材料和试剂

细胞培养瓶（康宁，目录号：3275）
20,200和1,000μl移液器吸头（Barrier Low-Retention tips，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：2149P-05-RT，2069-HR和2279）
24孔板
圆盖玻璃（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：12-545-80）
纸巾
15 ml锥形培养管（Corning，目录号：430052）
血清移液管（1,5,10,25,50 ml）（Corning，产品目录号：4012,4051,4482,4251,4501）
玻璃载玻片（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：12-550-123）
Coverslip（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：12-543C）
细胞系：HEK293-pcDNA3.1和HEK293-pcDNA3.1-Muc1
HEK293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）
pcDNA3.1（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：V79020）
注：pcDNA3.1-Muc1克隆由Dr. Erik P. Lillehoj < （Lillehoj et al。，2002）。
EAEC042菌株可从我们的实验室菌种集合中获得（Nataro等，1995）
pGFP载体（Takara Bio，Clontech，目录号：632370）
LB培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：10855001）
甘油（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：BP229-4）
Carbenicillin
DMEM-高葡萄糖（无酚红），用于培养EAEC（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：31053028）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：70011044）
用于培养HEK293细胞（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11965118）的Dulbecco's改良伊格尔培养基（DMEM）
经过认证的热灭活胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F4135）
青霉素 - 链霉素（10,000U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
G418（Sigma-Aldrich，目录号：G418-RO）
制造商：Roche Diagnostics，目录号：4727878001。
0.5M EDTA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9260G）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415-1L）
冰醋酸（Fisher Scientific，Fisher Chemicals，目录号：A38-500）
FITC小鼠抗人Muc1（CD227）（BD，BD Biosciences，目录号：559774）
Coverslip密封胶（Biotium，目录号：23005）
FM 4-64FX（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：F34653）
具有DAPI的ProLong TM Gold Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，产品目录号：P36935）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Dilactate）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：D3571）
Hank平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14175103）
福尔马林（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128-4L）

设备

10,20,200,1000μl移液器（Pipette Pack Set，Eppendorf，目录号：2231300006）
CO 2培养箱（NuAire，型号：NU-4750）
-80°C冷冻箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma Model 900）
旋转摇床（ATR，型号：AJ118）
层流罩（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：1300系列A2型号1375）
紫外可见分光光度计（GE Healthcare，Amersham Biosciences，型号：Ultrospec 2100 Pro）
液氮储存容器（Worthington，型号：LD35）
离心机（Eppendorf，型号：5430）
微量离心机（Fisher Scientific，型号：accuSpin TM Micro 17R）
落射荧光显微镜（奥林巴斯，型号：BX51）

