecular Devices，型号：FlexStation®3）
PYREX®格里芬烧杯（Corning，目录号：1000-PACK）
PYREX ®可重复使用的介质储存瓶（Fisher Scientific）

软件

SoftMax ® Pro 6软件（Molecular Devices）
Microsoft Office 2011 Excel（Microsoft Corporation，Redmond，USA）
GraphPad Prism 5软件包（GraphPad Software Inc.，San Diego，USA）

程序

线虫种群的增长和同步
1. 将具有所需遗传背景的动物的L4幼虫选择到新鲜接种E型的100mm或60mm NGM板上。（OP50）。
  使用至少两个100毫米或四个60毫米的NGM板，每个线虫株分别有5-10和20-30个动物。
2. 在20°C孵育动物3-4天，直到盘子含有大量的鸡蛋。
3. 将平板上的卵和线虫清洗到每个基因型的单个15-ml离心管中，每个线虫板使用约4ml M9。在装有回转篮转子的临床离心机中以6,180gxg旋下3分钟并抽出M9。将3-4毫升漂白剂溶液添加到含有蠕虫沉淀物的每个管中，并且每2分钟全速涡旋15秒，持续6分钟。加入M9填充每个试管并以6,180×g <1 / min的速度旋转1分钟。用M9重复清洗三次，并将蠕虫卵/屠体颗粒移至新鲜的半充满的15毫升M9管中。要同步，让动物在没有食物的情况下孵化，在20°C下孵育16-48小时（确保在实验中所有菌株同步时间相似）。
4. 由于缺乏食物，所有的动物都会在幼虫生长的L1阶段停滞。将这些试管以6,180×g 速度旋转1.5分钟，并将蠕虫放在单独的OP50种子NGM板上并保持在20℃（每100mm板大约6,000到10,000个蠕虫）。这些动物将在〜42小时达到L4幼虫阶段，此时它们应移至FUDR平板以防止它们产生后代（并避免后代的ROS产生的并发症）。这些灭菌的动物将在第二天进行分析（它们将是第66天时的第1天成年动物）用于测定。
  注意：我们观察到动物之间的表型在24小时和48小时之间没有差异。
蠕虫裂解物制备
1. 使用玻璃巴斯德移液管将第1天的成年动物用10ml M9洗脱到单独的15ml离心管中。在每个试管中加入另外5毫升M9，使蠕虫在试验台上重力沉降约10分钟（以减少OP50的沉降）。用OP50尽可能多地吸出M9而不损害蠕虫'颗粒'，保留大约0.5-1毫升的蠕虫泥浆。将更多的M9加入管中，使体积恢复到15毫升，重复三次以尽可能多地去除含有M9的OP50。
2. 将动物旋转6,180克x克吸气一分钟，然后抽吸以保留蠕虫颗粒。向每个管中加入15ml 1x PBS，混合以分散蠕虫沉淀物，然后以6,180gxg的速度旋转3分钟。吸出这个PBS，并重新悬浮在新鲜的100μLPBS的蠕虫颗粒。
3. 将PBS中的线虫移至1.5 ml离心管中，并将它们置于-80°C下15分钟以冻结动物。将试管置于一桶冰块中，每个试管超声10秒，在冰上连续运行，分光器上的功率设定为3。将超声处理过的混合物在4℃下以20000×g的速度向下旋转10分钟以从蠕虫胴体沉淀中分离蠕虫裂解物。尽可能从每个试管中保存尽可能多的蠕虫裂解液（〜100μl）。
4. 使用10μl的每种蠕虫裂解物样品，按照制造商的说明书，使用BCA蛋白质分析试剂盒（Pierce）测定蛋白质浓度。（平均而言，每100μl裂解物应该含有约100μg蛋白质。）
5. 确定每个样品25μg蛋白质所需的裂解液体积。将此体积加入一个新管中，加入适量的PBS，使所有样品达到50μl。
氯甲基-H 2 O-DCFDA染料的制备和荧光测量
1. 将每管50μg的氯甲基-H 2 DCFDA溶解在45μl的DMSO中。
2. 用300μlPBS进一步稀释得到250μM氯甲基-H 2 DCFDA。
3. 孵育含有25微克蛋白质或无蠕虫对照（PBS）的50μl裂解物与100μl250μM氯甲基-H 2 DCFDA的PBS溶液（一式三份），37℃4小时。反应混合物与裂解物和染料的总体积将为150μl。丢弃任何不用于避免冻融循环的染料溶液。
4. 使用Flex Station 3 Reader（Molecular Devices）在485nm的激发和535nm的发射下测量荧光强度。
5. 进行3个独立的生物学重复。
  注意：用于ROS测量的蠕虫裂解物不能冻结以供将来使用。

数据分析

使用Microsoft Excel，通过从样品中减去平均非蠕虫对照荧光强度来标准化样品的所有荧光强度值。
这些值可以进一步归一化为野生型的荧光强度。
然后将归一化为野生型的每种菌株的荧光强度输入GraphPad Prism，并使用单因素方差分析和Bonferroni事后检验进行分析。