程序

细菌细胞培养
1. 在含有100μg/ ml羧苄青霉素的LB琼脂平板上划出一连串EAEC菌株（预先用pGFP质粒转化并在-80℃保存在含20％甘油的LB培养基中），并在37℃下温育16-18 h。
2. 将3-5个EAEC菌落接种到5ml LB培养基中，并使用旋转摇动器在37℃下振荡（200rpm）孵育16-18小时。用新鲜的DMEM-高葡萄糖（无红色苯酚）从该培养物中进行1：100稀释以诱导AAF菌毛（例如100μl细菌培养物在9,900μlDMEM-HG中）的表达，并在37℃振荡（200rpm）孵育直至达到对数中期（OD 600 = 0.6）。
  注意：已知DMEM-HG上调AAF菌毛的表达。使用不含红色苯酚的DMEM-HG来促进肉眼和分光光度法监测该培养基中的EAEC生长。在DMEM-HG中生长时，EAEC需要约4小时才能达到OD 600 = 0.6。
3. 以5,000xg离心EAEC培养物10分钟，用10ml 1x PBS洗涤，并以1×10 8个细胞/ ml的浓度重新悬浮于新鲜的DMEM（用于生长HEK293细胞的DMEM）中。菌落形成单位（CFU）。我们先前已经确定OD 600 = 0.35对应于每毫升约1×10 8 EAEC CFU。
HEK293细胞培养
1. 用补充有10％FBS（Sigma-Aldrich）的DMEM（Gibco）在75或150cm 2培养瓶中培养用pcDNA3.1和pcDNA3.1-Muc1质粒转染的人胚胎肾细胞系HEK293（ATCC） Aldrich），青霉素 - 链霉素和200μg/ ml G418（Sigma-Aldrich）（以确保维持pCDNA3.1质粒衍生物）。
2. 为了传代和接种目的，当接近80-90％铺满时用10ml无菌PBS洗涤HEK293细胞，并使用PBS中的0.35mM EDTA分离，如下：每75cm2培养物加入3ml EDTA在37℃和5％CO 2下温育15分钟直到细胞已经圆化并从底部分离，用7ml新鲜培养基收集，计数细胞，在400下旋转细胞5分钟并将细胞重悬于新鲜培养基中达到所需的细胞浓度（2×10 6 / ml用于结合测定）。
免疫荧光检测HEK293-Muc1细胞上Muc1的表达
1. 将细胞分装到含有圆圈盖玻片的24孔板上。上下移动以确保细胞不会集中在培养皿的中心。将细胞培养至70-90％汇合。
2. 在Clark的溶液（90％甲醇; 10％冰醋酸）中固定细胞3小时
3. 用PBS中的2％BSA移除固定剂并封闭30分钟
4. 在室温下在黑暗中用FITC缀合的抗Muc1抗体（1：200稀释）在PBS 2％BSA中孵育2小时。
5. 用PBS清洗三次，每次5分钟。
6. 取出盖玻片，放在薄纸上，让它变干。盖玻片必须朝上。
7. 一旦盖玻片干透了，将DAPI防褪色液滴加到盖玻片上。
8. 将盖玻片安装在玻片上，使其与玻片直接接触。
9. 在盖玻片周围添加盖玻片密封胶，将其密封在玻片上。将样品保存在-20℃的黑暗中，直到使用荧光显微镜进行分析。
在HEK293细胞悬液中的EAEC结合测定
EAEC菌株可以与生物和非生物表面（如塑料表面）紧密结合。为了最小化对非生物表面的非特异性结合，细胞-EAEC结合测定在细胞悬浮液中进行。
如下用15ml锥形管中的细胞悬液进行结合测定：
1. 通过加入300μl5μg/ ml的FM 4-64FX（赛默飞世尔科技）和4'，6'-二脒基-2-苯基吲哚（2μM），将大约2×10 6个细胞悬浮于悬浮液中DAPI）进行核显影5分钟，然后与表达EAEC的GFP一起温育。
  注意：DAPI也可以在实验结束时添加，作为防褪色解决方案的一部分。在EAEC感染之前用FM 4-64FX染色HEK293细胞膜以避免细菌膜染色。如果愿意，可以跳过FM 4-64FX染色并继续用荧光细菌感染。
2. 通过向管中加入10ml HBSS并将细胞以250μgxg（〜1,500rpm）向下旋转5分钟来除去细胞上过量的FM 4-64FX染料。
3. 将表达或不表达Muc1的1×10 6 FM 4-64FX染色的HEK293细胞衍生物与约2×10 7个CFU的GFP-EAEC菌株混合至多重感染（ MOI）为1:20（细胞：细菌）的1ml新鲜DMEM培养基中。
  在37°C和5％CO 2下孵育细胞1小时。
4. 孵育1小时后，通过加入10ml HBSS缓冲液洗涤细胞三次并轻轻翻转管2-3次。将细胞以100μg/ g（〜1,000rpm）离心2分钟以使细胞沉淀，但使未结合的细菌沉淀最小化。重复HBSS洗涤两次。
  注：通过来回轻柔倒转管来进行HEK293-Muc1细胞的洗涤以避免高度糖基化的Muc1细胞外结构域脱落（并且脱离细菌），其不共价连接到其跨膜C端域名。
5. 使用一次性移液管或真空系统吸取上清液（注意不要打扰或抽吸管底部的细胞;大部分未结合的细菌会在稍后时间和较低的速度下沉降）。
6. 通过重悬于100μlPBS-5％福尔马林（例如5％[v:v]的50μlPBS + 50福尔马林）中来固定细胞。立即检查细胞或保存在4°C以后分析，最好在前48小时。
7. 用10μl细胞悬液通过用盖玻片延长细胞悬液来在载玻片上制备涂片。涂抹干燥约10分钟，然后涂抹一滴防褪色DAPI（赛默飞世尔科技）。
8. 使用配备有蓝色（365/10激发/ 420LP发射），绿色（480/20激发/ 510LP发射）和红色（535/30激发/ 580LP发射）的波长滤光片的荧光显微镜分析载玻片。你会看到DNA染成蓝色，细胞膜染成红色，细菌呈荧光绿色。图1说明了使用原型EAEC 042菌株及其同基因菌毛变种（042aafA）进行结合分析的代表性实例。
  
  图1.EAEC与HEK293-Muc1细胞的结合A.在用pcDNA3（HEK293）或pcDNA3-MUC1（HEK293-Muc1）转染的HEK293细胞中用FITC缀合物评估Muc1糖蛋白的产生通过荧光显微镜检查Muc1的单克隆抗体（100x）。 B.将HEK293和HEK293-Muc1细胞悬浮于EAEC菌株042或其等基因菌毛突变体（042.eafA）的悬浮液中，各自表达GFP报道分子并通过荧光显微镜术（40x）分析。 EAEC042呈绿色，细胞膜用FM 4-64FX染成红色，DNA用DAPI染成蓝色。 C.通过显微镜计数粘附于细胞的细菌，并通过比较配对试验中的平均值和显着性差异来分析数据。 0.05（*）。条代表至少三次独立实验的方法，误差线表示标准偏差。
数据分析

至少从三次独立实验中，通过计数HEK293细胞并将细菌结合到20个随机化场中的细胞（每个盖玻片），在显微镜下（40x）枚举粘附于HEK293衍生物的EAEC衍生物。结果表示为每100个细胞的细菌数量。数据通过比较配对 t - 检验中的平均值，当 p