笔记

每天检查线虫以确保它们没有挨饿的危险。如果平板上的细菌草坪看起来很薄，就需要通过采摘迅速将线虫移到新的OP50播种的NGM板上。
不应该使用饥饿的动物进行化验。
在通过重力分离沉淀线虫的同时，将管保持在光线下以确保线虫在吸气之前已经沉降下来。
在超声处理过程中，确保超声波探头浸没在PBS-蠕虫混合物中。
BCA蛋白试剂盒建议将虫体裂解物稀释1:10，不要这样做;使用未稀释的裂解物。我们发现蠕虫裂解物的蛋白质浓度往往很低，因此10倍稀释导致蛋白质浓度太低而不能通过BCA测定来测量。
我们使用以前使用过的FuDR浓度（Park，2009）。尽管在我们的分析中我们没有注意到线粒体功能缺陷，但应该指出的是FuDR可能影响线粒体。例如，据报道，FuDR处理可以延长复杂的I型气体-1突变体的寿命，但对野生型动物没有显示出强大的影响（van Raamsdonk和Hekimi，2011）。
有关 C的更多信息。线虫生长和维护，请参阅“维护 C”一章。线虫'可在 http://www.wormbook.org/chapters上找到/www_strainmaintain/strainmaintain.pdf。
请参阅Sarasija和Norman（2015）的代表性数据。
下图可以帮助读者计划这些实验（图1）。

图1.描绘检测执行的阶段和时间表的流程图

食谱

注意：有关其他信息，请参阅 2011，。

标准线虫生长培养基（NGM）平板
无菌解决方案
1. 液体循环高压灭菌（暴露45分钟），使其冷却至〜60°C，然后使用无菌技术并添加以下物质：
2. 每次添加后都要充分搅拌。所有添加完成后，倒入平板
3. 要制造液态NGM，请遵循相同的操作规程，但省略添加细菌琼脂（并且显然不需要倒入平板）。在LB培养基中在室温和种子培养基中过夜培养OP50
含有5-FU-2'-脱氧尿苷的NGM板材
遵照制定标准NGM板的方案。将适当的FUDR量（从下表中）添加到1 ml M9中，并用涡旋溶解
将此FUDR解决方案添加到最终的液态NGM中，轻轻旋转并倒入2毫米FUDR板中充分混合。 FUDR是一种嘧啶类似物，可抑制DNA合成，从而防止动物形成配子，有效地对它们进行杀菌
因此，用于播种含有FUDR的平板的OP50必须在37℃振荡培养过夜，然后离心浓缩10倍，并将100μl用于种植每个FUDR平板

NGM的无菌库存

1 M CaCl 2 2
在烧杯中（如果可能，无菌），请添加：
110.9克氯化钙2
dH 2 O至250毫升

彻底溶解并使用真空过滤进行消毒，贴标签和室温保存
1M MgSO 4
在烧杯中（如果可能，无菌），请添加：
120.3克MgSO 4。
dH 2 O至250毫升

彻底溶解并使用真空过滤进行消毒，贴标签和室温保存
1 M K 2 HPO 4
174.18克用dH <2：O>调至1升
1 M KH 2 PO 4 4
使用dH 2 O和加热至136.01 g使其升至1 L 1 M KPO 4 4 pH 6.0
测量132ml的1M K 2 HPO 4和868ml的1M KH 2 PO 4 4 />
在液体循环（暴露45分钟）下结合并高压灭菌在室温下储存

LB媒介

用NaOH将pH从〜6.9调节到7.5背景颜色：透明;框尺寸：边框;颜色：＃666666; font-family：Arial; font-size：13.33px; font-style：正常;字体变量：正常;字体重量：100;字母间距：正常;孤儿：2;文本对齐：对齐;文字修饰：无;文本缩进：0像素;文字变换：无; -webkit -text行程宽度：0像素;空白：正常;字间距：0像素;” /> 每瓶250毫升，液体循环高压灭菌（暴露15分钟）

M9缓冲液（1 L）（在室温下储存）

2瓶分装：每瓶500毫升。液体循环高压灭菌（暴露15分钟）

漂白剂溶液（在室温下储存）

10 N NaOH
20克NaOH
dH sub 2 O可达50 ml
在室温下储存
注意：

练习小心：这个反应是EXORHERMIC！
50毫升锥形管应该很好，但要确保盖子是紧的，保持周围冰块以冷却管以防止锥形破裂（由热膨胀）。

10倍PBS

来自Harlow和Lane的磷酸盐缓冲盐水，食谱要制作1 L：＆nbsp;

溶于800ml dH 2 O
用HCl调节pH至7.4
将体积加至1L并在液体循环中高压灭菌（暴露45分钟）

致谢

作者要感谢J. T. Laboy在订购和制备试剂方面的帮助，以及P. McKeown-Longo，Y. Tang，M. Barroso和他们的实验室成员的支持。一些线虫菌株由美国国立卫生研究院（NIH）研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助的Caenorhabditis遗传中心提供。阿尔茨海默病协会（NIRG-09-132122）和美国国立卫生研究院（GM088213）支持这项工作。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

Balaban，R. S.，Nemoto，S.和Finkel，T。（2005）。线粒体，氧化剂和衰老 120（ 4）：483-95。
他，楼（2011年）。常见的蠕虫介质和缓冲区 Bio-protocol Bio101：e55。< br />
Park，SK，Tedesco，PM和Johnson，TE（2009）。氧化应激和长寿 Caenorhabditis elegans 由SKN-1介导。老化细胞 8（3）：258-269。
Sarasija，S.和Norman，K. R.（2015）。早老素的γ分泌酶独立作用在钙稳态中影响线粒体功能和形态Caenorhabditis elegans 。 Genetics 201（4）：1453-1466。
Stiernagle，T.（2006）。线虫的维护。 WormBook （Ed。）。线虫研究社区：doi / 10.1895 / wormbook.1.101.1。
Van Raamsdonk，J. M.和Hekimi，S。（2011）。 FUdR会使线粒体突变型气体-1的寿命延长两倍。 Mech Aging Dev 132（10）：519-521。