致谢

该协议部分在我们以前发表的研究中报道（Boll et al。，2017）。这项工作得到了部门资金支持FR-P（弗吉尼亚大学儿科）的支持。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考
1. Berry，AA，Yang，Y.，Pakharukova，N.，Garnett，JA，Lee，WC，Cota，E.，Marchant，J.，Roy，S.，Tuittila，M.，Liu，B.，Inman，KG ，Ruiz-Perez，F.，Mandomando，I.，Nataro，JP，Zavialov，AV和Matthews，S。（2014）。通过肠道聚集性大肠杆菌聚集性附着菌毛对宿主识别的结构洞察力。 PLoS Pathog 10（9）：e1004404。
2. Boll，E.J.，Ayala-Lujan，J.，Szabady，R.L.，Louissaint，C.，Smith，R.Z.，Krogfelt，K.A.，Nataro，J.P.，Ruiz-Perez，F.and McCormick，B.A。（2017）。 Enteroaggregative 大肠杆菌粘附菌毛通过与上皮MUC1相互作用驱动炎症细胞募集。 MBio 8（3）。
3. Corfield，A. P.，Carroll，D.，Myerscough，N.和Probert，C. S.（2001）。健康和疾病胃肠道中的粘蛋白 Front Biosci 6：D1321-1357。
4. Czeczulin，J. R.，Balepur，S.，Hicks，S.，Phillips，A.，Hall，R.，Kothary，M. H.，Navarro-Garcia，F.和Nataro，J. P.（1997）。聚集性依从性fimbria II，介导肠集聚性大肠埃希氏菌聚集性依从性的第二种菌毛抗原，。感染免疫 65（10）：4135-4145。
5. Farfan，M.J.，Inman，K.G。和Nataro，J.P。（2008）。来自肠集聚性大肠杆菌的AAF / II菌毛的主要菌毛亚单位介导与细胞外基质蛋白的结合。感染免疫 76（10）：4378-4384。
6. Harrington，S.M。，Dudley，E.G。和Nataro，J.P。（2006）。肠集聚性大肠杆菌感染的发病机制 FEMS Microbiol Lett 254（1）：12-18。
7. Harrington，S.M.，Strauman，M.C.，Abe，C.M。和Nataro，J.P。（2005）。聚集性粘附菌毛有助于感染肠集聚性大肠埃希菌的上皮细胞的炎症反应，。 Cell Microbiol 7（11）：1565-1578。
8. Izquierdo，M.，Navarro-Garcia，F.，Nava-Acosta，R.，Nataro，J.P.，Ruiz-Perez，F.和Farfan，M.J。（2014）。鉴定细菌表面暴露的蛋白参与菌毛介导的肠聚集性大肠杆菌粘附。感染免疫 82（4）：1719-1724。
9. Jonsson，R.，Struve，C.，Boisen，N.，Mateiu，R.V.，Santiago，A.E。，Jenssen，H.，Nataro，J.P。和Krogfelt，K.A。（2015）。肠道聚集性大肠杆菌的新聚集性依从性fimbria变体。感染免疫 83（4）：1396-1405。
10. Lillehoj，E.P.，Kim，B.T。和Kim，K.C。（2002）。鉴定绿脓假单胞菌鞭毛蛋白作为Muc1粘蛋白的粘附素。 a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282（4）：L751-756。
11. Nataro，J.P.，Deng，Y.，Cookson，S.，Cravioto，A.，Savarino，S.J.，Guers，L.D.，Levine，M.M。和Tacket，C.O。（1995）。志愿者表现出肠集聚性大肠杆菌毒力的异质性。 J Infect Dis 171（2）：465-468。
12. Nath，S.和Mukherjee，P。（2014）。 MUC1：一种在癌症进展中具有关键作用的多方面癌蛋白。趋势Mol Med 20（6）：332-342。
13. Rasko，DA，Webster，DR，Sahl，JW，Bashir，A.，Boisen，N.，Scheutz，F.，Paxinos，EE，Sebra，R.，Chin，CS，Iliopoulos，D.，Klammer， Peluso，P.，Lee，L.，Kislyuk，AO，Bullard，J.，Kasarskis，A.，Wang，S.，Eid，J.，Rank，D.，Redman，JC，Steyert，SR，Frimodt-Moller ，J.，Struve，C.，Petersen，AM，Krogfelt，KA，Nataro，JP，Schadt，EE和Waldor，MK（2011）。 E的起源。大肠杆菌菌株导致德国溶血性尿毒症综合征的暴发。 N Engl J Med 365（8）：709-717。
14. Yanez，D.，Izquierdo，M.，Ruiz-Perez，F.，Nataro，J.P.，Giron，J.A.，Vidal，R.M。和Farfan，M.J。（2016）。纤连蛋白在肠凝聚大肠杆菌诱导的粘附和炎症反应中的作用在上皮细胞上。